Phân loại giảo cổ lam Gynostemma Pentaphyllum sử dụng phương pháp mã vạch DNA trong luận văn thạc sĩ

• Tác giả: Nghiêm Thị Suốt
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân loại giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng phương pháp mã vạch DNA
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Phân bố và phân loại của Giảo cổ lam
• 2.1.1. Phân bố của Giảo cổ lam
• 2.1.2. Phân loại
• 2.1.3. Phân loại thảo dược trong họ Curcubitaceae
• 2.1.4. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume
• 2.1.4.1. Gynostemma laxum (Wall.)
• 2.1.4.2. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
• 2.1.4.3. Gynostemma longipes
• 2.1.4.4. Giảo cổ lam 9 lá
• 2.2. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Giảo cổ lam trong y học cổ truyền
• 2.2.1. Thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam
• 2.2.2. Tác dụng và giá trị làm thuốc của cây Giảo cổ lam
• 2.2.2.1. Các thử nghiệm về Giảo cổ lam trên chuột
• 2.3. Tổng quan về mã vạch DNA (DNA barcode)
• 2.3.1. Một số mã vạch DNA được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu
• 2.3.2. Ứng dụng mã vạch DNA trên thực vật
• 2.3.3. Trình tự DNA được lựa chọn làm mã vạch ở thực vật
• 2.3.4. Lựa chọn và sử dụng vùng gen DNA mã vạch cho nghiên cứu
• 2.3.5. Tình hình nghiên cứu về mã vạch DNA trong nước và ngoài nước
• 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá
• 3.4.2. Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số trên gel Agarose
• 3.4.3. Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen trong nghiên cứu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân tích đánh giá hình thái mẫu nghi ngờ với Giảo cổ lam
• 4.2. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá
• 4.3. Kết quả tối ưu hoá phản ứng PCR
• 4.4. Kết quả khuếch đại gen rbcLa
• 4.5. Kết quả PCR gen ITS2
• 4.6. Kết quả giải trình tự các gen nghiên cứu
• 4.7. Phân tích chất lượng kết quả giải trình tự
• 4.8. Kết quả hiệu chỉnh các điểm nghi ngờ
• 4.9. Phân tích kết quả giải trình tự
• 4.10. Phân tích sự đa hình về trình tự ADN trên vùng gen rbcLa
• 4.11. Phân loại Giảo cổ lam với cây dễ bị nhầm lẫn là Giảo cổ lam 5 thùy
• 4.12. Phân tích kết quả giải trình tự vùng gen ITS2
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 1. Tài liệu tiếng việt
• 2. Tài liệu tiếng nước ngoài
• 3. Tài liệu từ Internet

I. Giới thiệu

Luận văn 'Phân loại giảo cổ lam Gynostemma Pentaphyllum bằng mã vạch DNA' tập trung vào việc ứng dụng công nghệ mã vạch DNA để phân loại chính xác loài Gynostemma Pentaphyllum, một loại dược liệu quý. Giảo cổ lam được biết đến với các đặc tính dược lý quan trọng như giảm cholesterol, ức chế khối u, và tăng cường hệ miễn dịch. Tuy nhiên, việc phân loại loài này dựa trên đặc điểm hình thái thường gặp khó khăn do sự tương đồng với các loài khác. Mã vạch DNA được đề xuất như một giải pháp hiệu quả để xác định loài chính xác, đặc biệt trong bối cảnh nguồn dược liệu tự nhiên ngày càng khan hiếm.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của luận văn là phân loại các loài Giảo cổ lam bằng phương pháp mã vạch DNA, đồng thời xây dựng thư viện hệ gen để hỗ trợ việc định danh loài trong tương lai. Nghiên cứu cũng nhằm giải quyết vấn đề nhầm lẫn giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự, đặc biệt là các loài có số lá chét khác nhau (3 lá, 5 lá, 7 lá, 9 lá).

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu có ý nghĩa khoa học lớn khi mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào phân loại và định danh loài. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu sẽ góp phần xây dựng phương pháp phân biệt nhanh chóng và chính xác các loài sinh vật, đặc biệt là các loài dược liệu quý như Giảo cổ lam.

II. Tổng quan tài liệu

Phần tổng quan tài liệu cung cấp cái nhìn toàn diện về Giảo cổ lam, từ phân bố, đặc điểm thực vật đến thành phần hóa học và giá trị dược liệu. Giảo cổ lam thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao tại châu Á, bao gồm Việt Nam, Trung Quốc, và Nhật Bản. Loài này được biết đến với hàm lượng saponin cao, có tác dụng tương tự như nhân sâm. Ngoài ra, Giảo cổ lam còn chứa các hợp chất flavonoid, carotenoid, và các nguyên tố vi lượng có lợi cho sức khỏe.

2.1. Phân bố và phân loại

Giảo cổ lam được tìm thấy ở độ cao từ 200 đến 2000 mét, trong các khu rừng thưa và ẩm. Tại Việt Nam, loài này được phát hiện ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, và Cao Bằng. Phân loại thực vật của Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, họ Bầu bí, với các loài phổ biến như Gynostemma pentaphyllum (5 lá), Gynostemma laxum (3 lá), và Gynostemma longipes (7 lá).

2.2. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu

Thành phần hóa học chính của Giảo cổ lam bao gồm saponin, flavonoid, và các carotenoid. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin trong Giảo cổ lam có tác dụng giảm cholesterol, ức chế khối u, và tăng cường hệ miễn dịch. Ngoài ra, loài này còn được sử dụng trong điều trị các bệnh như viêm phế quản, loét dạ dày, và tiểu đường.

III. Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân loại Giảo cổ lam. Các bước nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu, tách chiết DNA, khuếch đại gen bằng PCR, và giải trình tự gen. Các vùng gen được lựa chọn làm mã vạch DNA bao gồm rbcLa và ITS2, hai vùng gen phổ biến trong nghiên cứu phân loại thực vật. Kết quả giải trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định loài chính xác.

3.1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA

Mẫu Giảo cổ lam được thu thập từ các vùng núi cao tại Việt Nam. Quy trình tách chiết DNA được thực hiện bằng phương pháp CTAB, đảm bảo thu được DNA tổng số chất lượng cao. DNA sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose để đảm bảo độ tinh khiết.

3.2. Khuếch đại và giải trình tự gen

Các vùng gen rbcLa và ITS2 được khuếch đại bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định loài. Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh và phân tích để đảm bảo độ chính xác.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp mã vạch DNA có hiệu quả cao trong việc phân loại Giảo cổ lam. Các vùng gen rbcLa và ITS2 đã giúp phân biệt rõ ràng giữa các loài Giảo cổ lam với các loài có hình thái tương tự. Nghiên cứu cũng xác định được sự đa dạng di truyền trong các mẫu Giảo cổ lam thu thập tại Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu này.

4.1. Phân tích kết quả giải trình tự

Kết quả giải trình tự gen rbcLa và ITS2 cho thấy sự tương đồng cao với các trình tự đã công bố trên NCBI, xác nhận chính xác loài Gynostemma pentaphyllum. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện sự đa dạng di truyền trong các mẫu Giảo cổ lam thu thập tại Việt Nam, đặc biệt là sự khác biệt giữa các mẫu có số lá chét khác nhau.

4.2. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu Giảo cổ lam. Phương pháp mã vạch DNA có thể được áp dụng rộng rãi trong việc định danh và phân loại các loài dược liệu khác, góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng dược liệu trong y học cổ truyền và hiện đại.

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với gần 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài thực vật và nấm được ghi nhận có công dụng làm thuốc. Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) là một loại cây thảo dược quý thuộc họ Bầu bí, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng dược lý như giảm cholesterol, chống viêm, hỗ trợ điều trị tiểu đường và tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, việc phân biệt chính xác các loài Giảo cổ lam và các loài thực vật có hình thái tương tự là một thách thức lớn do đặc điểm hình thái dễ nhầm lẫn.

Mục tiêu nghiên cứu là phân loại các loài Giảo cổ lam bằng phương pháp mã vạch DNA, cụ thể là giải trình tự và xây dựng thư viện hệ gen cho các loài này. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gen và di truyền, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên trong khoảng thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 6/2015. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao độ chính xác trong nhận diện loài mà còn mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong phân loại và bảo tồn nguồn gen dược liệu quý giá này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết mã vạch DNA (DNA Barcode) được giới thiệu lần đầu năm 2003, sử dụng đoạn trình tự DNA ngắn đặc trưng để nhận diện loài. Ở thực vật, các vùng gen tiêu chuẩn như rbcL (tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase) và ITS2 (vùng nội bộ transcribed spacer 2) được lựa chọn do tính phổ biến, khả năng khuếch đại cao và độ phân biệt loài tốt. Mã vạch DNA giúp giải quyết các khó khăn trong phân loại dựa trên hình thái, đặc biệt với các mẫu vật chưa phát triển đầy đủ hoặc có đặc điểm tương tự nhau.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Mã vạch DNA: đoạn DNA ngắn dùng để nhận diện loài.
• Gen rbcL: vùng gen lục lạp phổ biến trong phân loại thực vật.
• Gen ITS2: vùng gen nhân có độ đa hình cao, giúp phân biệt các loài gần nhau.
• PCR (Polymerase Chain Reaction): kỹ thuật khuếch đại DNA để thu nhận đủ lượng mẫu cho giải trình tự.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm các mẫu lá Giảo cổ lam thu thập tại các địa điểm như xóm Kim Sơn – Thần Sa – Võ Nhai – Thái Nguyên, xóm Nà Ít – Thông Huề – Trùng Khánh – Cao Bằng và Viện Dược liệu Trung ương. Tổng cộng có 7 mẫu được nghiên cứu, bao gồm các loại Giảo cổ lam 3 lá, 5 lá, 7 lá, 9 lá và mẫu nghi ngờ.

Phương pháp phân tích gồm:

• Tách chiết DNA từ mẫu lá theo phương pháp CTAB cải tiến, tối ưu hóa các bước nghiền mẫu, ủ mẫu, ly tâm và kết tủa DNA nhằm thu được DNA có chất lượng cao với tỉ số OD260/OD280 dao động từ 1,82 đến 1,96 và nồng độ DNA từ 140 đến 1886 ng/µl.
• Khuếch đại gen rbcLa và ITS2 bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, tối ưu hóa chu trình nhiệt và bổ sung DMSO để tăng hiệu quả khuếch đại.
• Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, xác định kích thước sản phẩm PCR khoảng 634 bp cho rbcLa và 534 bp cho ITS2.
• Giải trình tự DNA tại các phòng thí nghiệm chuyên nghiệp, đánh giá chất lượng trình tự dựa trên giá trị Quality Value (QV).
• Phân tích và so sánh trình tự DNA với dữ liệu trên ngân hàng gen để phân loại và xác định các loài Giảo cổ lam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA: Quy trình tách chiết DNA cải tiến với việc tăng lượng CTAB, bổ sung β-mercaptoethanol, tăng thời gian ủ mẫu ở 65°C và sử dụng isopropanol cho kết tủa DNA đã thu được DNA chất lượng cao, thể hiện qua băng điện di rõ nét và tỉ số OD260/OD280 đạt từ 1,82 đến 1,96, nồng độ DNA dao động từ 140 đến 1886 ng/µl.

2. Khuếch đại gen rbcLa thành công trên tất cả 7 mẫu: Sản phẩm PCR có kích thước đúng khoảng 634 bp, băng điện di rõ ràng, chứng tỏ hiệu quả cao của cặp mồi và quy trình PCR tối ưu.

3. Khuếch đại gen ITS2 thành công trên 6/7 mẫu: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 534 bp, tuy nhiên mẫu nghi ngờ MS7 không thu được sản phẩm, cho thấy sự khác biệt về trình tự hoặc chất lượng DNA mẫu.

4. Chất lượng giải trình tự gen rbcLa tốt hơn ITS2: Các trình tự gen rbcLa có tín hiệu rõ nét, ít nhiễu, chiều dài khoảng 594 bp, trong khi ITS2 có chất lượng kém hơn với một số tín hiệu nhiễu, nhưng vẫn đủ để phân tích. Số mẫu giải trình tự thành công là 7 cho rbcLa và 3 cho ITS2.

Thảo luận kết quả

Việc tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA đã giải quyết được khó khăn trong thu nhận DNA chất lượng cao từ mẫu lá Giảo cổ lam, điều này rất quan trọng vì DNA chất lượng thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả PCR và giải trình tự. Kết quả khuếch đại gen rbcLa đồng nhất trên tất cả các mẫu cho thấy đây là vùng gen phù hợp làm mã vạch DNA cho Giảo cổ lam, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về mã vạch thực vật.

Sự khác biệt trong khả năng khuếch đại gen ITS2 có thể do đặc điểm biến đổi cao hơn của vùng gen này hoặc chất lượng DNA mẫu không đồng đều. Chất lượng giải trình tự gen rbcLa vượt trội hơn ITS2 cũng phù hợp với đặc tính gen rbcLa là vùng bảo tồn cao, dễ giải trình tự hơn.

So sánh trình tự với dữ liệu trên ngân hàng gen giúp phân biệt rõ ràng các loài Giảo cổ lam với các loài thực vật có hình thái tương tự, góp phần giảm thiểu nhầm lẫn trong nhận diện và thương mại hóa dược liệu. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh trình tự hoặc bảng phân loại chi tiết các mẫu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình tách chiết DNA tối ưu cho các nghiên cứu phân loại dược liệu: Đề xuất sử dụng quy trình đã hiệu chỉnh với CTAB tăng liều, β-mercaptoethanol và isopropanol để đảm bảo thu nhận DNA chất lượng cao, phục vụ cho các nghiên cứu mã vạch DNA trong vòng 6 tháng tới, do các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực hiện.

2. Sử dụng gen rbcLa làm mã vạch DNA chính thức cho phân loại Giảo cổ lam: Khuyến nghị áp dụng gen rbcLa trong các dự án phân loại và kiểm định chất lượng dược liệu Giảo cổ lam nhằm tăng độ chính xác và hiệu quả nhận diện loài trong vòng 1 năm, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu thực hiện.

3. Phát triển thư viện trình tự DNA cho các loài Giảo cổ lam tại Việt Nam: Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gen rbcLa và ITS2 cho các mẫu Giảo cổ lam thu thập rộng rãi trên toàn quốc, hoàn thành trong 2 năm, nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn và thương mại dược liệu.

4. Tăng cường đào tạo và phổ biến kỹ thuật mã vạch DNA cho cán bộ nghiên cứu và doanh nghiệp: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật PCR, giải trình tự và phân tích dữ liệu mã vạch DNA trong 12 tháng tới, nhằm nâng cao năng lực ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành dược liệu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và phân loại học thực vật: Luận văn cung cấp phương pháp và dữ liệu thực nghiệm chi tiết về ứng dụng mã vạch DNA trong phân loại loài, hỗ trợ nghiên cứu đa dạng sinh học và bảo tồn nguồn gen.

2. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh dược liệu: Thông tin về phân loại chính xác các loài Giảo cổ lam giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm, tránh nhầm lẫn nguyên liệu, nâng cao uy tín và giá trị thương mại.

3. Cơ quan quản lý và kiểm định chất lượng dược liệu: Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn nhận diện và kiểm tra nguồn gốc dược liệu, góp phần quản lý thị trường hiệu quả.

4. Sinh viên và giảng viên ngành công nghệ sinh học, dược học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật tách chiết DNA, PCR, giải trình tự và ứng dụng mã vạch DNA trong thực tế, hỗ trợ học tập và nghiên cứu chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Mã vạch DNA là gì và tại sao lại quan trọng trong phân loại thực vật?
   Mã vạch DNA là đoạn trình tự DNA ngắn đặc trưng giúp nhận diện chính xác loài. Nó quan trọng vì giúp phân biệt các loài có hình thái tương tự hoặc mẫu vật không hoàn chỉnh, nâng cao độ chính xác trong phân loại và bảo tồn.

2. Tại sao chọn gen rbcLa và ITS2 làm mã vạch DNA cho Giảo cổ lam?
   Gen rbcLa có tính bảo tồn cao, dễ khuếch đại và giải trình tự, phù hợp cho nhận diện loài. ITS2 có độ đa hình cao giúp phân biệt các loài gần nhau. Kết hợp hai gen này tăng hiệu quả phân loại.

3. Quy trình tách chiết DNA có điểm gì đặc biệt trong nghiên cứu này?
   Quy trình được tối ưu với tăng lượng CTAB, bổ sung β-mercaptoethanol, sử dụng isopropanol và tăng thời gian ủ mẫu giúp thu được DNA chất lượng cao, phù hợp với mẫu lá Giảo cổ lam có nhiều hợp chất gây ức chế PCR.

4. Làm thế nào để đánh giá chất lượng DNA và sản phẩm PCR?
   Chất lượng DNA được đánh giá qua tỉ số OD260/OD280 (1,8-2,0 là tốt) và điện di trên gel agarose. Sản phẩm PCR được kiểm tra kích thước trên gel agarose so với thang chuẩn ladder để xác định đúng đoạn gen cần khuếch đại.

5. Ứng dụng thực tiễn của mã vạch DNA trong ngành dược liệu là gì?
   Mã vạch DNA giúp nhận diện chính xác nguồn gốc dược liệu, tránh nhầm lẫn nguyên liệu, kiểm soát chất lượng sản phẩm, hỗ trợ bảo tồn nguồn gen quý và phát triển thị trường dược liệu an toàn, hiệu quả.

Kết luận

• Nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá Giảo cổ lam, thu được DNA chất lượng cao với tỉ số OD260/OD280 từ 1,82 đến 1,96 và nồng độ DNA lên đến 1886 ng/µl.
• Gen rbcLa được khuếch đại thành công trên tất cả các mẫu, chứng minh tính phù hợp làm mã vạch DNA chính cho phân loại Giảo cổ lam.
• Gen ITS2 cũng được khuếch đại và giải trình tự nhưng có giới hạn về chất lượng và khả năng khuếch đại trên một số mẫu.
• Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự DNA giúp phân biệt rõ ràng các loài Giảo cổ lam với các loài thực vật tương tự, góp phần nâng cao độ chính xác trong nhận diện và bảo vệ nguồn dược liệu quý.
• Đề xuất áp dụng gen rbcLa làm mã vạch DNA chính thức, xây dựng thư viện trình tự và đào tạo kỹ thuật nhằm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành dược liệu Việt Nam.

Tiếp theo, cần triển khai xây dựng thư viện trình tự gen rbcLa cho các loài Giảo cổ lam trên phạm vi rộng hơn và phổ biến kỹ thuật mã vạch DNA trong cộng đồng nghiên cứu và doanh nghiệp. Để biết thêm chi tiết về phương pháp và kết quả, quý độc giả và nhà nghiên cứu có thể liên hệ với Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên để được hỗ trợ và hợp tác nghiên cứu.