Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á có sự phong phú về đa dạng sinh học. Theo thống kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” (Tổ chức Bảo tồn thiên nhiên Thế giới – IUCN), tại Việt Nam hiện có gần 12.000 loài thực vật bậc cao, có mạch thuộc hơn 2. Mặt khác theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu [7] ở nước ta có khoảng 3.948 loài thực vật và nấm lớn được ghi nhận có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3.948 loài cây thuốc thì có tới 90% là cây mọc tự nhiên, tập trung ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10% là các cây thuốc được trồng.
Những số liệu trên cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất đa dạng và có tiềm năng lớn, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và phổ biến đến ngày nay, bên cạnh đó, nó cũng góp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế - xã hội. Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) là loại cây thảo dược có thân mảnh, leo nhờ tua quấn ở nách lá, thuộc họ nhà Bầu bí, cây đực và cây cái riêng biệt, đây là loài được ghi nhận với lá kép chân vịt, có năm lá chét [11]. Nó được coi là loại dược liệu quý được ghi trong sách cổ “Nông chính toàn thư hạch chú” quyển hạ năm 1639. Từ xa xưa, Giảo cổ lam được sử dụng cho vua chúa để tăng sức khoẻ, kéo dài tuổi thọ và làm đẹp.
Năm 1997 Giáo sư Phạm Thanh Kỳ (Đại học Dược Hà Nội) đã phát hiện cây Giảo cổ lam trên núi Phan – xi - păng (Lào Cai). Giảo cổ lam được biết đến như một loại thảo dược chứ không phải một loại thực phẩm, nó được sử dụng cho điều trị viêm, ho và viêm phế quản mãn tính [20, 25].Giảo cổ lam có chứa hợp chất Gypenosides và saponin [24, 28], nó có vai trò làm giảm cholesterol trong máu, ức chế sự tăng trưởng của các n 2 tế bào khối u, chữa bệnh loét dạ dày tá tràng, làm giảm viêm và giảm đau [25]. Ngoài ra, Giảo cổ lam cũng được coi là loại thuốc bổ để cải thiện hệ thống miễn dịch. Cho đến nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái bên ngoài hoặc đặc tính sinh lý, sinh hóa bên trong dựa vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn [8].
Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài hoặc mẫu sinh vật đã bị chết khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác, đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau. Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph Ontario đã lần đầu tiên đưa ra khái niệm mã vạch DNA (DNA Barcode), nhằm giúp nhận diện các mẫu vật [17]. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau [13].
Việc ứng dụng phương pháp mã vạch DNA đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA có thể dễ dàng được thu nhận từ một lượng mẫu nhỏ [21]. Hơn nữa, mã vạch DNA còn giúp phân tích quá trình tiến hóa sinh học của loài trong tự nhiên. Như vậy mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn DNA chuẩn, ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc loài nào. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật (ii) Trình tự có tính ðặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao (iii) Có khả năng phân biệt được đồng thời nhiều loài.
Việc ứng dụng phương pháp mã vạch DNA trong định danh loài đã và đang được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới song ở Việt Nam nó vẫn là n 3 một lĩnh vực tương đối mới đầy triển vọng, mở ra một hướng đi mới cho các nhà nghiên cứu trong nước. Trong tự nhiên, ở nước ta có nhiều loài cây có đặc điểm hình thái tương tự nhưng với số lá chét là 3 lá, 7 lá và 9 lá đang được nhân dân thu hái và bán cùng với tên gọi là Giảo cổ lam [1]. Trước nhu cầu thực tiễn đó tôi thực hiện nghiên cứu đề tài“Phân loại Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) bằng phƣơng pháp mã vạch DNA”. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài Phân loại các loài Giảo cổ lam bằng phương pháp mã vạch DNA.
Giải trình tự và tạo thư viện hệ gen của các loài Giảo cổ lam nghiên cứu. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài mở ra triển vọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào việc phân loại, định danh loài. -Ý nghĩa trong thực tiễn: Là cơ sở để góp phần xây dựng phương pháp phân biệt nhanh chóng và chính xác các loài sinh vật. n 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Phân bố và phân loại của Giảo cổ lam 2. Phân bố của Giảo cổ lam Trên thế giới, Giảo cổ lam được phát hiện ở độ cao 200 – 2000 m, trong các khu rừng thưa và ẩm tại Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Triều Tiên và một số nước châu Á khác [11]. Trong đợt nghiên cứu, khảo sát nguồn dược liệu ở các vùng núi cao phía Bắc, cán bộ thuộc Trung tâm nghiên cứu cây thuốc Tuệ Linh cùng với GS-TS Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện một quần thể cây Giảo cổ lam mọc hoang dại với trữ lượng lớn tại vùng núi cao thuộc huyện Mèo Vạc – Hà Giang và huyện Bảo Lạc – Cao Bằng. Phân loại Kết quả giám định loài Giảo cổ lam nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau: - Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực) - Giới: Plantae (Thực vật) - Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh) - Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín) - Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm) - Phân lớp: Asteriades (Sổ) - Bộ: Cucurbitaales (Bầu Bí) - Họ: Cucurbitaceae (Bầu Bí) - Chi: Gynostemma Blume 2.
Phân loại thảo dược trong họ Curcubitaceae Họ Bầu bí (Curcubitaceae) có tổng số gần 90 chi, trên dưới 700 loài, trong đó có khoảng 50 loài có tác dụng chữa bệnh được sử dụng trong Đông n 5 y. Các loài thực vật trong họ Bầu bí có một số đặc điểm chính như thân có tua cuốn, phần lớn lá có chia thùy, có lông tuyến. Hoa thật, cánh hoa màu vàng hay trắng. Quả dạng bầu bí [7].
Ở Phương Đông, một số nơi đã sử dụng các loài trong họ Bầu bí để chữa bệnh, nhờ hoạt chất Curcubitacin có trong thân, lá. Một số minh chứng cho thấy Curcubitacin là hoạt chất chính có tác dụng ức chế khối u thận, khối u não và các khối u ác tính. Ở khu vực Thái Bình Dương, quả của một số loài trong họ Curcubitaceae được dùng làm thuốc lợi tiểu, hạ sốt, giảm viêm nhiễm, chống độc, trị bệnh vàng da, tiểu đường và sử dụng làm thuốc an thần [7]. * Một số loài có tác dụng chữa bệnh trong họ Curcubitaceae: - Gymnopentalum cochichinensis (Lour.) Cây cứt quạ + Đặc điểm: Gymnopentalum cochichinensis (Lour.) có dạng cỏ bò, thân mảnh, có tua cuốn.
Lá có phiến nhám, có tuyến và lông thưa. Hoa có dạng đơn tính. Hoa đực mọc thành chùm, có cánh trắng, kích thước khoảng 3 cm, các bao phấn dính nhau. Quả hình bầu dục, khi chín có màu đỏ, dài 3 – 5 cm, mặt quả có gân.
Hạt màu nâu, dài 7 – 8 mm [7,11]. + Phân bố: Gymnopentalum cochichinensis (Lour.) có ở Lào, Campuchia, Malaysia, Trung Quốc… Ở nước ta, cây mọc ở các khu rừng tái sinh, các khu đất hoang từ Bắc vào Nam. + Tác dụng chữa bệnh: Ở Lào, Campuchia, Gymnopentalum cochichinensis (Lour.) được sử dụng làm thuốc cho phụ nữ sau khi sinh. Ở Malaysia, nước sắc của lá dùng để chống ngộ độc của các loại quả.
Nước ép từ lá cây được sử dụng để làm giảm viêm mắt. Ở Trung Quốc, Gymnopentalum cochichinensis (Lour.) được gọi là Jin gua. Tuy nhiên các hoạt chất trong chi Gymnopentalum vẫn chưa được tìm hiểu [7]. Cây đài hái, sén.
+ Đặc điểm: Hodgsonia macrocarpa (Bl) là loài dây leo, thân to, có tua n 6 cuốn. Lá đơn nguyên, kích thước18 – 25 cm, không có lông, cuống lá dài 5 – 8 cm. Hoa đơn tính, hoa đực mọc thành chùm, tràng hoa hình ống. Quả to, thịt quả nạc, trắng.
+ Phân bố: Trên Thế giới, cây mọc ở một số nước trong khu vực Đông Nam Á. Nước ta, cây mọc trong các khu rừng thưa từ Vĩnh Phú tới Đồng Nai [7, 11]. + Tác dụng: Ở Indonexia, dầu ép từ hạt dùng để đốt, xông và dịch ép từ thân trị bệnh lở mũi. Ở Malaysia, Hodgsonia macromarpa (Bl) được dùng để chữa bệnh lở mũi.
Dầu chiết từ hạt dùng để trừ muỗi. Những người trong bộ tộc Mlay uống nước sắc từ lá và dùng lá cây đốt xông mũi. Nước sắc từ lá cây còn được uống để hạ sốt [7]. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume Chi Gynostemma Blume chủ yếu là các cây thảo, thân leo, nhẵn hoặc có lông mịn.
Lá có cuống với phiến chân vịt gồm 3 – 5 lá chét, ít khi có 1 lá chét. Lá chét hình xoan – ngọn giáo. Các đốt thân có tua cuốn. Cụm hoa đực dài, gồm nhiều hoa nhỏ hoa hình sao, màu trắng hay lục nhạt, cuống hoa mang lá bắc ở gốc, đế hoa dẹt, có 5 lá đài nhỏ, hoa 5 cánh, hình mũi dùi – ngọn giáo, nhọn ở đỉnh.
Bộ nhị gồm 5 chỉ nhị, bao phấn đều, dính với nhau. Cụm hoa cái giống cụm hoa đực nhưng dài hơn, hoa cái có bầu 2 - 3 ô, hình cầu, mỗi ô có 2 – 3 noãn treo đầu nhụy xẻ 3. Quả mọng hình cầu, không mở, chứa 2 – 3 hạt. Hạt hình trứng, hơi dẹp.
Ở Châu Á có khoảng 4 – 5 loài, nước ta có một số loài: 2. Gynostemma laxum (Wall.) Gynostemma laxum(Wall.) (Giảo cổ lam 3 lá)Là cây thân thảo mọc leo, lóng dài 10 – 20 cm. Thân có các tua cuốn. Lá mỏng, gồm có 3 lá chét, lá giữa dài 10 – 12 cm, mép lá có răng cưa nhọn, lá có 5– 7 đôi gân bên, có hoặc không có lông.
Cây ra hoa vào tháng 5, hoa đơn tính khác gốc.