MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc.
Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.
Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau.
Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8], [47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị.
Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên gia về hình thái dược liệu. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62].
Công việc này nối tiếp các thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13]. Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các nghiên cứu về ADN. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66]. Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc.
ADN nhân và lạp thể được khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu loài. “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Chi Codonopsis Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm. Đây là chi thực vật hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông. Chi này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á. Codonopsis được coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75].
Phân loại học Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau: Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực) Giới: Plantae (Thực vật) Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh) Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín) Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm) Phân lớp: Asteriades Bộ: Asterales (Bộ Cúc) Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến) Phân họ: Campanuloideae Chi: Codonopsis 1. Sơ lƣợc đặc điểm hình thái và phân bố Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn [1]. Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông.
Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hình thái loài Codonopsis pilosula Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng.
Trên thế giới, chi Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm.Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có: - Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá.
Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 9 tháng 10. Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi là Phòng đảng sâm.
- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hình 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng Hình 2.
Hoa của loài C. javanica hoặc hơi vàng, họng có vân tím. Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5.