ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật. Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi. Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo probiotics.
Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong việc tạo khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm khả năng lan truyền bệnh, tính bền vững và khả năng nhân lên (Rolfe, 2000). Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và sản phẩm lên men. Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axit lactic rất cao là tiềm năng để sản xuất probiotics. Để thu được những chủng giống vi khuẩn lactic có phẩm chất sinh học tốt, đáp ứng yêu cầu trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khâu phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt.
Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao, nhưng chúng dễ bị biến đổi hoặc xuất hiện những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không tốt. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng được.
Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với phương pháp truyền thống là nuôi cấy trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống, thoái hóa giống… Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Lactobacillus 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sử dụng làm chế phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản”. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1. Mục đích Theo dõi các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình bảo quản, giữ giống ở nhiệt độ bảo quản tủ lạnh (4oC) để đánh giá sự biến đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và thời gian khác nhau, từ đó đánh giá phẩm chất giống và đưa ra quy trình bảo quản giống phù hợp.
Yêu cầu Đánh giá phẩm chất giống vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống trên các tiêu chí sau: - Đánh giá về hình thái. - Đánh giá về đặc tính sinh học như: sức sống, khả năng phân giải protein, khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa; khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS 2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s (2005) Lactobacillus được phân loại như sau: Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Eubacteriales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic gồm một số giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axit lactic. Giống Lactobacillus rất đa dạng.
Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol%. Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình que và khả năng tạo ra axit lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Bên cạnh đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) µm, đôi khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn (Abee et al.
Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi trường agar có kích thước 2- 5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy saccharose. Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose. Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh trưởng chậm trong không khí.
Đôi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được kích thích bằng cách thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy. Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt, chúng phát triển rất tốt trên môi trường có chứa nhiều phức chất. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 400C. Nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ là 5 – 530C.
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axit. pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8. Lactobacillus có một số đặc tính sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính, khử nitrate âm tính (đôi khi dương tính với pH > 6), có khả năng lên men glucose… (Axelsson and Lars, 2004). Lactobacillus phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các sản phẩm chế biến từ sữa và rượu bia.
Người ta có thể tìm thấy Lactobacillus ở cả động vật và thực vật. Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo (Fuller, 1989). Lên men lactic ở Lactobacillus Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột.
Sự phát triển của chúng cần sự có mặt của peptone, axit amin hay muối amoni. Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, axit amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit pH từ 5,5÷6, khi pH < 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15÷500C.
Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn. Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa.
Sau đó phân tử đường này sẽ đi vào các chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là axit lactic, axit axetic, CO2… Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra làm hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các loài thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% axit lactic từ glucose, trong khi các loài lên men dị hình chỉ tạo ra 50% axit lactic và một lượng đáng kể carbone dioxide, acetate và ethanol. Các loài Lactobacillus lên men đồng hình gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus leichmannii… và các loài lên men dị hình gồm: Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum… (Axelsson and Lars, 2004). Mặc dù tất cả các loài Lactobacillus đều tạo ra axit lactic, nhưng các loài khác nhau có thể tạo ra các axit lactic khác nhau về đồng phân hóa học. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus 2.
Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất ức chế với cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, kể cả nấm và có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm các axit hữu cơ, hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin (Hollang et al., 1987; Mishra and Lambert, 1996). Axit hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản sinh bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, axit probionic. Một vài vi khuẩn chi Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển của E. luteus, Salmonella typhi và Shigella flexneri bằng cách sinh ra ra axit lactic (Mai Thị Đàm Linh và cs.
Cả axit lactic và axit axetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác. Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacteriocin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio, Campylobacter, Shigella, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác (Mishra and Lambert, 1996). 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Khả năng chịu mặn Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này chế tạo chế phẩm sử dụng cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau. Một số chủng Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ 3,1% tới 3,8% của nước biển như L. amylovorus DCE 471 có thể tồn tại và sinh ra bacteriocin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl (Patricia et al.