ĐẠI hỌc QUOc GIA hA TOI TI'GJONG DAI hOc KhOA hOQc TU MIEN KHOA SIHh hỌc Lê Thị huyền HGHIÊN cỨU KhẢ HĂNG Kích Thích MIỄN Dịch KhÁNG UNG ThG] PhOI cUA EX0SOME TE bAO TUA MAU DAY ror Trv DOIG LUẬII VĂI ThẠc SỸ Kh0A hỌc ĐẠI hỌc QUOc GIA hA TOI TI'GJONG DAI hOc KhOA hOQc TU MIEN KHOA SIHh hỌc Lê Thị huyền HGHIÊN cỨU KhẢ HĂNG Kích Thích MIỄN Dịch KhÁNG UNG ThG] PhOI cUA EX0SOME TE bAO TUA MAU DAY ror Trv DOIG LUẬII VĂI ThẠc SỸ Kh0A hỌc Mã số: 8420101.4 chuyên ngành: sinh học thực nghiệm cán bộ hơjớng dẫn: — TS. Hguyén Xuan hong PGS. h0àng Thị Mỹ Hhung LỜI cÁM ƠI Đầu liên, lôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia hà Hội đã lài trợ kinh phí ch0 đề tài với mã số QG.09 để đề lài đojợc lhực hiện và liến hành đúng liễn độ. Tôi xin gửi lời siết ơn sâu sắc lới TS.
IIguyễn Xuân hoỊng và PGS. hOàng Th Mỹ IIhung ngojời hojớng dẫn trực liếp của lôi đã giúp lôi rất nhiều lr0ng quá trình h0àn thành nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn hai ngojời hơjớng dẫn đã lận lình giúp đỡ lôi Ir0ng đ nh hojớng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc, khó khăn đồng thời chỉ dạy lôi những sài học quý giá. Ilếu không có sự hơlớng dẫn và giúp đỡ này, luận văn này của lôi sẽ không đơjợc h0àn thành mội cách tron ven.
Tôi xin tram trong cam on GS. Hguyén Thanh Liêm - Viện lrơiởng Viện nghiên cứu Tế sà0 gốc và công nghệ gen Vinmec, ThS. bòi Việt Anh — Trojởng nhóm Liệu pháp miễn d ch - Trung lâm công nghệ ca0 - bệnh viện Da kh0a quốc lễ Vinmec đã ‡ạ0 điều kiện ch0 lôi có cơ hội đơiợc thực lập lại phòng thí nghiệm hiện đại sậc nhất Việt Iam đojợc tiếp cận với những kỹ thuật, trang thiết s liên liễn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS.
Tran Th Tuyết Trinh, ThS. chu Th Thả0, TS. Thân Th Trang Uyên, ThS. IIguyền Vain Phong ThS.
Hguyễn Đắc Tú, cII. h0àng hojơng Diễm, cII. Trần Trung IIghĩa clI bòi Th hồng hué cll. B6 Th h0ai Thu, cll.
Pham Th cojờng và những cán sộ của Viện nghiên cứu Tế sà0 gốc và công nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình ch0 lôi lr0ng quá lrình h0àn thành luận văn lốt nghiệp này. bên cạnh đó lôi gửi lời cảm ơn lới ThS. bùòi Th Vân Khánh cùng các sạn, anh, ch lại phòng thí nghiệm Ủng thoi thực nghiệm — TroJờng Đại học Kh0a học Tự nhiên - Đại học quốc gia hà Hội vì sự giúp đỡ và khuyến khích lôi tr0ng suốt thời gian làm việc còng nhau. TIIg0ài ra, lôi xin cảm ơn lrojờng Đại học Kh0Ủa học Tự IIhiên — Đại học Quốc gia hà lội nơi đã ch0 tôi không chỉ kiến thức về Sinh học mà còn có một lầm nhìn mới về nhận thức Kh0a học sự sống và các thầy cô sộ môn Sinh học Tế sà0, những ngojời kiên nhẫn dạy ch0 lôi kiến thức cơ sản cũng nhơi truyền đại ch0 lôi những kinh nghiệm, giúp lôi có thể trở thành một nhà kh0a học thực sự.
cuối còng, lôi gửi lời siết ơn chân thành nhất lới gia đình và sạn bè thân yêu đã tin loiởng, ch0 lôi nguồn động lực đồi đà0 thúc đây lôi vojợ† qua mọi khó, thử thách. hà Hội, lháng 12 năm 2019 học viên Lê Th huyền DAIIh MUc cAc TU VIET TAT Từ viết tắt Từ đầy đủ Từ Tiếng Việt bSA b0vine serum albumin Alsumin lừ huyết thanh sê bcA bicinchOninic acid Axit picinchOnimic Tê a0 don nhân máu cuông cbMc c0rd 5100d mOn0nuclear cell x ron cD cluster Of differeniatiOn cụm biệt hóa carb0xyfluOrescein succinimidyl , cFSE Thuôc nhuộm huỳnh quang ester cTL cy1010xic T lymph0cyle Tế sà0 T gây độc Dc Dendritic cell Tế Ba0 tua Dex Dex0s0me Ex0s0me liết từ lế bàO lua End0OsOmal sOrting cOmplex Phức hệ vận chuyên đojợc EScTT. : required fOr transpOrt yéu cau ¬. cục Quản lý Thực phâm và FDA F00d and Drug AdmimisiraH0n , Doc pham h0a Ky Granul0cyle-macr0phage Yeu 16 kích thích lạ0 cụm GM-CSE c0l0ny- dòng hạl-m0n0 stimulating factOr iDc Immature dendritic cell Tế sà0 tua chaa trojong thành các chôi mọc phía bên lr0ng ILVs Intraluminal vesicels End0sOme IL Interleukin Interleukin mDc Mature dendritic cell Tế sà0 lua lrolởng thành Tê bàO ức chê có nguôn gôc MDScs MyelOid-derived suppressOr cells „ lủy xơjơng Tê bà0 lua có nguôn gôc lừ m0Dc MOn0cyte-derived Dendritic cell ran 1ê bà0 mŨn0 MajOr hisi0cOmpalipility Phức hệ phù hợp lô chức Mhc cOmplex chinh MIIc MOnOnuclear cell Tế sà0 đơn nhân MVbs Mullivesicular s0dies Thể đa sà0 IK Hatural killer Tế sà0 giết lự nhiên Ung thơ phôi không lê sà0 IIScLc 110m small cell lung cancer nhỏ 0D 0plical densily Mậi độ quang PS PerfOrmanice status Thé trang bệnh nhân ScLc Small cell lung cancer Ung thơi phổi lế sà0 nhỏ TẠP Transp0rter ass0cialed with bộ máy vận chuyên kháng anHgen pr0cessing nguyên đặc hiệu Th T helps Tế sà0 T số lrợ TIF - o TumO0r necrOsis faclOr alpha | Yếu lố h0ại lử khối u alpha Treg Tegulal0ry T cells Tế bà0 T điều hòa JAAD Thuôc nhuộm huỳnh quang 7-amin0-acHn0myem D 7ADD MUc LUc 3:00 pnf0(9)0(019)07 00077.
Thue trang ung tho phổi 1. Thực trạng ung thơi phổi.-----22+++2+2+EEE+EEEEEEE2EEEEE72127212711 221221. Đáp ứng miễn dch lr0ng ung thơ phối. các phơjơng pháp điều lr ung thơi phổi.----2-©22+2E+22£E£+EEEt2EEevrrerrrscee 7 a) Điều lr đíCh.¿-ccck Tt E121112111211 211 T1 Hà HT TH HH nàng ng ne 7 b) Liệu pháp miễn d chh.----- 2-2 + SE ExEE£EEEEEEEEEEEEEEEE2EEEEEE21E212121 212 2xcrkrrvee 8 1.
Tế bà0 lua. Ð nh nghĩa lế bàO lua. c0n đơiờng lrình diện kháng nguyên của lế bà0 lua.-----22¿522+cz+zvsz+czz 11 1. cơ ché biét hoa 46 sàO tua iH ViÍrÚ.c 5e 2n HH H00030440030380100484010038480000048000004056 14 IS Di 0i :3v 8540000 11.
cơ chế hình thành Ex0sÖme. l5 a) cơ chế hình thành Ex0s0me phụ thuộc ESCT”T. --- 5 SxsEssvrserrerskrersee 16 b) cơ chế hình thành Ex0s0me không phụ thuộc EScl”T. chức năng trình diện kháng nguyên của Ex0s0me có nguồn gốc lừ lế sà0 lua.
18 a) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp Mhc-I của Ex0s0me có nguồn gốc lừ lễ sà0 II. 18 b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp Mhc-II của Ex0s0me có nguồn gốc lừ lễ sà0 II. Ứng dụng của lế sà0 lua và Ex0s0me lr0ng điều lrị ung thơ|. Ứng dụng lễ sà0 lua lr0ng điều tr ung thơi lại Việt [lam.
Ứng dụng Ex0s0me lr0ng điều ‡r ung †hQ|. Máu cuống rốn trữ đông - nguồn cung cấp lế bà( m0n).-----s- 5° + 24 chơjơng 2 - ĐỐI TGỊỢIG VÀ PhŒ|ƠIIG PhÁP HIGHIÊII cỨU. Đối lơJgng nghiên cứu.----es°e<es£ss£©ssetvss£Esseerseersseerseersssrrssersee 26 2.2, hóa Chất và khiết bị.-- c2 121111111211 T1 TẤT Hà Hà TH HH Hà Hàng gàng ệy 28 ;»; u15 7 29 2. Dumg cu cap 0000.
PhơJơng pháp nghiên cứu 2. Iuôi cây dòng lễ sà0 ung thơ siểu mô phế mang phối A549. Tách chiết và xác đ nh nồng độ pr0lein lồng số lừ dòng lế sà0 ung thơi siểu mô phế hi 010026. Ta dOmg mau cudmg rért tit MOMg oo.
Phân lập lế sà0 đơn nhân lừ máu cuống rốn lrữ đông. Huôi cấy, siệt hóa và lroiởng thành lế sà0 đơn nhân thành lế sà0 ua. Thu h0ạch lễ sà0 tua Dc và môi trơiờng nuôi cấy lế sà0 lua Dc.------ 35 a) Thu h0ạch môi lrơiờng nuôi cây lế sà0 lua D(.2-22©2222S22EEEt2EE22EEEtzzxzrrrs 35 b) Thu h0ạch lế bà0 lua. Thu nhận Ex0s0me từ môi trojờng mudi cấy lế sà0 lua máu cuống rốn trữ đông.
Phân lập lế sà0 Iymph0 T từ lế sà0 đơn nhân máu nng0ại vi.---2-2¿ 36 a) Phân lập lễ sà0 đơn nhân máu ngÖại vỉ.-2-22-©225+22EE£+2EE£2EEEt2EE2SEEErzrrerree 36 b) Phân lập lế sà0 Lymph0 T từ lễ sà0 đơn nhân máu ngÖại vi. Đánh giá ảnh hơjởng của lế sà0 tua và Exs0me lên sự sinh lrojởng của lế sà0 TYMphO T pm. Đánh giá khả năng gây độc lé sà0 ung thoi biểu mô phế nang phối A549 của lế sà0 Wu1Ua 0N No; N«:ï 00T. Phơiơng pháp phân lích lế à0 the0 dòng chảy.
Phơiơng pháp xử lý số liệu.Lxe 42 chơjơng 3 - KÉT QUÁ VÀ ThẢ0 L/U ẠH. Kết quả thu nhận pr0kein lông số lừ dòng lế sà0 ung thơi A549. Tã đông máu cuống rốn lrữ đông.----es<s<esvss+sssevssezsssrsssessse 44 3. Phân lập lế sà0 m0n0 từ máu cuống rốn lrữ đông.
Kết quả biệt hóa lế sà0 m0n0 thành lế bà0 D(. các dấu ấn bề mặt $6 bà. Kết quả phân lập !ế sà0 lymph0 T lừ lế cà0 đơn nhân máu ngại vỉ. _ Kết quả đánh giá ánh hơjớng của lế sà0 lua và Exs0me lên sự sinh lrơjớng của U00) 100355.
Kếi quả đánh giá khá năng gây độc lế sà0 ung thơi biểu mô phế nang phổi A549 của lế sà0 lymph0 T đã cảm ỨTIg.--- 22s e<es£se£ESseESseEESseEYseExsetrseersserrseersssore 56 chơiơng 4 - KIẾT LLUẬI.5<- se s°seSss£CSs#SS2£ESe£3se£vsetYseerssersseee 59 3:00 f9i5i0ï 1077. 60 chơjơng 6 — TÀI LIỆU ThAM IKhÁ(.-- 5-2 << sssvssesssessseesseex 61 DAITh MUc hillh hình 1.1: co ché ung tho phéi th0dt hỏi giám sát miễn d ch [29].2: Vai trò của PDI và cTLA-4 lr0ng đáp ứng miễn d ch kháng khối u.3: các phojơng pháp điều lr ung thoi phổi.4: Sự hình thành các quần thể lế sà0 lua [69].-- 2-2 se sscvs2 10 hình 1.5: c0n đojờng lrình diện kháng nguyên của lế sà0 lua.6 : GM-cFS điều hòa sự phát triển của Dc qua các tín hiệu phân lừ khác hình 1.8: cơ chế hình thành Ex0s0me †he0 c0n đojờng phụ thuộc EScTT [30] .9: c0n đojờng trình diện kháng nguyên của Ex0s0me từ lé sà0 tua [47].1: Mẫu máu cuống rốn lrữ đông lại bệnh viện Đa kh0a Quốc lế Vinmec26 hình 2.2: bản lự nguyện chấp thuận tham gia hiến lặng mẫu sinh học lại bệnh viện Đa kh0a Quốc lế V'irIImec.- - 22s s2 SEE+EE£EEESEEEEE1E2112E11271211271E 1x EEe.3 Quy trình thí nghiỆm .4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly lâm với Fic0lI.4: Máu ng0ại chia làm 4 phần sau ly lâm với Fic0l1.1: Tế sà0 trên suồng đếm hong cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck45 hình 3.2: Tế sà0 đơn nhân lrơjớc và sau khi 10a sỏ lễ sà0 trôi nỗi sau 2 giờ nuôi .3: Quần thé #é sà0 trojớc và sau khi phân lập †ế sà0 m0n0.4: hình thái lế sà0 m0n0 siệt hóa thành tế bà0 Dc.5: Phân tích the0 phojơng pháp dòng chảy lế sà0 các dấu ấn sề mặt lế sà0 G0009.6: Tỷ lệ trung sình các dấu ấn sề mặt.8: Sự lăng sinh lé sà0 Iymph0 T cD3+ khi nhuộm cSFE hình 3.9: h0ạ† tính gây độc lên tế sà0 A54 của lế sà0 Lymph0 T.10: Tỷ lệ h0ạ† tính gây độc lế sà0 (mẫu 1). DAITh MUc bAIIG bảng 1: Một số thử nghiệm về siệt hóa lề sà0 lua với các lổ hop cylOkine khac bảng 1.2: S0 sánh tiềm năng liệu pháp miễn d ch dựa trên Dc và Dex bảng 2.1 hóa chất sử dụng lr0ng thí nghiệm.1: Thiết s sử dụng †r0ng thí nghiệm .2: Dụng cụ và vat toy sử dụng trOng thi nghiệm .3: chuẩn s5 mẫu chuẩn dung d ch pr0leim.5: Thiết kế thí nghiệm lế sà0 Lymph0 T cảm ứng với Dc và Ex0s0me.