Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi Haemophilus influenzae (H.influenzae) được phân lập lần đầu tiên bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria).
Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H.influenzae chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh. Năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của H.influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn H.influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng bởi virus cúm. Xuất phát từ yếu tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) và nhu cầu đòi hỏi những yếu tố phát triển có mặt ở máu (Haemophilus: ưa máu) nên vi khuẩn này có tên gọi H. Đặc điểm sinh học của H.
Hình thể và cấu trúc [19], [89] H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5mm) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể của H. influenzae có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.
influenzae bắt màu Gram âm, không di động và không hình thành nha bào. Thành tế bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của những vi khuẩn Gram 4 âm khác. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). influenzae có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [19], [43], [89].
Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt này có liên quan chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc biệt là H. Bạch cầu đa nhân Hib Hình 1.1 Hình thể của Hib trên tiêu bản nhuộm Gram dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại × 1000) [99]. Trên thực tế, nếu nhuộm Gram bệnh phẩm dịch não tủy mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu đa nhân thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng não do H.
Sức đề kháng [127] H. influenzae là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời 5 chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng.
Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa 24 giờ trong môi trường này. Đặc điểm nuôi cấy [19] Điều kiện nuôi cấy: H. influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy.
Chúng không mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần túy mà là hỗn hợp của các chất có chứa sắt (như hemin và hematin). influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X.
Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 - 1,0 mg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào.
Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phân hủy NAD, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do. Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 mg/ml. influenzae hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO2 (2 - 5%) khi mới phân lập.
Mọc tốt trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu là 370C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu 6 mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy. Cũng trên thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H. influenzae mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé.
Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đã giúp H. influenzae phát triển được thạch máu thông thường.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của H. influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc của S. aureus trên môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc: Để nuôi cấy H.
influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [19], [43], [89], [127]: - Thạch chocolate có hoặc không có 300mg bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phân lập H. Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn này. - Thạch máu thỏ tươi 7% và thạch Levinthal Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt 7 trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 - 24 giờ.
influenzae mọc trên môi trường chocolate Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy, H. influenzae phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1 - 2mm và không gây tan huyết. Vi khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol).
Sau 24 - 48 giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi. Trên môi trường lỏng, H. influenzae thường phát triển làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ).
Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae: Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này có thể được xác định bằng thử nghiệm XV hoặc thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]: 8 (1) (2) Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV (1); thử nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H.
influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển H. influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus khác ở các đặc điểm sau đây: Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H. influenzae với các Haemophilus khác [127]. Tính chất Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 Loài H.
Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và typ sinh học (biotype) của H. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ huyết thanh [19], [43], [89] Năm 1930, H. influenzae được xác định thành 2 nhóm chính, đó là loài không vỏ (không xác được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác 9 định được typ huyết thanh - typeable).
Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của vỏ polysaccharide, vi khuẩn H. influenzae có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a đến f. Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H. influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều nhất là H.
Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ sinh học (biotype) Bảng 1. influenzae theo typ sinh học của Killian [43] Các tính chất hoá học Biotype Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm: tìm khả năng sinh indol, hoạt động của hai enzym urease và decarboxylase của vi khuẩn. Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia H.
influenzae thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng không có vỏ cũng cho kết quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII. influenzae được chia ra làm 8 typ theo tiêu chuẩn của Killian [43].
Miễn dịch [28], [89] Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [89] Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T.