Đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b ở trẻ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b ở trẻ viêm màng não và trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại nhà trẻ.

• Tác giả: Ngô Thị Thi
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b ở trẻ dưới 5 tuổi
• Loại tài liệu: đề tài nghiên cứu
• Năm xuất bản: 2004
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Haemophilus influenzae typ b (Hib)
• 1.1.1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi
• 1.1.2. Đặc điểm sinh học của H. influenzae
• 1.1.2.1. Hình thể và cấu trúc
• 1.1.2.2. Sức đề kháng
• 1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc
• 1.1.2.5. Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae
• 1.1.2.6. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và typ sinh học (biotype) của H. influenzae
• 1.1.2.6.1. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ huyết thanh
• 1.1.2.6.2. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ sinh học (biotype)
• 1.1.2.7. Miễn dịch
• 1.1.3. Khả năng gây bệnh viêm màng não của Hib
• 1.1.3.1. Đặc điểm sinh bệnh học
• 1.1.3.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm màng não
• 1.1.3.3. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm viêm màng não do Hib
• 1.1.3.3.1. Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định Hib

Tóm tắt

I. Tổng quan về đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b

Vi khuẩn Haemophilus influenzae typ b (Hib) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở trẻ em dưới 5 tuổi. Hib có thể gây ra nhiều bệnh lý, từ viêm phổi đến viêm màng não. Đặc điểm sinh học phân tử của Hib rất quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế gây bệnh và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Nghiên cứu về Hib giúp xác định các yếu tố nguy cơ và cách thức lây truyền của vi khuẩn này.

1.1. Đặc điểm hình thể và cấu trúc của Haemophilus influenzae

Hib là vi khuẩn nhỏ, có hình dạng cầu trực khuẩn, thường bắt màu Gram âm. Vi khuẩn này không di động và không hình thành nha bào. Cấu trúc bề mặt của Hib bao gồm lipopolysaccharide và protein, có vai trò quan trọng trong độc lực của vi khuẩn.

1.2. Phân loại và tính chất sinh hóa của Hib

Hib được phân loại thành hai nhóm: loại có vỏ và không có vỏ. Loại có vỏ được chia thành các typ huyết thanh từ a đến f. Hib cần hai yếu tố phát triển X và V để sinh trưởng, điều này làm cho việc nuôi cấy vi khuẩn này trở nên khó khăn.

II. Vấn đề nhiễm trùng đường hô hấp do Haemophilus influenzae typ b ở trẻ em

Nhiễm trùng đường hô hấp do Haemophilus influenzae typ b là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh ở trẻ em dưới 5 tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh cao ở những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ. Việc hiểu rõ về vấn đề này giúp nâng cao nhận thức và cải thiện các biện pháp phòng ngừa.

2.1. Tỷ lệ nhiễm trùng do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang Hib có thể lên đến 15%. Điều này đặc biệt đáng lo ngại vì Hib là nguyên nhân chính gây viêm màng não và viêm phổi ở trẻ nhỏ.

2.2. Hệ quả của nhiễm trùng Hib đối với sức khỏe trẻ em

Nhiễm trùng do Hib có thể để lại di chứng nặng nề, với tỷ lệ tử vong khoảng 10%. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời là rất quan trọng để giảm thiểu các biến chứng.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của Hib

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b thường sử dụng các kỹ thuật hiện đại như PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis). Phương pháp này giúp xác định biotype và genotype của các chủng Hib, từ đó đánh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn.

3.1. Kỹ thuật PFGE trong nghiên cứu Hib

PFGE là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép phân tích DNA của vi khuẩn, giúp xác định các chủng khác nhau của Hib. Kỹ thuật này cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn.

3.2. So sánh đặc điểm sinh học giữa các chủng Hib

Nghiên cứu so sánh các chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh và trẻ mắc bệnh giúp hiểu rõ hơn về sự khác biệt trong độc lực và khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu về Hib trong y tế

Nghiên cứu về Haemophilus influenzae typ b không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn có thể giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em.

4.1. Vaccine phòng ngừa Hib và hiệu quả của nó

Vaccine phòng ngừa Hib đã được chứng minh là hiệu quả trong việc giảm tỷ lệ mắc bệnh. Việc tiêm vaccine cho trẻ em là một biện pháp quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

4.2. Các biện pháp phòng ngừa nhiễm trùng Hib

Ngoài việc tiêm vaccine, các biện pháp như vệ sinh cá nhân, giữ gìn môi trường sống sạch sẽ cũng rất quan trọng trong việc ngăn ngừa lây nhiễm Hib.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về Hib trong tương lai

Nghiên cứu về Haemophilus influenzae typ b cần tiếp tục được đẩy mạnh để hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh học phân tử của vi khuẩn này. Các nghiên cứu trong tương lai có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo về Hib

Nghiên cứu tiếp theo sẽ giúp xác định các yếu tố nguy cơ và cơ chế gây bệnh của Hib, từ đó phát triển các biện pháp can thiệp hiệu quả.

5.2. Hướng đi mới trong phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng Hib

Các nghiên cứu mới có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị, nhằm giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do Hib gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Haemophilus influenzae typ b (Hib) là một trong những căn nguyên vi khuẩn hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm trùng xâm nhập nguy hiểm ở trẻ nhỏ dưới 5 tuổi, đặc biệt là bệnh viêm màng não mủ và viêm phổi, để lại tỷ lệ di chứng nặng nề và tỷ lệ tử vong xấp xỉ 10%. Tại các quốc gia phát triển trước khi triển khai tiêm chủng rộng rãi, tỷ lệ mang Hib không triệu chứng ở vùng hầu họng trẻ nhỏ ghi nhận ở mức rất cao, dao động từ 15% đến 25% tại các cơ sở chăm sóc trẻ ban ngày. Mặc dù việc ứng dụng vacxin phòng bệnh đã làm giảm đáng kể gánh nặng bệnh tật, một số quốc gia vẫn ghi nhận tỷ lệ thất bại nhất định sau tiêm chủng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ học ghi nhận tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi khỏe mạnh mang vi khuẩn H. influenzae nói chung chiếm từ 21,4% đến 35,5%, trong đó mang Hib chiếm khoảng 15,0% đến 17,5%. Trong cơ cấu căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não ở trẻ nhỏ, H. influenzae chiếm từ 50% đến 60% các trường hợp xác định được vi khuẩn. Các công trình giai đoạn 1994–2004 bước đầu mô tả tỷ lệ mắc bệnh, phân bố biotype, genotype và gen mã hóa enzym $\beta$-lactamase của các chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não. Tuy nhiên, số lượng chủng nghiên cứu còn hạn chế và thiếu các phân tích đối chiếu trực tiếp giữa chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhi với chủng ký sinh phân lập từ trẻ khỏe mạnh trong cộng đồng. Do đó, luận án được thực hiện nhằm làm sáng tỏ nguồn gốc và dịch tễ học phân tử của các chủng Hib lưu hành.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác lập 3 mục tiêu cụ thể:

1. Xác định biotype, genotype, khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi.
2. Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại một số nhà trẻ, mẫu giáo.
3. So sánh đặc điểm sinh học giữa Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi với Hib được phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Haemophilus influenzae typ b (Hib) được phân lập từ hai nhóm đối tượng:
  • Bệnh nhi dưới 5 tuổi được chẩn đoán xác định viêm màng não (qua bệnh phẩm dịch não tủy và máu).
  • Trẻ em dưới 5 tuổi khỏe mạnh đang theo học tại các cơ sở nhà trẻ, mẫu giáo (qua bệnh phẩm dịch ngoáy họng).
• Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá các chỉ số vi sinh học cổ điển (hình thái, nhu cầu yếu tố phát triển X và V, phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh mẫu, phân loại typ sinh học - biotype theo thang Kilian), mức độ nhạy cảm kháng sinh, khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase và kiểu gen phân tử (genotype) thông qua kỹ thuật điện di trên gel trường xung (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước

Tác giả đã tổng hợp và phân tích hệ thống các công trình nghiên cứu vi sinh học, dịch tễ học và sinh học phân tử về Haemophilus influenzae:

• Lịch sử và bản chất vi sinh vật: Richard Pfeiffer (1890) phân lập vi khuẩn từ bệnh nhân cúm; các nghiên cứu giai đoạn 1918–1919 và 1933 xác định vi khuẩn là tác nhân cơ hội sau nhiễm virus cúm. Fothergill và Wright (1933) mô tả mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nồng độ kháng thể tự nhiên kháng Hib với nguy cơ mắc bệnh theo lứa tuổi.
• Phân loại sinh hóa: Kilian (1976) xây dựng hệ thống phân loại 8 typ sinh học (biotype I đến VIII) dựa trên ba thử nghiệm sinh hóa: sinh indol, hoạt tính urease và enzym decarboxylase (ornithin decarboxylase - ODC).
• Dịch tễ học mang trùng và viêm màng não:
  • Quốc tế: Phân tích của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) trên 229 nghiên cứu (gồm 30.000 trẻ mắc bệnh, 2.100 ca tử vong) xác định tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib trung bình là 22,8/100.000 trẻ dưới 5 tuổi, tỷ lệ tử vong trung bình 13,8%. Các nghiên cứu của Takala và cộng sự (Phần Lan), Peltola H (1999, châu Á), Yang Y (Trung Quốc), Bijlmer (Gambia), Murphy et al. (Dallas, Mỹ) ghi nhận tỷ lệ mang trùng ở cộng đồng (4–12,5%) và nhà trẻ (15–25%).
  • Tại Việt Nam: Phạm Nhật An và cộng sự (2001) tại Viện Nhi Trung ương xác định căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não; Phan Lê Thanh Hương và Đặng Đức Anh (2000–2002) ghi nhận Hib chiếm 48,8% các ca viêm màng não do vi khuẩn ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc, tỷ lệ mắc bệnh là 10/100.000 trẻ dưới 5 tuổi (lứa tuổi 1–23 tháng là 26/100.000), tỷ lệ tử vong 3% và di chứng 13%. Phạm Văn Ca và Lê Đăng Hà (2003) khảo sát tỷ lệ mang Hib ở trẻ khỏe mạnh đạt 15,0%–17,5%.
• Đề kháng kháng sinh:
  • Quốc tế: Tình trạng đề kháng ampicillin, chloramphenicol và co-trimoxazole được báo cáo bởi Haghiashteiani MT et al. (2008, Iran), Samir K. Saha (Bangladesh), Tamargo et al. (2003, Cuba với 938 chủng), Michell L. Sill et al. (Canada), Marina Cerquetti et al. (Ý).
  • Tại Việt Nam: Phạm Văn Ca và Cao Văn Viên (1991–2000) khảo sát 1.223 chủng H. influenzae, ghi nhận kháng co-trimoxazole (54,2%), ampicillin (44,9%), chloramphenicol (8,1%); Lê Huy Chính và cộng sự (2007) báo cáo kháng co-trimoxazole (69,6%), chloramphenicol (16,4%); Phan Lê Thanh Hương và cộng sự (2004) ghi nhận 59,7% chủng Hib sinh $\beta$-lactamase, kháng ampicillin (40,3%), kháng chloramphenicol (40,5%).
• Dịch tễ học phân tử: Tenover và cộng sự (1995) công bố hệ thống tiêu chuẩn diễn giải mẫu băng điện di PFGE để xác định mức độ liên quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có những ghi nhận bước đầu về tỷ lệ mắc bệnh và tính kháng thuốc của H. influenzae, các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu khảo sát trên quần thể vi khuẩn H. influenzae nói chung hoặc chỉ tập trung trên các chủng phân lập từ bệnh nhân viêm màng não với cỡ mẫu nhỏ. Luận án giải quyết khoảng trống dữ liệu bằng cách phân lập đồng thời và so sánh toàn diện các đặc tính sinh học phân tử (biotype, genotype bằng PFGE với enzym giới hạn SmaI, gen mã hóa $\beta$-lactamase, kiểu hình kháng sinh) giữa hai nhóm chủng: chủng gây bệnh xâm hại (viêm màng não) và chủng ký sinh ở trẻ khỏe mạnh tại các cơ sở mầm non.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khái niệm sử dụng

• Đặc điểm vi sinh vật học: Haemophilus influenzae là cầu trực khuẩn Gram âm, kích thước 1,0–1,5 $\mu$m, không di động, không sinh nha bào. Thành tế bào có cấu trúc lipopolysaccharide–protein. Vi khuẩn được phân thành hai nhóm: không có vỏ polysaccharide (non-typeable) và có vỏ polysaccharide (typeable, gồm 6 typ huyết thanh từ a đến f). Typ b có vỏ cấu tạo từ polyribosyl-ribitol-phosphate (PRP) liên quan trực tiếp đến độc lực.
• Yếu tố dinh dưỡng bắt buộc: Vi khuẩn bắt buộc phải có hai yếu tố tăng trưởng để phát triển:
  • Yếu tố X: Hỗn hợp chứa sắt (hemin, hematin) nồng độ 0,1–1,0 mg/ml, cần cho quá trình tổng hợp enzym catalase, peroxidase và cytochrom.
  • Yếu tố V: Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) hoặc Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADP) nồng độ 0,2–1,0 mg/ml.
• Khung phân loại sinh hóa Kilian: Dựa trên 3 phản ứng sinh hóa để phân thành 8 biotype.
• Cơ chế miễn dịch và cấu trúc vacxin: Kháng nguyên vỏ PRP là kháng nguyên không phụ thuộc tế bào T (TI-2). Khi liên kết cộng hóa trị với protein mang (như giải độc tố bạch hầu PRP-D, giải độc tố uốn ván PRP-T, phức hợp màng ngoài não mô cầu PRP-OMPC, hoặc protein đột biến bạch hầu HbOC), kháng nguyên chuyển thành dạng phụ thuộc tế bào T, kích thích tế bào lympho T hỗ trợ, sinh kháng thể IgG1 và tạo tế bào nhớ miễn dịch.
• Tiêu chuẩn dịch tễ học phân tử PFGE theo Tenover et al. (1995):
  • Khác biệt 0 băng: Không thể phân biệt (Indistinguishable) - cùng một chủng.
  • Khác biệt 2–3 băng: Có mối liên quan gần (Closely related) - do 1 biến cố di truyền.
  • Khác biệt 4–6 băng: Có thể có liên quan (Possibly related) - do 2 biến cố di truyền độc lập.
  • Khác biệt $\ge$ 7 băng: Khác nhau hoàn toàn (Different) - do $\ge$ 3 biến cố di truyền độc lập.

Tiêu chuẩn phân loại mức độ liên quan di truyền bằng kỹ thuật PFGE (Tenover et al., 1995)

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu vi sinh học, dịch tễ học phân tử và phân tích thực nghiệm trong phòng thí nghiệm:

1. Phương pháp lấy mẫu và nuôi cấy phân lập:
   • Bệnh phẩm dịch não tủy và máu: Ly tâm DNT 2000 vòng/phút trong 20 phút, nhuộm Gram cặn lắng; cấy vào thạch chocolate bổ sung IsoVitalex, ủ ấm 37°C trong khí trường 5–10% $\text{CO}_2$ trong 18–24 giờ. Cấy máu dùng 1–2 ml máu vào 20 ml môi trường canh thang dinh dưỡng, theo dõi 7 ngày.
   • Bệnh phẩm ngoáy họng miệng (oropharyngeal swabs): Thu thập từ trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, vận chuyển trong môi trường bảo quản ở 4–8°C tối đa 24 giờ.
2. Kỹ thuật định danh và xác định typ:
   • Xác định nhu cầu yếu tố X, V bằng khoanh giấy thử nghiệm và thử nghiệm hiện tượng "vệ tinh" quanh khuẩn lạc Staphylococcus aureus.
   • Định typ huyết thanh b bằng kháng huyết thanh mẫu đặc hiệu.
   • Định biotype bằng thanh thử tính chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMérieux).
3. Kỹ thuật miễn dịch học và sinh học phân tử chẩn đoán:
   • Kỹ thuật ngưng kết hạt latex: Sử dụng kit Pasteurex Meningitis Hib hoặc BioMérieux Slidex meningite.
   • Điện di đối lưu (Counter-immunoelectrophoresis - CIE): Chạy trên thạch agarose 1% pha trong đệm barbital pH 8,4 ở cường độ dòng điện 8 mA trong 30 phút.
   • Kỹ thuật PCR truyền thống: Sử dụng cặp mồi Haem Right khuếch đại đoạn gen bảo tồn hpD (Mồi 1: 5’-CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG-3’), chu trình nhiệt gồm 35 chu kỳ (biến tính 94°C, gắn mồi 56°C, kéo dài 72°C).
   • Kỹ thuật Real-time PCR: Sử dụng hệ thống ABI PRISM 7700, cặp mồi đặc hiệu (5’-CAAGATACCTTTGGTCGTCTGCTA-3’ và 5’-TAGGCTCGAAGAATGAGAAGTTTTG-3’) cùng mẫu dò TaqMan (5’-ATGATATGGGTACATCTGTT-3’).
4. Kỹ thuật điện di trên gel trường xung (PFGE):
   • Vi khuẩn được cố định trong các nút thạch agarose, ly giải tế bào giải phóng ADN nguyên vẹn, phân cắt bằng enzym giới hạn SmaI.
   • Điện di trong hệ thống điện trường đa chiều cho phép phân tách các đoạn ADN kích thước lớn từ 10 đến 500 kb; nhuộm ethidium bromide, chụp ảnh và phân tích mẫu băng bằng các phần mềm chuyên dụng (Bio-Rad, BioNumerics).
5. Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh và phát hiện enzym $\beta$-lactamase:
   • Khảo sát độ nhạy cảm với các kháng sinh thông dụng thuộc các nhóm $\beta$-lactam, aminoglycoside, phenicol, macrolide, fluoroquinolone.
   • Xác định khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase để đánh giá cơ chế kháng ampicillin.

Kỹ thuật xét nghiệm	Độ nhạy (%)	Độ đặc hiệu (%)	Đặc điểm ứng dụng
Nuôi cấy phân lập	50 – 55	100	Cho phép làm kháng sinh đồ, định biotype và PFGE
Ngưng kết hạt latex	95	99,6	Đơn giản, phát hiện nhanh kháng nguyên vỏ trong DNT
Điện di đối lưu (CIE)	97	100	Phản ứng kết tủa miễn dịch trên gel thạch
PCR truyền thống	100	99	Khuếch đại đoạn gen hpD đặc hiệu Hib
Real-time PCR	100	99	Độ nhạy cao, định lượng trực tiếp bằng TaqMan probe

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1. Đặc điểm sinh học và phân loại của Haemophilus influenzae

Văn bản tổng quan chi tiết các thuộc tính vi sinh học của H. influenzae. Vi khuẩn có hình thể cầu trực khuẩn Gram âm đa hình thái trong dịch não tủy, sức đề kháng kém với các yếu tố ngoại cảnh (ánh sáng mặt trời, khô hanh, lạnh và hóa chất sát khuẩn thông thường). Về đặc tính nuôi cấy, vi khuẩn không mọc trên thạch máu cừu thông thường do thiếu yếu tố V tự do và có enzym NADase phá hủy NAD; mọc tốt trên thạch chocolate (nơi hồng cầu bị phá hủy bởi nhiệt giải phóng yếu tố X và V, đồng thời làm bất hoạt NADase) và thạch Levinthal trong khí trường có 2–5% $\text{CO}_2$ ở 37°C.

Hệ thống phân biệt H. influenzae với các loài Haemophilus khác và hệ thống 8 biotype theo tiêu chuẩn sinh hóa của Kilian được tổng hợp chi tiết:

Đặc điểm sinh học	Tan huyết	Cần yếu tố X	Cần yếu tố V	Cần $\text{CO}_2$
Haemophilus influenzae	-	+	+	+
Haemophilus parainfluenzae	-	-	+	-
Haemophilus haemolyticus	+	+	+	-
Haemophilus parahaemolyticus	+	-	+	-
Haemophilus aphrophilus	-	-	-	+

Biotype theo Kilian	Hoạt tính Urease	Khả năng sinh Indol	Hoạt tính Ornithin Decarboxylase (ODC)
I	+	+	+
II	+	+	-
III	+	-	-
IV	+	-	+
V	-	+	+
VI	-	-	+
VII	-	+	-
VIII	-	-	-

2. Miễn dịch và cơ chế tác động của vacxin phòng Hib

Miễn dịch bảo vệ tự nhiên phụ thuộc chủ yếu vào kháng thể kháng lại polysaccharide vỏ PRP. Nồng độ kháng thể IgG truyền từ mẹ qua rau thai suy giảm nhanh chóng sau những tháng đầu đời, dẫn đến "khoảng trống miễn dịch" khiến trẻ từ 6 tháng đến 2 tuổi có nguy cơ mắc bệnh cao nhất. Cơ chế bảo vệ cơ thể thông qua hiện tượng opsonin hóa kích hoạt bổ thể để đại thực bào thực bào vi khuẩn. Kháng nguyên PRP đơn thuần không kích thích được tế bào lympho T hỗ trợ ở trẻ nhỏ, do đó công nghệ vacxin cộng hợp PRP với các protein mang (PRP-D, PRP-T, PRP-OMPC, HbOC) là cơ sở tạo ra nồng độ kháng thể bảo vệ cao ($\ge 1\ \mu\text{g/ml}$ ở người, $7\ \mu\text{g/ml}$ trên mô hình thực nghiệm) và duy trì trí nhớ miễn dịch.

3. Bệnh sinh và chẩn đoán lâm sàng viêm màng não do Hib

Vi khuẩn lây truyền qua đường hô hấp, cư trú tại vùng mũi họng, xâm nhập biểu mô vào hệ bạch huyết và máu. Vỏ PRP giúp vi khuẩn kháng lại hoạt tính diệt khuẩn của bổ thể và đại thực bào trong máu. Từ tuần hoàn, vi khuẩn vượt qua hàng rào máu - não tại vị trí đám rối màng mạch để vào dịch não tủy gây viêm màng não. Triệu chứng lâm sàng gồm sốt, ngủ gà, nôn, kích thích, co giật (chiếm 1/3 số bệnh nhân trước khi nhập viện); các dấu hiệu màng não kinh điển (Brudzinski, Kernig, cứng gáy) thường ít gặp ở trẻ dưới 15 tháng tuổi.

4. Dịch tễ học mang trùng và bệnh viêm màng não do Hib

• Tỷ lệ mang trùng tại họng mũi/họng miệng ở trẻ em dưới 5 tuổi dao động từ 4% đến 12,5% trên thế giới; tại Việt Nam là 15,0% đến 17,5%. Môi trường sống đông đúc tại các nhà trẻ làm tăng tỷ lệ này lên 15%–25%. Lây nhiễm thứ phát trong gia đình có người mắc bệnh lên đến 60%–70% ở anh chị em ruột.
• Viêm màng não chiếm hơn 50% các thể bệnh xâm nhập do Hib. Phân bố độ tuổi mắc bệnh tập trung cao nhất ở nhóm 1–23 tháng tuổi (chiếm 88% tại Việt Nam; trên thế giới nhóm 0–11 tháng tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất).

5. Thực trạng đề kháng kháng sinh của Hib

Tổng quan ghi nhận sự gia tăng nhanh chóng của các chủng Hib kháng ampicillin do sinh enzym $\beta$-lactamase (TEM-1), kháng co-trimoxazole và chloramphenicol (thông qua enzym chloramphenicol-acetyl-transferase - CAT):

• Tại Việt Nam: Kháng co-trimoxazole đạt từ 54,2% đến 69,6%; kháng ampicillin đạt từ 40,3% đến 44,9%; kháng chloramphenicol đạt từ 8,1% đến 40,5%; tỷ lệ sinh $\beta$-lactamase đạt 59,7%. Các kháng sinh duy trì độ nhạy cảm cao xấp xỉ 100% gồm ceftriaxone, cefotaxime, cefaclor, cefpodoxime, meropenem, levofloxacin, rifampicin.
• Trên thế giới: Mức độ kháng ampicillin, co-trimoxazole, chloramphenicol lần lượt ghi nhận tại Iran (42,1%; 52,6%; 36,8%), Cuba (46,3%; 51,3%; 44,0%), Canada (44% kháng ampicillin).

6. Đánh giá các phương pháp phân loại dịch tễ học phân tử

Văn bản so sánh chi tiết các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên các tiêu chí chuẩn thức: Khả năng phân loại (Typeability), Độ tái lặp (Reproducibility), Tính bền vững (Stability), Khả năng phân biệt (Discriminatory power - chỉ số Simpson $> 0,95$), Tính phù hợp dịch tễ học (Epidemiologic concordance) và Tính thực tiễn:

Kỹ thuật phân tử	Tiện lợi sử dụng	Giải thích kết quả	Khả năng phân biệt	Thời gian thực hiện (ngày)	Độ lặp lại trong PTN	Độ tái lặp giữa các PTN	Giá trang thiết bị	Giá mỗi mẫu xét nghiệm
PFGE	Trung bình	Dễ	Cao	3	Cao	Cao	Cao	Trung bình
PCR based RFLP	Dễ	Dễ	Trung bình	1	Cao	Cao	Trung bình	Trung bình
RAPD	Dễ	Dễ	Cao	1	Trung bình	Thấp	Trung bình	Thấp
AFLP	Khó	Dễ	Cao	1	Cao	Cao	Cao	Thấp
Rep-PCR	Trung bình	Dễ	Cao	2	Cao	Cao	Trung bình	Thấp
ADN Sequencing	Trung bình	Trung bình	Cao	2	Cao	Cao	Cao	Cao

Kỹ thuật PFGE được khẳng định là "tiêu chuẩn vàng" trong điều tra dịch tễ học vi khuẩn Haemophilus influenzae, vượt trội hơn các phương pháp phân loại kiểu hình truyền thống và các kỹ thuật PCR ngẫu nhiên khác.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp về mặt học thuật và lý luận

1. Hoàn thiện dữ liệu dịch tễ học phân tử: Cung cấp bức tranh toàn diện và có hệ thống về đặc điểm kiểu gen (genotype) của các chủng Hib tại Việt Nam bằng kỹ thuật PFGE sử dụng enzym cắt giới hạn SmaI, chuẩn hóa theo khung phân tích Tenover et al. (1995).
2. Làm rõ mối quan hệ di truyền giữa chủng gây bệnh và chủng ký sinh: Đưa ra bằng chứng phân tử xác định mức độ đồng nhất hoặc khác biệt về kiểu gen giữa các chủng Hib gây bệnh xâm hại (viêm màng não) phân lập từ dịch não tủy/máu với các chủng Hib ký sinh không triệu chứng phân lập từ đường hô hấp của trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ.
3. Bổ sung cơ sở dữ liệu về tính kháng thuốc và enzym $\beta$-lactamase: Xác lập mối liên quan giữa khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase và mức độ đề kháng đa kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, co-trimoxazole) của Hib, chỉ ra khả năng các gen kháng thuốc cùng nằm trên một đoạn plasmid di truyền.

Những đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng

1. Định hướng phác đồ điều trị kháng sinh: Cảnh báo tỷ lệ đề kháng cao của Hib đối với các kháng sinh cổ điển (ampicillin $> 40%$, co-trimoxazole $> 50%$, chloramphenicol tới $40%$), khẳng định sự cần thiết phải lựa chọn các kháng sinh còn độ nhạy cảm cao như cephalosporin thế hệ 3 (ceftriaxone, cefotaxime), carbapenem (meropenem) hoặc fluoroquinolone trong điều trị viêm màng não mủ do Hib.
2. Cơ sở khoa học cho can thiệp y tế công cộng: Cung cấp số liệu thực chứng về tỷ lệ mang Hib tại các cơ sở nhà trẻ, mẫu giáo (nguồn lây truyền chính trong cộng đồng), hỗ trợ việc hoạch định chính sách đưa vacxin Hib cộng hợp vào chương trình tiêm chủng mở rộng nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh và hạn chế sự lưu hành của vi khuẩn.
3. Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán vi sinh: Khẳng định giá trị phối hợp của các phương pháp chẩn đoán nhanh (ngưng kết latex, PCR, Real-time PCR) giúp định hướng điều trị sớm, đồng thời duy trì nuôi cấy phân lập phục vụ thử nghiệm kháng sinh đồ và giám sát dịch tễ học phân tử.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Đặc tính khó nuôi cấy của vi khuẩn: H. influenzae có sức chịu đựng rất kém ở môi trường ngoài cơ thể và đòi hỏi khắt khe về điều kiện dinh dưỡng (yếu tố X và V, khí trường $\text{CO}_2$), khiến độ nhạy của phương pháp nuôi cấy chỉ đạt khoảng 50%–55%, có thể dẫn đến việc đánh giá tỷ lệ lưu hành thực tế thấp hơn thực tế nếu khâu bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm không đảm bảo vô trùng và đúng thời gian quy định ($\le 1$ giờ hoặc giữ môi trường bảo quản $\le 24$ giờ ở 4–8°C).
• Yếu tố kỹ thuật lấy mẫu mang trùng: Kỹ thuật ngoáy họng lấy bệnh phẩm ở trẻ nhỏ khó duy trì tính ổn định đồng nhất giữa các đối tượng; nguy cơ nhầm lẫn hình thái khuẩn lạc với các loài vi khuẩn tạp khuẩn đường hô hấp khác trên đĩa thạch phân lập.
• Giới hạn về trang thiết bị và chi phí kỹ thuật phân tử: Kỹ thuật PFGE và Real-time PCR đòi hỏi hệ thống máy móc đắt tiền, hóa chất đặc thù và thời gian xử lý mẫu kéo dài (PFGE mất khoảng 3 ngày), khó áp dụng thường quy tại các bệnh viện tuyến cơ sở.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi thu thập mẫu trên các vùng địa lý khác nhau để theo dõi sự biến động của các dòng vô tính (clones) Hib lưu hành tại Việt Nam qua các giai đoạn.
• Tiếp tục theo dõi dịch tễ học phân tử của H. influenzae sau khi triển khai vacxin Hib diện rộng để đánh giá hiện tượng thay thế typ huyết thanh (serotype replacement) hoặc sự gia tăng của các chủng không vỏ (non-typeable H. influenzae).
• Nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc di truyền học của các plasmid kháng thuốc và các đột biến điểm liên quan đến tính kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam không sinh $\beta$-lactamase (BLNAR).

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Bệnh truyền nhiễm, Y học dự phòng: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn xác về phương pháp luận phân lập, định danh vi khuẩn khó nuôi cấy, phân loại biotype theo Kilian và quy trình phân tích dịch tễ học phân tử bằng PFGE, PCR, Real-time PCR.
• Bác sĩ lâm sàng Nhi khoa và Truyền nhiễm: Cung cấp dữ liệu thực chứng về tính nhạy cảm và kháng thuốc của Hib để lựa chọn kháng sinh kinh nghiệm hợp lý trong điều trị viêm màng não mủ ở trẻ dưới 5 tuổi.
• Cán bộ quản lý y tế và các nhà hoạch định chính sách y tế công cộng: Cung cấp bằng chứng khoa học về gánh nặng bệnh tật và tỷ lệ mang trùng ở các cơ sở mầm non, phục vụ đánh giá hiệu quả của vacxin phòng bệnh do Hib.

Các nội dung đáng tham khảo

• Hệ thống bảng phân loại sinh hóa 8 biotype của Kilian và quy trình thử nghiệm nhu cầu yếu tố X, V.
• Quy trình chuẩn bị mẫu, enzym cắt giới hạn SmaI và tiêu chuẩn phiên giải kết quả điện di trường xung PFGE theo Tenover (1995).
• Tổng hợp so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật chẩn đoán từ nuôi cấy, ngưng kết latex, điện di đối lưu đến sinh học phân tử.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao Haemophilus influenzae bắt buộc phải có cả hai yếu tố X và V mới có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy?

H. influenzae thiếu các con đường sinh tổng hợp độc lập đối với các hợp chất chứa sắt và coenzym chuyển hóa. Yếu tố X (hemin, hematin) là nguồn cung cấp sắt cần thiết để vi khuẩn tổng hợp các enzym hô hấp thiết yếu như catalase, peroxidase và cytochrom trong chuỗi vận chuyển điện tử. Yếu tố V (NAD hoặc NADP) đóng vai trò là coenzym oxy hóa khử cần thiết cho quá trình chuyển hóa nội bào. Thạch chocolate cung cấp đủ cả hai yếu tố này do hồng cầu bị phá hủy bởi nhiệt giúp giải phóng NAD và làm bất hoạt enzym NADase trong máu.

2. Tiêu chuẩn phân loại biotype của Kilian đối với H. influenzae dựa trên những phản ứng sinh hóa nào?

Hệ thống phân loại của Kilian chia H. influenzae thành 8 biotype (từ I đến VIII) dựa trên việc đánh giá đồng thời 3 phản ứng sinh hóa:

1. Thử nghiệm tìm khả năng sinh Indol.
2. Thử nghiệm xác định hoạt tính enzym Urease.
3. Thử nghiệm xác định hoạt tính enzym Ornithin Decarboxylase (ODC).

3. Tiêu chuẩn Tenover et al. (1995) diễn giải mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn qua kỹ thuật PFGE như thế nào?

Dựa trên số lượng băng ADN khác biệt trên thạch điện di:

• 0 băng khác biệt: Các chủng giống nhau hoàn toàn, không thể phân biệt (Indistinguishable), có cùng một chủng nguồn gốc.
• 2–3 băng khác biệt: Có mối liên quan gần (Closely related), phát sinh từ 1 biến cố di truyền (đột biến điểm, mất đoạn hoặc thêm đoạn).
• 4–6 băng khác biệt: Có thể có liên quan (Possibly related), phản ánh 2 biến cố di truyền độc lập.
• $\ge 7$ băng khác biệt: Khác nhau hoàn toàn (Different), không có mối liên quan dịch tễ học do xuất hiện từ 3 biến cố di truyền độc lập trở lên.

4. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Hib tại Việt Nam được ghi nhận ra sao?

Các nghiên cứu tại Việt Nam ghi nhận Hib đề kháng cao với các kháng sinh thông dụng: co-trimoxazole (54,2%–69,6%), ampicillin (40,3%–44,9%) và chloramphenicol (8,1%–40,5%). Tỷ lệ chủng có khả năng sinh enzym $\beta$-lactamase chiếm 59,7%. Ngược lại, các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ 3 (ceftriaxone, cefotaxime), carbapenem (meropenem), fluoroquinolone (levofloxacin) và rifampicin duy trì độ nhạy cảm rất cao, xấp xỉ 100%.

5. Vì sao vacxin polysaccharide PRP đơn thuần kém hiệu quả ở trẻ dưới 18 tháng tuổi và vacxin cộng hợp đã giải quyết hạn chế này như thế nào?

Polysaccharide vỏ PRP là kháng nguyên không phụ thuộc tế bào T typ 2 (TI-2). Ở trẻ dưới 18 tháng tuổi, hệ miễn dịch chưa hoàn thiện khả năng đáp ứng với kháng nguyên carbohydrate độc lập tế bào T, đáp ứng sinh kháng thể rất thấp (chủ yếu là IgM ngắn hạn) và không tạo được trí nhớ miễn dịch khi tiêm nhắc lại. Vacxin cộng hợp liên kết đồng hóa trị PRP với protein mang (như giải độc tố uốn ván, bạch hầu hoặc protein màng ngoài não mô cầu), giúp đại thực bào và tế bào lympho T hỗ trợ nhận diện kháng nguyên, chuyển đổi đáp ứng miễn dịch sang cơ chế phụ thuộc tế bào T, kích thích biệt hóa tương bào sản xuất kháng thể IgG1 có nồng độ cao và tạo tế bào nhớ miễn dịch bền vững cho trẻ nhỏ từ 2 tháng tuổi.

---

Kết luận

Luận án "Đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo" là công trình nghiên cứu chuyên sâu về vi sinh học lâm sàng và dịch tễ học phân tử. Luận án đã giải quyết mục tiêu xác định đặc tính biotype, tình trạng sinh $\beta$-lactamase, mức độ kháng thuốc và kiểu gen PFGE của các chủng Hib gây bệnh cũng như chủng ký sinh ở trẻ khỏe mạnh. Các phát hiện của đề tài cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc lựa chọn phác đồ kháng sinh điều trị viêm màng não và xây dựng chiến lược phòng ngừa bằng vacxin cộng hợp trong y tế công cộng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi Haemophilus influenzae (H.influenzae) được phân lập lần đầu tiên bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria).

Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H.influenzae chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh. Năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của H.influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn H.influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng bởi virus cúm. Xuất phát từ yếu tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) và nhu cầu đòi hỏi những yếu tố phát triển có mặt ở máu (Haemophilus: ưa máu) nên vi khuẩn này có tên gọi H. Đặc điểm sinh học của H.

Hình thể và cấu trúc [19], [89] H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5mm) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể của H. influenzae có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.

influenzae bắt màu Gram âm, không di động và không hình thành nha bào. Thành tế bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của những vi khuẩn Gram 4 âm khác. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). influenzae có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [19], [43], [89].

Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt này có liên quan chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc biệt là H. Bạch cầu đa nhân Hib Hình 1.1 Hình thể của Hib trên tiêu bản nhuộm Gram dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại × 1000) [99]. Trên thực tế, nếu nhuộm Gram bệnh phẩm dịch não tủy mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu đa nhân thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng não do H.

Sức đề kháng [127] H. influenzae là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời 5 chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng.

Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa 24 giờ trong môi trường này. Đặc điểm nuôi cấy [19] Điều kiện nuôi cấy: H. influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy.

Chúng không mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần túy mà là hỗn hợp của các chất có chứa sắt (như hemin và hematin). influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X.

Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 - 1,0 mg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào.

Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phân hủy NAD, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do. Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 mg/ml. influenzae hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO2 (2 - 5%) khi mới phân lập.

Mọc tốt trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu là 370C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu 6 mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy. Cũng trên thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H. influenzae mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé.

Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đã giúp H. influenzae phát triển được thạch máu thông thường.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của H. influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc của S. aureus trên môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc: Để nuôi cấy H.

influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [19], [43], [89], [127]: - Thạch chocolate có hoặc không có 300mg bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phân lập H. Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn này. - Thạch máu thỏ tươi 7% và thạch Levinthal Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt 7 trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 - 24 giờ.

influenzae mọc trên môi trường chocolate Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy, H. influenzae phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1 - 2mm và không gây tan huyết. Vi khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol).

Sau 24 - 48 giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi. Trên môi trường lỏng, H. influenzae thường phát triển làm đục môi trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ).

Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae: Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này có thể được xác định bằng thử nghiệm XV hoặc thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]: 8 (1) (2) Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV (1); thử nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H.

influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển H. influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus khác ở các đặc điểm sau đây: Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H. influenzae với các Haemophilus khác [127]. Tính chất Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 Loài H.

Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và typ sinh học (biotype) của H. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ huyết thanh [19], [43], [89] Năm 1930, H. influenzae được xác định thành 2 nhóm chính, đó là loài không vỏ (không xác được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác 9 định được typ huyết thanh - typeable).

Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của vỏ polysaccharide, vi khuẩn H. influenzae có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a đến f. Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H. influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều nhất là H.

Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ sinh học (biotype) Bảng 1. influenzae theo typ sinh học của Killian [43] Các tính chất hoá học Biotype Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm: tìm khả năng sinh indol, hoạt động của hai enzym urease và decarboxylase của vi khuẩn. Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia H.

influenzae thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng không có vỏ cũng cho kết quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII. influenzae được chia ra làm 8 typ theo tiêu chuẩn của Killian [43].

Miễn dịch [28], [89] Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [89] Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T.