Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi Haemophilus influenzae (Hi) được phân lập lần đầu bởi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria).
Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết Hi chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của Hi mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn Hi chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [11], [32], [78]. Vì vậy, vi khuẩn này có tên Haemophilus influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng, bao gồm các yếu tố phát triển có mặt ở máu (Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm).
Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [11], [78]. Đặc điểm sinh học đặc trưng của Hib 1. Hình thể và cấu trúc [11], [78] Hi là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5mm) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể của Hi có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.
Hi bắt màu Gram âm, không di động và không hình thành nha bào. Thành tế 4 bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của những vi khuẩn Gram âm khác. Tuy nhiên, Hi được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP).
Những polysaccharide bề mặt này có liên quan mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biệt là Hi typ b (Hib), nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả VMN (chiếm trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib). Bạch cầu đa nhân Hi Hình 1.1 Hình thể của Hi trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học [89]. Trên thực tế lâm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu đa nhân thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm VMN do Hi [78]. Sức đề kháng [117] Hi là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh.
Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng. Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC). Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa 24 giờ trong môi trường này.
Đặc điểm nuôi cấy [11] Điều kiện nuôi cấy: Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Chúng không mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin); nếu không có cả hai yếu tố này trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn Hi không phát triển được. Hi dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử.
Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà Hi cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 – 1,0 mg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào.
Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có enzym NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do. Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 mg/ml. 6 Hi hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO2 (2-5%) khi mới phân lập.
Mọc tốt trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23- 390C, tối ưu là 370C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy. Cũng trên thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc Hi mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đã giúp Hi phát triển được thạch máu thông thường.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của vi khuẩn Hi mọc xung quanh khuẩn lạc của S.
aureus trên môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc: Để nuôi cấy Hi, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [11], [32], [78], [117]: - Thạch chocolate có hoặc không có 300mg bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phân lập Hi. 7 Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn này. - Thạch máu thỏ tươi 7% Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 – 24 giờ.3: Khuẩn lạc Hi mọc trên môi trường chocolate Sau 16 – 18 giờ nuôi cấy, Hi phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và không gây tan huyết.
Vi khuẩn Hib luôn vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol). Sau 24 – 48 giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi. Trên môi trường lỏng, Hi thường phát triển làm đục môi trường.
Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ). 8 Haemophilus influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus khác ở các đặc điểm sau đây: Tính chất Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 Loài Hi - + + + H.1: Những đặc điểm sinh học đặc trưng để phân biệt Hi với các Haemophilus khác. Tính chất sinh hóa đặc trưng của Hi: Tính chất sinh hóa đặc trưng của Hi là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [11], [32], [78], [117]: Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển.
Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và biotype của Haemophilus influenzae 1. Đặc điểm phân loại Hi theo serotype (typ huyết thanh) [11], [32], [78] Năm 1930, Hi được xác định thành 2 nhóm chính, đó là loài không vỏ (không xác được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác định được typ huyết thanh - typeable). Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của vỏ polysaccharide, vi khuẩn Hi có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a đến f. Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Hi gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều nhất là Hi typ b.
Đặc điểm phân loại Hi theo biotype (typ sinh học) Các tính chất hoá học Biotype Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Bảng 1.2: Phân loại Haemophilus influenzae theo typ sinh học Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm sinh hoá: tìm khả năng sinh Indol, hoạt động của hai enzym Urease và Decarboxylase của vi khuẩn. Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia Hi thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng Hi không có vỏ cũng cho kết 10 quả tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII.
Vì vậy, Hi được chia ra làm 8 typ như sau theo tiêu chuẩn của Killian (bảng 1. Miễn dịch [17], [78] Kháng thể (Kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [78].