Luận Văn Thạc Sĩ Về Chiết Xuất và Phân Lập Hợp Chất Trong Cây Cỏ Nhọ Nồi (Eclipta alba)

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp cải thiện

• Tác giả: Đinh Thị Nguyệt Ánh
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Hồng Anh
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Chiết Xuất, Phân Lập Và Xác Định Cấu Trúc Một Số Hợp Chất Trong Cây Cỏ Nhọ Nồi (Eclipta alba)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)
• 1.2. Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
• 1.3. Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
• 1.4. Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
• 1.5. Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về chiết xuất và phân lập hợp chất từ cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba

Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) là một trong những loại cây thuốc quý, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra cơ hội nghiên cứu các tác dụng sinh học tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc chiết xuất các hợp chất từ cây cỏ nhọ nồi, xác định cấu trúc và ứng dụng của chúng trong y học.

1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cỏ nhọ nồi

Cỏ nhọ nồi thuộc họ Cúc (Asteraceae), có tên khoa học là Eclipta alba. Cây có chiều cao từ 10-60 cm, thân phân nhánh, lá mọc đối, hoa nhỏ màu trắng. Cây thường mọc hoang ở những nơi ẩm mát và có thể thu hái quanh năm.

1.2. Thành phần hóa học của cỏ nhọ nồi

Cỏ nhọ nồi chứa nhiều hợp chất hóa học như flavonoid, alkaloid, saponin, và coumarin. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có nhiều tác dụng sinh học, từ kháng viêm đến chống ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong chiết xuất hợp chất từ cỏ nhọ nồi

Mặc dù cỏ nhọ nồi có nhiều ứng dụng trong y học, việc chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây này vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự biến đổi của thành phần hóa học theo mùa vụ, điều kiện môi trường và phương pháp chiết xuất có thể ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của sản phẩm chiết xuất.

2.1. Sự biến đổi thành phần hóa học theo mùa vụ

Thành phần hóa học của cỏ nhọ nồi có thể thay đổi theo mùa vụ, ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất. Nghiên cứu cần xác định thời điểm thu hái tối ưu để đảm bảo chất lượng.

2.2. Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất đến chất lượng hợp chất

Các phương pháp chiết xuất khác nhau như sắc ký cột, chiết xuất bằng dung môi có thể cho ra các hợp chất khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả chiết xuất.

III. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ cỏ nhọ nồi

Để chiết xuất và phân lập hợp chất từ cỏ nhọ nồi, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất bằng dung môi, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng hợp chất thu được.

3.1. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi

Chiết xuất bằng dung môi là phương pháp phổ biến nhất, sử dụng các dung môi như ethanol, methanol hoặc nước để chiết xuất các hợp chất từ cây. Phương pháp này giúp thu được nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.2. Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trong phân lập hợp chất

Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng là các phương pháp hiệu quả để phân lập các hợp chất tinh khiết từ dịch chiết. Các phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất dựa trên tính chất hóa học của chúng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hợp chất chiết xuất từ cỏ nhọ nồi

Các hợp chất chiết xuất từ cỏ nhọ nồi đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y học. Chúng có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, và chống ung thư, mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

4.1. Tác dụng kháng viêm và giảm đau

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ cỏ nhọ nồi có tác dụng kháng viêm và giảm đau hiệu quả. Các hợp chất như wedelolactone đã được chứng minh có khả năng giảm đau trong các mô hình thử nghiệm.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh lý

Cỏ nhọ nồi được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh lý như viêm gan, rụng tóc, và các bệnh da liễu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất từ cây có khả năng bảo vệ gan và kích thích mọc tóc.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về cỏ nhọ nồi

Nghiên cứu về cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

5.1. Tương lai của nghiên cứu về hợp chất từ cỏ nhọ nồi

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp chiết xuất hiệu quả hơn và khám phá thêm các hợp chất mới từ cỏ nhọ nồi để phục vụ cho y học.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các hợp chất chiết xuất từ cỏ nhọ nồi trong điều trị bệnh lý, từ đó đưa ra các khuyến nghị cho việc sử dụng trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cỏ nhọ nồi (tên khoa học: Eclipta alba (L.) Hassk. hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae) là cây thuốc mọc hoang phổ biến tại Việt Nam và nhiều nước nhiệt đới. Trong y học cổ truyền, phần trên mặt đất của cây được sử dụng trong các bài thuốc chủ trị chứng xuất huyết (chảy máu cam, nôn ra máu, tử cung xuất huyết), suy nhược, rụng tóc, viêm gan mạn, vết loét và bệnh ngoài da. Nghiên cứu dược lý hiện đại ghi nhận các nhóm hoạt chất trong Cỏ nhọ nồi như coumestan, flavonoid, alkaloid, saponin triterpenoid thể hiện nhiều tác dụng sinh học có giá trị gồm chống viêm, giảm đau, bảo vệ tế bào gan, kháng khuẩn, kháng nấm, điều hòa miễn dịch và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư.

Nhằm làm sáng tỏ cơ sở khoa học về mặt hóa thực vật cho việc sử dụng dược liệu, đề tài "Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)" được thực hiện nhằm giải quyết hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây Cỏ nhọ nồi.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết phân lập được từ phân đoạn này.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Mẫu cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) được thu hái tại tỉnh Thanh Hóa vào tháng 06/2018. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 50–60°C đến độ ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay mịn trước khi tiến hành chiết xuất.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu và Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, hoàn thành vào tháng 03/2019. Giới hạn phạm vi hóa học tập trung vào phân đoạn phân cực trung bình ethyl acetat (EtOAc) tách từ cao chiết toàn phần methanol.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và phân loại thực vật

Theo tài liệu phân loại thực vật của Võ Văn Chi và Đỗ Tất Lợi, cây Cỏ nhọ nồi có vị trí phân loại học thuộc:

• Giới Thực vật: Plantae
• Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
• Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida
• Phân lớp Cúc: Asteridae
• Bộ Cúc: Asterales
• Họ Cúc: Asteraceae
• Loài: Eclipta alba (L.)

Về mặt hóa thực vật, họ Cúc nói chung và chi Eclipta nói riêng chứa hệ thống chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng: coumestan (tiêu biểu là wedelolacton, demethylwedelolacton), alkaloid khung steroid (verazine, dehydroverazine, ecliptalbine), flavonoid (quercetin, luteolin, apigenin), phytosterol (stigmasterol, daucosterol, β-sitosterol), saponin triterpen (eclalbatin, các eclalbasaponin I–X) cùng các dẫn xuất thiophen và polyacetylen.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình hóa thực vật thực nghiệm tiêu chuẩn gồm các kỹ thuật chính:

• Phương pháp chiết xuất: Chiết nóng hồi lưu bột dược liệu với dung môi methanol (MeOH) ở 70°C, lặp lại 3 lần (mỗi lần 3 giờ), tỉ lệ dược liệu/dung môi (DL/DM) là 1/8 (w/v). Dịch chiết gộp được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên thiết bị cô quay chân không để thu cao tổng toàn phần (NTP).
• Phương pháp chiết phân đoạn: Phân tán cao tổng trong nước và chiết lỏng-lỏng phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (EtOAc), mỗi dung môi lắc 3 lần.
• Phương pháp phân lập và tinh chế: Sử dụng sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) pha thường với chất hấp phụ silica gel (kích thước hạt 0,040–0,063 mm, Merck), kết hợp rửa giải đẳng dòng hoặc gradient dung môi dicloromethan - methanol (DCM-MeOH) theo các tỷ lệ khảo sát; kết hợp kỹ thuật kết tinh lại trong dung môi. Quá trình theo dõi phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60G F254 và bản mỏng pha đảo RP-18 F254.
• Phương pháp xác định cấu trúc: Phân tích điểm nóng chảy trên thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy; phân tích phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS); phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều gồm phổ proton ($^1\text{H-NMR}$ tần số 500 MHz), phổ cacbon 13 ($^{13}\text{C-NMR}$ tần số 125 MHz), phổ DEPT, phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (HSQC) và phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC), đo trong dung môi $\text{CD}_3\text{OD}$ hoặc acetone-$d_6$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học đã công bố trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Đặc điểm thực vật: Mô tả hình thái thảo mọc hằng năm, thân cao 10–60 cm có lông cứng; lá mọc đối phiến hình ngọn giáo hoặc bầu dục thuôn; cụm hoa đầu màu trắng ở nách lá hoặc ngọn cành; quả bế dẹt 3 cạnh màu đen. Cây phân bố rộng rãi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 1800 m.
• Thành phần hóa học: Trình bày chi tiết công thức cấu trúc của 34 hợp chất tiêu biểu đã được phân lập từ Eclipta alba thuộc các nhóm alkaloid steroid, coumestan, flavonoid, sterol, saponin triterpen, thiophen và tinh dầu.
• Tác dụng sinh học: Tổng hợp kết quả thử nghiệm dược lý bao gồm tác dụng giảm đau trung tâm và ngoại biên; chống viêm trên mô hình phù chân chuột do carrageenin; kháng các chủng vi khuẩn (S. aureus, E. coli, S. typhimurium) và nấm (Candida albicans, Aspergillus niger); bảo vệ gan chống lại độc tính gây bởi $\text{CCl}_4$; ức chế enzym lysosomal; hoạt tính hạ glucose máu và HbA1c trên chuột đái tháo đường; hoạt tính kích thích mọc tóc của dịch chiết ether vượt trội hơn đối chứng minoxidil 2%; khả năng kháng nọc rắn Malayan Pit Viper và tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư EAC, MDA-MB-231, HeLa.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, trang thiết bị kỹ thuật và quy trình thực nghiệm:

• Dược liệu và hóa chất: Sử dụng 2 kg mẫu Eclipta alba khô (ẩm độ ~5%) thu tại Thanh Hóa; các dung môi kỹ thuật và tinh khiết (MeOH, EtOH, n-hexan, EtOAc, DCM, acetone); thuốc thử hiện màu dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong cồn đốt nóng và dung dịch $\text{FeCl}_3$ 5% trong ethanol; chất chuẩn đối chứng wedelolacton, quercetin, methyl gallat (độ tinh khiết $\ge 98%$).
• Thiết bị sử dụng: Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi), tủ sấy Memmert và Binder-FD115, máy siêu âm Power sonic 405, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, đèn soi tử ngoại Vilber Lourmat (254 nm và 366 nm).
• Quy trình tiến hành: Trình bày chi tiết các bước nhồi cột sắc ký silica gel pha thường, kỹ thuật nạp mẫu khô (trộn cao với silica gel), chế độ rửa giải dung môi và phương pháp thu gom phân đoạn dựa trên sắc ký đồ TLC.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chiết xuất, phân lập và phổ học:

• Kết quả chiết phân đoạn: Từ 2,0 kg dược liệu khô, chiết xuất bằng MeOH thu được 288,3 g cao tổng NTP. Đem 280,0 g cao NTP phân tán vào 2 lít nước cất và lắc phân đoạn lỏng-lỏng thu được:
  • Phân đoạn n-hexan (ký hiệu NH): 20,6 g
  • Phân đoạn ethyl acetat (ký hiệu NE): 60,9 g
  • Phân đoạn nước còn lại (ký hiệu NW): 197,3 g
• Kết quả phân lập: Đưa 60,0 g cao phân đoạn NE lên cột sắc ký silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ gradient DCM-MeOH (100% đến 5/1) thu được 7 phân đoạn chính (NE1 đến NE7). Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn NE4 (5,3 g) với hệ dung môi DCM-MeOH (10/1) thu được phân đoạn phụ NE4.4. Tách phân đoạn NE4.4 qua cột silica gel với hệ DCM-MeOH (8/1) kết hợp kết tinh phân đoạn thu được 3 hợp chất tinh khiết: N01 (426 mg), N02 (112 mg) và N03 (48 mg).
• Biện luận cấu trúc hóa học:
  • Hợp chất N01: Dạng bột màu trắng. Phổ $^1\text{H-NMR}$ thể hiện 1 nhóm methoxy ở $\delta_\text{H} 3,88$ (3H, s, H-15); 2 proton thơm vị trí para tại $\delta_\text{H} 7,35$ (1H, s, H-13) và 7,16 (1H, s, H-10); 2 proton thơm tương tác meta tại $\delta_\text{H} 6,44$ (1H, d, $J=2,5\text{ Hz}$, H-6) và 6,59 (1H, d, $J=2,0\text{ Hz}$, H-8). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ cho 16 tín hiệu cacbon gồm 1 nhóm carbonyl lacton tại $\delta_\text{C} 164,0$ (C-2), 4 nhóm methin thơm ($\delta_\text{C} 94,5 - 106,0$), 10 cacbon bậc bốn kề nối đôi và 1 nhóm methoxy tại $\delta_\text{C} 56,3$. Phổ HMBC xác nhận liên kết của nhóm $-\text{OCH}3$ với C-7 ($\delta\text{C} 164,4$). Cấu trúc được xác định là wedelolacton (5,11,12-trihydroxy-7-methoxycoumestan).
  • Hợp chất N02: Dạng chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313–314°C, giá trị $R_f = 0,35$ (hệ DCM-MeOH 9/1). Hiện màu vàng với thuốc thử $\text{H}2\text{SO}4$ 10% hơ nóng và màu đen với $\text{FeCl}3$ 5%. Phổ $^1\text{H-NMR}$ có hệ thống vân spin ABX của vòng B tại $\delta\text{H} 7,82$ (1H, d, $J=2,0\text{ Hz}$, H-2'), 7,69 (1H, dd, $J=8,5; 2,0\text{ Hz}$, H-6'), 6,99 (1H, d, $J=8,5\text{ Hz}$, H-5') và 2 proton tương tác meta vòng A tại $\delta\text{H} 6,51$ (1H, d, $J=2,0\text{ Hz}$, H-8) và 6,26 (1H, d, $J=2,0\text{ Hz}$, H-6). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ghi nhận 15 cacbon, trong đó có tín hiệu carbonyl tại $\delta\text{C} 176,5$ (C-4), cacbon olefin gắn oxy tại $\delta_\text{C} 136,7$ (C-3) cùng 4 cacbon thơm mang nhóm $-\text{OH}$ ($\delta_\text{C} 145,8 - 164,9$). Cấu trúc được xác định là quercetin (3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone).
  • Hợp chất N03: Dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 201–202°C. Hấp thụ UV ở bước sóng 254 nm, hiện màu nâu với $\text{H}2\text{SO}4$ 10% hơ nóng và màu đen với dung dịch $\text{FeCl}3$ 5%. Phổ $^1\text{H-NMR}$ xuất hiện tín hiệu singlet tích phân 2 proton thơm đối xứng tại $\delta\text{H} 7,07$ (2H, s, H-2 và H-6) và 1 nhóm metyl este tại $\delta\text{H} 3,83$ (3H, s). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ thể hiện 8 cacbon gồm cacbon carbonyl este tại $\delta\text{C} 169,0$ (C-7), cacbon metyl tại $\delta_\text{C} 52,3$, cacbon C-1 ($\delta_\text{C} 121,5$), C-4 ($\delta_\text{C} 139,7$), hai cặp cacbon đối xứng C-2/C-6 ($\delta_\text{C} 110,1$) và C-3/C-5 ($\delta_\text{C} 146,4$). Cấu trúc được xác định là methyl gallat (methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate).
• Bàn luận chuyên môn: Tác giả phân tích tính tối ưu của phương pháp chiết nóng bằng MeOH trong việc thu gom đa dạng hợp chất phân cực, đánh giá khả năng phân tách hiệu quả của phân đoạn ethyl acetat qua sắc ký cột silica gel, đồng thời tổng hợp các tài liệu quốc tế chứng minh hoạt tính sinh học của 3 chất phân lập (khả năng ức chế IKK, chống viêm, kháng nọc rắn của wedelolacton; hoạt tính chống oxy hóa, hạ huyết áp, ức chế tế bào ung thư của quercetin; hoạt tính kháng khuẩn, bảo vệ DNA khỏi stress oxy hóa của methyl gallat).

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các kết quả đạt được về mặt định lượng, cấu trúc của 3 hợp chất phân lập từ Cỏ nhọ nồi thu hái tại Thanh Hóa; đồng thời đưa ra 3 kiến nghị tiếp theo nhằm mở rộng nghiên cứu sang các phân đoạn còn lại, xây dựng quy trình định lượng tiêu chuẩn và thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính thu được

Quá trình xử lý 2,0 kg dược liệu khô Cỏ nhọ nồi đã thu được các sản phẩm và hợp chất với thông số cụ thể:

Mẫu phân đoạn / Hợp chất	Khối lượng thu nhận	Đặc điểm cảm quan & Thông số vật lý	Cấu trúc hóa học xác định
Cao tổng (NTP)	288,3 g	Cao đặc, chiết bằng MeOH ở 70°C	Hỗn hợp toàn phần
Phân đoạn n-hexan (NH)	20,6 g	Phân đoạn kém phân cực	Hỗn hợp lipophilic
Phân đoạn ethyl acetat (NE)	60,9 g	Phân đoạn phân cực trung bình	Hỗn hợp giàu coumestan, flavonoid, phenol
Phân đoạn nước (NW)	197,3 g	Phân đoạn phân cực cao	Hỗn hợp saponin, đường, hợp chất phân cực
Hợp chất N01	426 mg	Dạng bột màu trắng	Wedelolacton ($\text{C}{16}\text{H}{10}\text{O}_7$)
Hợp chất N02	112 mg	Chất rắn màu vàng, đnc: 313–314°C, $R_f=0,35$	Quercetin ($\text{C}{15}\text{H}{10}\text{O}_7$)
Hợp chất N03	48 mg	Chất rắn màu trắng, đnc: 201–202°C	Methyl gallat ($\text{C}_8\text{H}_8\text{O}_5$)

Đóng góp của đề tài

• Xây dựng thành công quy trình chiết xuất phân đoạn và phân lập có hiệu suất cao trên phân đoạn ethyl acetat của cây Cỏ nhọ nồi Việt Nam (Eclipta alba thu hái tại Thanh Hóa).
• Cung cấp đầy đủ bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HMBC, HSQC) và hằng số vật lý đối chiếu chuẩn xác cho 3 hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng: wedelolacton (coumestan chính), quercetin (flavonol) và methyl gallat (dẫn xuất phenolic).

Kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất hóa học từ các phân đoạn còn lại của cây Cỏ nhọ nồi (n-hexan và phân đoạn nước).
• Xây dựng các phương pháp phân tích định lượng chuẩn hóa cho các hợp chất có hoạt tính sinh học nổi bật trong dược liệu.
• Tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học trực tiếp trên các chất tinh khiết đã phân lập được để bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học về cây thuốc.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Đề tài chỉ tập trung khảo sát thành phần hóa học trên một phân đoạn dịch chiết duy nhất là ethyl acetat (NE), chưa tiến hành phân lập sâu trên phân đoạn kém phân cực n-hexan và phân đoạn phân cực cao trong nước. Ngoài ra, nghiên cứu dừng lại ở mức độ phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro hoặc in vivo trực tiếp trên các mẫu chất tinh khiết phân lập được.
• Hướng mở rộng: Mở rộng nghiên cứu quy trình phân tách các hợp chất nhóm alkaloid steroid và saponin triterpenoid trong các phân đoạn còn lại; phát triển quy trình định lượng đồng thời wedelolacton và quercetin bằng HPLC-DAD phục vụ kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa dược liệu Eclipta alba.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Dược học, Hóa học hợp chất thiên nhiên và Hóa thực vật.
• Cán bộ nghiên cứu tại các viện dược liệu, phòng thí nghiệm chiết xuất muốn tham khảo quy trình phân tách sắc ký cột silica gel pha thường và hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH đối với phân đoạn ethyl acetat.
• Cán bộ phân tích cấu trúc hóa học cần đối chiếu số liệu chuyển dịch hóa học phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HMBC) của các khung cấu trúc coumestan (wedelolacton), flavonoid (quercetin) và dẫn xuất acid gallic (methyl gallat).

Câu hỏi thường gặp

1. Khối lượng mẫu dược liệu ban đầu và hiệu suất thu nhận các phân đoạn cao chiết là bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng 2,0 kg bột khô Cỏ nhọ nồi, chiết nóng 3 lần với MeOH ở 70°C thu được 288,3 g cao tổng toàn phần (NTP). Khi phân tán 280,0 g cao NTP vào nước và lắc phân đoạn, khối lượng các cao thành phần thu được lần lượt là: phân đoạn n-hexan đạt 20,6 g; phân đoạn ethyl acetat đạt 60,9 g; phân đoạn nước đạt 197,3 g.

2. Ba hợp chất tinh khiết phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat có tên và hàm lượng như thế nào?
Từ 60,0 g cao ethyl acetat, thông qua sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH, tác giả đã phân lập được 3 hợp chất: N01 (wedelolacton) với khối lượng 426 mg; N02 (quercetin) với khối lượng 112 mg; N03 (methyl gallat) với khối lượng 48 mg.

3. Phương pháp và dữ liệu phổ nào được sử dụng để xác định cấu trúc của hợp chất N01 (Wedelolacton)?
Cấu trúc N01 được xác định qua phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT và HMBC. Phổ proton thể hiện nhóm methoxy ở $\delta_\text{H} 3,88$ (3H, s), hai proton thơm para tại $\delta_\text{H} 7,35$ (H-13) và 7,16 (H-10), hai proton thơm meta tại $\delta_\text{H} 6,44$ (H-6) và 6,59 (H-8). Phổ cacbon ghi nhận 16 tín hiệu (carbon carbonyl C-2 ở $\delta_\text{C} 164,0$, 4 nhóm CH thơm, 10 cacbon bậc 4 và cacbon methoxy ở $\delta_\text{C} 56,3$). Tương tác HMBC giữa nhóm methoxy với C-7 ($\delta_\text{C} 164,4$) khẳng định cấu trúc 5,11,12-trihydroxy-7-methoxycoumestan.

4. Dấu hiệu thực nghiệm và phổ học đặc trưng để nhận dạng hợp chất N02 là Quercetin?
Hợp chất N02 là chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313–314°C, $R_f = 0,35$ (DCM-MeOH 9/1), cho phản ứng màu đen với $\text{FeCl}3$ 5%. Phổ $^1\text{H-NMR}$ thể hiện hệ vân spin ABX đặc trưng của vòng B ($\delta\text{H} 7,82; 7,69; 6,99$) và 2 proton tương tác meta vòng A ($\delta_\text{H} 6,51$ và 6,26). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ chỉ ra 15 cacbon với tín hiệu carbonyl đặc trưng ở $\delta_\text{C} 176,5$ (C-4) và cacbon nối đôi gắn nhóm hydroxyl ở $\delta_\text{C} 136,7$ (C-3).

5. Dữ liệu phổ nào chứng minh hợp chất N03 có cấu trúc đối xứng của dẫn xuất Methyl gallat?
Phổ $^1\text{H-NMR}$ của N03 xuất hiện 1 mũi singlet tích phân 2 proton thơm đối xứng tại $\delta_\text{H} 7,07$ (H-2 và H-6) cùng 1 mũi singlet metyl este tại $\delta_\text{H} 3,83$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ thể hiện tính đối xứng qua hai cặp tín hiệu cacbon tương đương có cường độ mạnh: C-2/C-6 tại $\delta_\text{C} 110,1$ và C-3/C-5 tại $\delta_\text{C} 146,4$, cùng tín hiệu cacbon este ở $\delta_\text{C} 169,0$ và nhóm metyl ở $\delta_\text{C} 52,3$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đinh Thị Nguyệt Ánh đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra trong việc chiết xuất phân đoạn và phân lập hóa thực vật từ cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba). Từ 2,0 kg dược liệu khô thu hái tại Thanh Hóa, nghiên cứu đã phân lập thành công 3 hợp chất sạch từ phân đoạn ethyl acetat gồm wedelolacton (426 mg), quercetin (112 mg) và methyl gallat (48 mg). Toàn bộ cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý của các hợp chất đã được xác định chính xác thông qua hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều và so sánh điểm nóng chảy. Kết quả nghiên cứu đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng, củng cố cơ sở khoa học cho các ứng dụng dược lý và phát triển tiêu chuẩn kiểm nghiệm của dược liệu Cỏ nhọ nồi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae) Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là họ lớn nhất trong lớp này, với hơn 1. Chúng thường tập trung chủ yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệt đới ẩm với độ cao thấp. Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực vật được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trên thế giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8]. Các loài thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín [1].

Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú và đa dạng, sự phát triển của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ. Nguồn thông tin về các hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt của các hợp chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ phân loại ở phân họ và cấp thấp hơn [8].2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 1.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1], [2]. Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có vị trí phân loại như sau: Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida Phân lớp Cúc: Asteridae Bộ Cúc: Asterales Họ Cúc: Asteraceae Loài: Eclipta alba 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [2] Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục, đôi khi hơi đỏ tía, phủ lông cứng. Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục – thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở cả hai mặt.

Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ở nách lá hoặc ở ngọn cành. Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lông tơ ở mặt lưng. Đế hoa lồi, rộng 1 cm. Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡi nhỏ, màu trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5 thùy.

Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen. Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [12] Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất. Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô. Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11.

Mọc hoang ở chỗ ẩm mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m. Phân bố phổ biến khắp nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á, châu Phi. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn. Quy kinh vào can và thận.

Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc. Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêm gan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da. Còn dùng làm thuốc trong viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids, triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol,….Trong lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7- glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol. Rễ chứa hentriacontanol và heptacosanol [15].

Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất n- hexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit triterpenic và wedelolactone [23]. Alkaloid Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính sinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid. Alkaloid chính được xác định là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)-verazine (2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25β-hydroxyverazine (7) và 25β-hydroxyverazine (8) [4].

4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 1 R1=R2=H 2 R1=R2=H 6 R1=OH, R2=H 5 R1=OH, R2=H 8 R1=H, R2=OH 7 R1=H, R2=OH 3 4 Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid b. Coumestan Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật. 9 R=CH3 10 R=H 11 R=Glc Hình 1.

Cấu trúc của các hợp chất Coumestan 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Flavonoid và Sterol Các flavonoid được tìm thấy trong cỏ nhỏ nồi là apigenin (12), luteolin (13), luteolin-7-glucoside (14) và quercetin (15). Các sterol hiện diện trong cỏ nhọ nồi là phytosterol, glucoside của phytosterol, daucosterol (16), β-sitosterol (17), stigmasterol (18) và stigmasterol-3-O-glycoside (19) [56]. 12 13 R1=H, R2=H 14 R1=Glc, R2=H 15 R1=H, R2=OH Hình 1.

Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid 16 R=Glc 18 R=H 17 R=H 19 R=Glc Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất Sterol 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Saponin triterpen Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53]. Yahara và cộng sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (21- 24) [55].

Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III (26-28) và eclalbasaponin V (29) [40]. 25 20 R1=Glc, R2=H, R3=Ara 28 R1=Glc, R2=Glc 26 R1=Glc, R2=OH, R3=Glc 29 R1=SO3H, R2=H 27 R1=Glc, R2=OH, R3=H Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 21 R=H 22 R=H 23 R=SO3H 24 R=SO3 Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 e.

Dẫn xuất thiophen và polyacetylen Năm 1966, F. Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ nhọ nồi. Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba. Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34).

Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tinh dầu Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2- pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene, phytol, octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid, (Z) -7,11- dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9-tetramethyl-1,4,7- cycloundecatriene. D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc α-terthienyl aldehyd, α- terthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31].4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) a. Tác dụng giảm đau, chống viêm Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid toàn phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều 150mg/kg, 250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống.

Tác dụng giảm đau này có hiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47]. Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã được nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng. Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường uống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin (10mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) [9]. Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta alba và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn.

Các nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại Staphylococcus aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18]. Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Hoạt tính kháng nấm in vitro của dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29]. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tác dụng bảo vệ gan Dịch chiết ethanol/nước (1:1) của Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl4 và điều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan (amidopyrine-N- demethylase và glucose-6-phosphatase liên kết màng). Nghiên cứu cho thấy rằng hoạt động bảo vệ gan của Eclipta alba là sự điều chỉnh mức độ của các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan. Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8% và 47,96% enzyme lysosomal. Từ dịch chiết methanol của lá, triterpenoid eclabasaponin làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60,65% lượng CCl4 làm tăng enzyme lysosomal trong máu.

Coumestan và saponin triterpenoid từ dịch chiết chloroform của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41% nồng độ CCl4. Eclipta alba được báo cáo là có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan cấp tính do CCl4, bằng cách làm giảm hoại tử, thoái hóa của các tế bào nhu mô gan [48], [50]. Tác dụng lên thần kinh và chống độc Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng dịch chiết Eclipta alba với liều 300 mg/kg cho thấy hoạt động của các chất cải thiện khả năng hoạt động của hệ thần kinh ở chuột [51]. Chiết xuất ethyl acetate của Eclipta alba và wedelolactone đã chứng minh hoạt tính chống tăng huyết áp và chống lại nọc độc rắn Malaya Pit Viper [44].

Hoạt tính chống sốt rét của dịch chiết từ lá Eclipta alba đã được đánh giá là chống lại chủng Plasmodium berghei ANKA ở chuột [10]. Hoạt động diều hòa miễn dịch Các nghiên cứu sơ bộ đã cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch của dịch chiết methanol của Eclipta alba. Wedelolactone và demethylwedelolactone, được phân lập từ Eclipta alba đã chứng minh tác dụng ức chế trypsin. Cả hai hợp chất cho thấy hoạt động mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,9 và 3,0 μg/ml, tương ứng.

Eclipta alba có tác dụng bảo vệ các mô thần kinh có thể là do hoạt động điều hòa miễn dịch của Eclipta alba. Do đó, Eclipta alba có thể phục vụ như một bộ điều biến bộ nhớ tiềm năng.