Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái

Nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. 67 trang · Đại học Dược Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Bùi Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Thuận
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu và ảnh hưởng của thời gian thu hái
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ CỦ DÒM
• 2.1. Đặc điểm thực vật
• 2.2. Thành phần hóa học
• 2.3. Tác dụng sinh học của S.Wu và oxostephanin
• 2.3.1. Tác dụng sinh học của S.Wu
• 2.3.2. Tác dụng sinh học của oxostephanin
• 2.4. Các phương pháp định lượng oxostephanin
• 2.5. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích
• 2.5.1. Độ phù hợp hệ thống
• 2.5.2. Độ đặc hiệu
• 2.5.3. Độ đúng
• 2.5.4. Độ chính xác
• 2.5.5. Khoảng tuyến tính
• 2.5.6. Khoảng xác định
• 2.5.7. Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi
• 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
• 3.2.2. Khảo sát lại phương pháp phân tích
• 3.2.3. Thẩm định lại phương pháp phân tích
• 3.2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.4.1. Lựa chọn phương pháp phân tích
• 3.2.4.2. Thẩm định quy trình phân tích
• 3.2.5. Ứng dụng thực tế
• 3.2.5.1. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
• 4.1.1. Khảo sát số lần chiết
• 4.1.2. Khảo sát lượng dung môi chiết
• 4.1.3. Khảo sát thời gian chiết
• 4.2. Khảo sát lại phương pháp phân tích
• 4.2.1. Lựa chọn pha động
• 4.2.2. Khảo sát lại tỷ lệ pha động
• 4.2.3. Khảo sát bước sóng phát hiện
• 4.3. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin bằng HPLC
• 4.3.1. Độ phù hợp hệ thống
• 4.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 4.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 4.4. Kết luận về phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu
• 4.5. Ứng dụng thực tế
• 4.5.1. Về phương pháp xử lý mẫu
• 4.5.2. Về lựa chọn và xác định phương pháp
• 4.5.3. Về thẩm định phương pháp phân tích
• 4.5.4. Về ứng dụng thực tế
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu

Nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Oxostephanin là một hoạt chất có nguồn gốc từ cây củ dòm (Stephania dielsiana Y.Wu), được biết đến với nhiều tác dụng sinh học, đặc biệt là khả năng chống ung thư. Việc xác định hàm lượng oxostephanin trong dược liệu không chỉ giúp đánh giá chất lượng sản phẩm mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Thời gian thu hái cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất này trong dược liệu.

1.1. Đặc điểm thực vật của cây củ dòm

Cây củ dòm (Stephania dielsiana Y.Wu) thuộc họ Tiết dê, có nhiều đặc điểm nổi bật như củ thuôn dài, lá hình khiên và hoa nhỏ. Cây này phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam và có thể sống ở nhiều loại địa hình khác nhau. Đặc điểm thực vật của cây củ dòm ảnh hưởng đến quá trình thu hái và chất lượng dược liệu.

1.2. Tác dụng sinh học của oxostephanin

Nghiên cứu cho thấy oxostephanin có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư như HeLa, HepG2 và OVCAR-8. Hoạt chất này được phân lập từ củ và lá của cây củ dòm, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng oxostephanin có tác dụng giảm đau và chống viêm, mở ra hướng đi mới trong y học.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu oxostephanin

Mặc dù oxostephanin có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu và định lượng hoạt chất này trong dược liệu vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn là thiếu các phương pháp phân tích chính xác và đáng tin cậy. Ngoài ra, sự biến đổi hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái cũng là một yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Thiếu hụt phương pháp định lượng chính xác

Hiện nay, các phương pháp định lượng oxostephanin chủ yếu dựa vào HPLC và HPTLC. Tuy nhiên, HPTLC có độ lặp lại kém và sai số lớn hơn so với HPLC. Việc thiếu các tiêu chuẩn phân tích rõ ràng trong dược điển cũng làm cho việc định lượng trở nên khó khăn.

2.2. Ảnh hưởng của thời gian thu hái đến hàm lượng oxostephanin

Thời gian thu hái có thể ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng oxostephanin trong dược liệu. Các nghiên cứu cho thấy rằng hàm lượng hoạt chất này có thể thay đổi theo mùa vụ và thời điểm thu hái. Do đó, việc xác định thời điểm thu hái tối ưu là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng dược liệu.

III. Phương pháp nghiên cứu định lượng oxostephanin hiệu quả

Để nghiên cứu định lượng oxostephanin, các phương pháp phân tích hiện đại như HPLC đã được áp dụng. Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng hoạt chất với độ chính xác cao và thời gian phân tích ngắn. Việc thẩm định quy trình phân tích cũng rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

3.1. Thẩm định phương pháp HPLC trong định lượng oxostephanin

Thẩm định phương pháp HPLC bao gồm các chỉ tiêu như độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác. Việc thực hiện thẩm định này giúp xác định khả năng của phương pháp trong việc phân tích oxostephanin trong dược liệu.

3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích

Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm và thời gian chiết cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Việc khảo sát các yếu tố này giúp tối ưu hóa quy trình phân tích và nâng cao độ chính xác của kết quả định lượng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu oxostephanin

Nghiên cứu về oxostephanin không chỉ có giá trị trong lĩnh vực dược liệu mà còn mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Việc xác định hàm lượng oxostephanin trong dược liệu có thể giúp phát triển các sản phẩm thuốc mới, đồng thời nâng cao hiệu quả điều trị ung thư.

4.1. Phát triển sản phẩm thuốc từ oxostephanin

Các nghiên cứu cho thấy oxostephanin có khả năng chống ung thư mạnh mẽ. Việc phát triển các sản phẩm thuốc từ hoạt chất này có thể mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân ung thư, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống và tăng cường hiệu quả điều trị.

4.2. Tăng cường nghiên cứu và ứng dụng trong y học

Nghiên cứu về oxostephanin cần được mở rộng để khám phá thêm các tác dụng sinh học và cơ chế hoạt động của hoạt chất này. Việc tăng cường nghiên cứu sẽ giúp phát triển các liệu pháp điều trị mới và nâng cao hiệu quả trong việc điều trị các bệnh lý liên quan.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu oxostephanin

Nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự phát triển của các phương pháp phân tích hiện đại, việc xác định hàm lượng oxostephanin sẽ ngày càng trở nên chính xác hơn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành dược và y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu oxostephanin trong dược liệu

Nghiên cứu về oxostephanin sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các phương pháp phân tích mới và cải thiện quy trình thu hái. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng dược liệu và đảm bảo tính hiệu quả của các sản phẩm thuốc.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong lĩnh vực dược liệu

Định hướng nghiên cứu trong lĩnh vực dược liệu cần tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ oxostephanin và các hoạt chất khác có nguồn gốc tự nhiên. Việc này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên toàn cầu với gần 9,8 triệu ca tử vong. Sự gia tăng của hiện tượng kháng thuốc hóa trị đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính sinh học mới. Trong số các hợp chất tự nhiên, oxostephanin – một alkaloid thuộc nhóm aporphin phân lập từ loài củ dòm (Stephania dielsiana Y.Wu, họ Menispermaceae) – đã được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư thực nghiệm.

Dù có tiềm năng dược lý đáng kể, các chuyên luận về dược liệu củ dòm cũng như oxostephanin hiện chưa xuất hiện trong Dược điển Việt Nam hay các dược điển quốc tế khác. Số lượng nghiên cứu định lượng hoạt chất này trong cây còn hạn chế; một số nghiên cứu trước đây dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có độ lặp lại kém, sai số tương đối cao và chịu ảnh hưởng lớn từ điều kiện môi trường, trong khi phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) gradient sẵn có lại đòi hỏi thời gian rửa giải kéo dài và hệ dung môi phức tạp.

Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Bùi Văn Sơn thực hiện tại Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (năm 2022) nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

1. Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng khảo sát hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu hái tại các thời điểm khác nhau trong năm.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hoạt chất oxostephanin trong bộ phận thân lá của cây củ dòm (Stephania dielsiana Y.Wu). Về phạm vi không gian và thời gian, các mẫu dược liệu được thu thập tại thành phố Bắc Giang ở 9 mốc thời gian trải đều trong năm 2020 (ngày 1/2, 29/2, 29/3, 3/5, 31/5, 6/9, 8/10, 14/11 và 14/12) và khảo sát bổ sung tại Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội ở hai mốc tháng 5 và tháng 10 năm 2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và các căn cứ tiêu chuẩn

Nghiên cứu dựa trên cơ sở hóa học và phân loại thực vật học của loài Stephania dielsiana Y.Wu, loài dây leo có củ thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae). Hợp chất oxostephanin có danh pháp IUPAC là 9-methoxy-8H-[1,3]dioxolo[4',5':4,5]benzo[1,2,3-de]benzo[g]quinolin-8-on; công thức phân tử C18H11NO4 (khối lượng phân tử 305,3 đvC), tồn tại dạng tinh thể hình kim màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 160–162°C, không tan trong nước nhưng tan trong methanol, diclomethan và tan tốt khi dịch chiết được acid hóa.

Về mặt quy chuẩn phân tích, quy trình thẩm định được thiết kế hoàn toàn dựa theo:

• "Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích" (ban hành kèm theo Phụ lục 1, Thông tư 32/2018/TT-BYT của Bộ Y tế).
• Hướng dẫn thẩm định phương pháp của Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức (AOAC 2016).
• Các tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm được đối chiếu theo Dược điển Việt Nam V.

Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm phân tích

Khóa luận thuộc dạng nghiên cứu thực nghiệm phân tích kiểm nghiệm hóa dược kết hợp ứng dụng trên mẫu thực địa.

• Phương pháp chiết tách và xử lý mẫu: Sử dụng kỹ thuật chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm với dung môi methanol (MeOH). Đề tài khảo sát thực nghiệm 3 thông số: số lần chiết (1 đến 4 lần), lượng dung môi chiết (tỷ lệ thể tích dung môi/khối lượng dược liệu từ 100:1 đến 400:1 ml/g), và thời gian chiết siêu âm (1 đến 4 giờ).
• Phương pháp phân tích công cụ: Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) kết hợp đầu dò DAD (Diode Array Detector). Thiết bị sử dụng là hệ thống HPLC Shimadzu (model L20155518195), cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm; kích thước hạt 5 µm).
• Thẩm định phương pháp: Đánh giá đầy đủ các chỉ tiêu định lượng theo AOAC và ASEAN: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng (phương pháp thêm chuẩn với 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120%), độ chính xác (độ lặp lại trong ngày, độ chính xác trung gian giữa 3 ngày phân tích và giữa 2 kiểm nghiệm viên khác nhau), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) dựa trên tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N).
• Xử lý số liệu: Thu thập và tính toán thống kê (trung bình, độ lệch chuẩn SD, độ lệch chuẩn tương đối RSD%) trên phần mềm Microsoft Excel 2019.

Nguồn vật liệu và hóa chất

• Chất chuẩn: Chất chuẩn đối chiếu oxostephanin có độ tinh khiết 99,0% (HPLC) do Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam cung cấp.
• Hóa chất, dung môi: Methanol loại dùng cho sắc ký HPLC (hãng Merck KGaA, Đức); acid formic (hãng Xilong Scientific Co.); nước cất 2 lần điều chế từ máy cất nước Hamilton (Anh).
• Mẫu dược liệu: Bộ phận thân lá cây củ dòm thu hái tự nhiên tại Bắc Giang và Ba Vì.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Phần mở đầu nêu rõ tầm quan trọng của việc nghiên cứu hoạt chất oxostephanin có nguồn gốc từ tự nhiên với hoạt tính kháng u trên các dòng ung thư gan (HepG2, Hep-2), ung thư biểu mô vú (MDA), ung thư buồng trứng (OVCAR-8), ung thư cổ tử cung (HeLa) và ung thư phổi (LU, H358) với IC50 dao động 1,66–4,35 µM. Tác giả chỉ ra khoảng trống về quy chuẩn định lượng oxostephanin trong dược liệu, từ đó xác lập 2 nhiệm vụ nghiên cứu trọng tâm của khóa luận.

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng hợp các tư liệu khoa học về loài Stephania dielsiana Y.Wu:

• Đặc điểm thực vật: Phân biệt củ dòm với củ bình vôi qua hình thái củ thuôn dài nằm nổi ngang mặt đất giống gà mái ấp trứng, vết cắt có màu vàng rõ, ít xơ, vị đắng và tê hơn; phiến lá hình khiên cuống đính 2/3 phiến lá, có dịch nhựa màu tím hồng.
• Thành phần hóa học: Tổng thuật các công bố từ năm 2009 đến 2020 của Zhang Yi (phân lập 12 hợp chất), Yecheng Deng (phân lập các alkaloid kháng khuẩn nhóm aporphin), Nguyễn Quốc Huy (phân lập 21 hợp chất, lần đầu tiên tách được oxostephanin và dehydrocrebanin từ loài này) và James Knockleby (đánh giá độc tính tế bào của 7 alkaloid).
• Các phương pháp định lượng: Phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp định lượng đã công bố gồm HPTLC (hệ dung môi CHCl3 : MeOH 9:1, bước sóng 366 nm) và 2 quy trình HPLC (sắc ký rửa giải gradient với pha động ACN - đệm phosphat pH 3,0 và sắc ký đẳng dòng MeOH : HCOOH 0,1% tỷ lệ 35:65). Đồng thời, chương này hệ thống hóa các khái niệm, yêu cầu kỹ thuật và công thức toán học phục vụ công tác thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của ASEAN và AOAC.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết thông số thiết bị, nguồn gốc hóa chất, quy trình pha mẫu và các bước thực nghiệm:

• Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc oxostephanin 1000 µg/ml trong MeOH bằng siêu âm 30 phút, bảo quản ở 0–4°C; từ đó pha loãng thành dung dịch làm việc 100 µg/ml và dãy chuẩn làm việc từ 1,97 đến 98,5 µg/ml.
• Dung dịch thử: Dược liệu sấy khô không quá 60°C, xay nhỏ; cân chính xác khoảng 0,5000 g chiết siêu âm với MeOH, lọc và định mức đến 100,0 ml, lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm.
• Phương pháp thẩm định: Thiết lập quy trình đánh giá thực nghiệm cho 6 chỉ tiêu kỹ thuật chính (độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, LOD/LOQ).

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Đây là nội dung thực nghiệm trọng tâm của khóa luận, gồm 4 phần:

1. Khảo sát quá trình xử lý mẫu

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết oxostephanin từ dược liệu được tổng hợp qua các bước:

• Số lần chiết: Hàm lượng hoạt chất tăng từ 0,347% (chiết 1 lần) lên 0,423% (2 lần), 0,456% (3 lần) và 0,462% (4 lần). Chênh lệch giữa 3 lần và 4 lần chỉ là 1,3%, do đó tác giả lựa chọn số lần chiết là 3 lần.
• Lượng dung môi chiết: Khảo sát trên 0,2500 g dược liệu với tổng dung môi 25 ml (tỷ lệ 100:1 ml/g đạt 0,362%), 50 ml (tỷ lệ 200:1 ml/g đạt 0,423%) và 100 ml (tỷ lệ 400:1 ml/g đạt 0,425%). Lựa chọn tỷ lệ dung môi/dược liệu tối ưu là 200:1 (ml/g).
• Thời gian chiết: Hiệu suất chiết tại 1 giờ đạt 0,321%, 2 giờ đạt 0,370%, 3 giờ đạt 0,442% và 4 giờ đạt 0,443%. Tác giả chọn thời gian chiết tổng cộng 3 giờ (chiết 3 lần, mỗi lần 1 giờ với thể tích dung môi lần lượt là 40 ml, 30 ml, 30 ml).

Thông số khảo sát	Mức khảo sát	Hàm lượng OXO thu được (%)	Điều kiện được lựa chọn
Số lần chiết	1 lần 2 lần 3 lần 4 lần	0,347 ± 0,013 0,423 ± 0,003 0,456 ± 0,001 0,462 ± 0,000	Chiết 3 lần (đạt 0,456%)
Lượng dung môi (ml/0,25 g mẫu)	25 ml (100:1) 50 ml (200:1) 100 ml (400:1)	0,362 ± 0,006 0,423 ± 0,001 0,425 ± 0,002	50 ml (tỷ lệ 200:1 ml/g)
Thời gian chiết	1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ	0,321 ± 0,005 0,370 ± 0,029 0,442 ± 0,013 0,443 ± 0,021	3 giờ (3 lần x 1 giờ)

2. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký

• Pha động: Thử nghiệm pha động gradient ACN và đệm phosphat - TEA pH 3,0 cho thấy pic oxostephanin dính pic tạp và thời gian lưu kéo dài. Pha động hỗn hợp MeOH và dung dịch acid formic 0,1% cho pic đối xứng.
• Tỷ lệ pha động: Ở tỷ lệ MeOH : HCOOH 0,1% (35:65), thời gian lưu của hoạt chất lên tới khoảng 22 phút. Khi điều chỉnh tỷ lệ lên 40:60 (v/v), thời gian lưu giảm xuống còn khoảng 14 phút (trên thực tế mẫu thử chuẩn là 15,5 phút), pic tách hoàn toàn khỏi tạp chất nền với độ phân giải Rs > 1,5.
• Thời gian phân tích: Do sau 25 phút không xuất hiện pic phụ, thời gian sắc ký được rút ngắn từ 50 phút xuống 25 phút.
• Bước sóng phát hiện: Quét phổ tử ngoại cho 3 cực đại hấp thụ ở 256 nm, 287 nm và 325 nm. Tác giả chọn bước sóng 254 nm theo đúng quy định dung sai quang phổ (λmax ± 2 nm) của Dược điển Việt Nam V.

3. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

• Độ phù hợp hệ thống: Tiêm 6 lần nhắc lại dung dịch chuẩn OXO 25 µg/ml: thời gian lưu trung bình đạt 15,52 phút (RSD = 0,3%); diện tích pic trung bình đạt 2.850.831 mAU.s (RSD = 0,1%); số đĩa lý thuyết trung bình đạt 4.247; hệ số đối xứng trung bình đạt 1,445 (RSD = 0,2%). Toàn bộ chỉ số đều thỏa mãn yêu cầu RSD < 2,0%.
• Độ đặc hiệu: Mẫu dung môi không có tín hiệu tại thời gian lưu của OXO. Mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn có thời gian lưu trùng khớp. Hệ số chồng phổ tử ngoại (match factor) giữa pic trong mẫu thử và mẫu chuẩn đạt 0,9993 (> 0,999). Độ phân giải pic OXO với các pic tạp đạt Rs = 1,7 (> 1,5).
• Độ tuyến tính: Khảo sát trên dải 7 nồng độ (1,97; 4,925; 9,85; 19,7; 24,625; 49,25; 98,5 µg/ml). Phương trình hồi quy tuyến tính: Y = 115.082,64x + 7.938,73 với hệ số tương quan R² ≈ 1,0000; độ chệch (bias) của các điểm nằm trong giới hạn từ -6,27% đến +0,66% (đáp ứng tiêu chuẩn ± 15%).
• Độ đúng: Thử nghiệm thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ, mỗi mức 6 mẫu độc lập. Tỷ lệ thu hồi trung bình đạt:
  • Mức 80% (tương ứng 20 ppm): thu hồi 99,9% (RSD = 3,0%).
  • Mức 100% (tương ứng 25 ppm): thu hồi 98,9% (RSD = 1,4%).
  • Mức 120% (tương ứng 30 ppm): thu hồi 100,6% (RSD = 1,1%). (Đạt yêu cầu quy định: thu hồi 95,0% – 105,0%, RSD ≤ 3,7%).
• Độ chính xác:
  • Độ lặp lại giữa các ngày (3 ngày, mỗi ngày 6 mẫu): hàm lượng trung bình 3 ngày đạt 0,501% với RSD = 2,5% (trong đó Ngày 1 đạt 0,509%, RSD = 2,4%; Ngày 2 đạt 0,504%, RSD = 1,8%; Ngày 3 đạt 0,490%, RSD = 1,7%).
  • Độ chính xác trung gian giữa 2 người phân tích: Người 1 đạt trung bình 0,511% (RSD = 1,6%), Người 2 đạt 0,504% (RSD = 1,8%). Giá trị trung bình chung của 2 người là 0,508% với RSD = 1,7% (đáp ứng tiêu chuẩn RSD ≤ 3,7%).
• LOD và LOQ: Xác định theo tỷ lệ S/N tiêm lặp lại 6 lần:
  • Nồng độ 0,0246 µg/ml cho S/N trung bình = 3,37 (RSD = 9,0%) -> xác định là LOD.
  • Nồng độ 0,0860 µg/ml cho S/N trung bình = 10,96 (RSD = 7,2% < 8,0%) -> xác định là LOQ.

4. Ứng dụng định lượng theo thời gian thu hái

Áp dụng phương pháp phân tích đã thẩm định để định lượng mẫu thân lá củ dòm tại thành phố Bắc Giang qua 9 thời điểm thu hái trong năm 2020:

Ký hiệu mẫu	Địa điểm lấy mẫu	Thời gian thu hái	Hàm lượng OXO trung bình (%)	RSD (%)
D1	TP Bắc Giang	01/02/2020	0,353	4,1
D2	TP Bắc Giang	29/02/2020	0,611	2,0
D3	TP Bắc Giang	29/03/2020	0,337	7,4
D4	TP Bắc Giang	03/05/2020	0,430	1,4
D5	TP Bắc Giang	31/05/2020	0,597	3,9
D6	TP Bắc Giang	06/09/2020	0,873	2,3
D7	TP Bắc Giang	08/10/2020	0,819	0,5
D8	TP Bắc Giang	14/11/2020	0,501	1,4
D9	TP Bắc Giang	14/12/2020	0,525	2,9

Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng oxostephanin có xu hướng tích lũy tăng dần từ tháng 3 (0,337%) đến đỉnh điểm vào tháng 9 (0,873%) và tháng 10 (0,819%), sau đó suy giảm vào các tháng mùa đông (tháng 11 đạt 0,501% và tháng 12 đạt 0,525%). Từ đó, tác giả đưa ra nhận định sơ bộ rằng thời điểm thu hái dược liệu tối ưu tại Bắc Giang là từ giữa tháng 9 đến giữa tháng 10.

Đối với các mẫu tại Tản Lĩnh (Ba Vì), kết quả định lượng ở hai thời điểm tháng 5 và tháng 10 lần lượt đạt 0,556 ± 0,023% và 0,553 ± 0,025%.

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Tổng kết toàn bộ các mục tiêu nghiên cứu đã đạt được về quy trình chiết mẫu, bộ thông số thẩm định HPLC hoàn chỉnh và kết quả khảo sát sự tích lũy hoạt chất theo mùa; đồng thời đề xuất 3 hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện dữ liệu về vùng trồng và tiêu chuẩn hóa dược liệu.

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng cụ thể

1. Quy trình chiết xuất tối ưu: Đã xác định được điều kiện xử lý mẫu triệt để: chiết siêu âm 3 lần bằng methanol (thể tích 40, 30, 30 ml cho 0,5 g dược liệu, tương ứng tỷ lệ 200:1 ml/g), mỗi lần 1 giờ. Quy trình này giúp tăng hiệu suất thu hồi hoạt chất thêm 25% so với phương pháp chiết 1 lần/1 giờ của các tài liệu trước đây (tăng từ 0,347% lên 0,456%).
2. Quy trình HPLC phân tích hoàn chỉnh:
   • Cột sắc ký: Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
   • Pha động: MeOH : dung dịch acid formic 0,1% (40:60, v/v), rửa giải đẳng dòng.
   • Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; nhiệt độ cột: phòng; detector DAD tại bước sóng 254 nm; thời gian chạy: 25 phút.
3. Bộ dữ liệu thẩm định đạt chuẩn AOAC và ASEAN:
   • Hệ số tương quan đường chuẩn: R² ≈ 1,0000 trong khoảng 1,97 – 98,50 µg/ml.
   • Độ đúng: Tỷ lệ tìm lại đạt 98,9% – 100,6% (RSD = 1,1% – 3,0%).
   • Độ chính xác: RSD độ lặp lại và độ chụm trung gian dao động từ 1,6% đến 2,5%.
   • Giới hạn phát hiện LOD = 0,0246 µg/ml; giới hạn định lượng LOQ = 0,0860 µg/ml.
4. Quy luật tích lũy hàm lượng: Khảo sát hàm lượng hoạt chất trong 9 tháng tại Bắc Giang cho thấy hoạt chất đạt mức cao nhất vào tháng 9 (0,873%) và tháng 10 (0,819%), thấp nhất vào tháng 3 (0,337%).

Đóng góp so với các nghiên cứu trước đây

• So với phương pháp chiết lỏng - lỏng phức tạp trong nghiên cứu của Nguyễn Vũ Minh (2014), quy trình chiết siêu âm trực tiếp bằng MeOH trong đề tài đơn giản hơn, dễ thực hiện, giảm thiểu thao tác trung gian và hạn chế sai số phân tích.
• So với quy trình sắc ký gradient của Nguyễn Quốc Huy (2010), phương pháp đẳng dòng của đề tài có đường nền ổn định hơn, không tốn thời gian cân bằng lại cột sau mỗi mẻ tiêm.
• So với phương pháp HPLC của Tống Minh Thảo (2019) (dùng tỷ lệ MeOH : HCOOH 35:65 với thời gian chạy kéo dài 50 phút), việc nâng tỷ lệ dung môi hữu cơ lên 40:60 đã rút ngắn thời gian phân tích xuống còn 25 phút (giảm 10–25 phút sắc ký), giúp tiết kiệm dung môi và thời gian phân tích trong phòng kiểm nghiệm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế do điều kiện thực địa khách quan:

• Trong năm 2020, thời tiết quá nắng nóng khiến cây củ dòm (vốn là thực vật ưa bóng) bị lụi tàn vào các tháng 6, tháng 7 và tháng 8, dẫn đến việc không thu thập được mẫu dược liệu của 3 tháng này tại Bắc Giang. Do đó, kết luận về chu kỳ tích lũy hoạt chất trong năm mới dừng lại ở mức độ sơ bộ.
• Số lượng mẫu thu thập tại Ba Vì còn rất hạn chế (chỉ có 2 thời điểm tháng 5 và tháng 10), chưa đủ cơ sở dữ liệu để so sánh, đối chiếu sự biến thiên hàm lượng giữa các vùng sinh thái khác nhau.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tiếp tục theo dõi, lấy mẫu bổ sung để đánh giá đầy đủ sự biến động hàm lượng oxostephanin qua toàn bộ 12 tháng trong năm.
• Mở rộng phạm vi nghiên cứu để đánh giá hàm lượng oxostephanin theo vùng địa lý, điều kiện canh tác, các bộ phận khác nhau của cây và theo độ tuổi phát triển của cây củ dòm.
• Chuẩn hóa quy trình phân tích để phục vụ việc xây dựng chuyên luận kiểm nghiệm củ dòm đưa vào Dược điển Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên ngành Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc: Tham khảo mô hình thực nghiệm chuẩn mực về thẩm định quy trình định lượng hoạt chất tự nhiên theo hướng dẫn của ASEAN và AOAC, từ các bước xây dựng công thức toán đến đánh giá độ chụm trung gian, độ thu hồi và LOD/LOQ.
• Nhà nghiên cứu Dược liệu và Dược học cổ truyền: Sử dụng các thông số chiết xuất (3 lần x 1 giờ, tỷ lệ 200:1 ml/g) và điều kiện sắc ký đẳng dòng để định lượng nhanh oxostephanin mà không cần hệ thống gradient phức tạp.
• Đơn vị trồng trọt và thu hái dược liệu: Cung cấp dữ liệu thực tế về thời điểm thu hái tối ưu (giữa tháng 9 đến tháng 10) nhằm thu được dược liệu có hàm lượng oxostephanin cao nhất, phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại thay đổi tỷ lệ pha động từ 35:65 sang 40:60?

Trong nghiên cứu tham khảo trước đây, pha động MeOH : acid formic 0,1% tỷ lệ 35:65 (v/v) cho thời gian lưu của oxostephanin tương đối dài (khoảng 22 phút), dẫn đến tổng thời gian phân tích kéo dài đến 50 phút. Việc tăng tỷ lệ methanol lên 40:60 giúp tăng lực rửa giải, rút ngắn thời gian lưu của oxostephanin xuống khoảng 14–15,5 phút mà vẫn đảm bảo độ phân giải tách biệt hoàn toàn khỏi pic tạp nền (Rs = 1,7 > 1,5), cho phép rút ngắn thời gian phân tích mỗi mẫu xuống còn 25 phút.

2. Phương pháp chiết mẫu siêu âm trong đề tài có ưu điểm gì so với các nghiên cứu trước?

So với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Minh (sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng nhiều bước), phương pháp chiết siêu âm với MeOH trong đề tài có quy trình chuẩn bị đơn giản hơn, thao tác nhanh và giảm thiểu sai số phân tán. Đồng thời, so với nghiên cứu của Tống Minh Thảo (chỉ chiết 1 lần trong 1 giờ), việc khảo sát và nâng lên chiết 3 lần x 1 giờ với tỷ lệ dung môi 200:1 (ml/g) đã giúp chiết kiệt hoạt chất hơn, làm tăng hàm lượng oxostephanin thu được thêm 25% (từ 0,347% lên 0,456%).

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu?

Theo kết quả thực nghiệm dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N):

• Giới hạn phát hiện (LOD) là 0,0246 µg/ml (tín hiệu gấp khoảng 3 lần nhiễu nền, S/N trung bình đạt 3,37 với RSD = 9,0%).
• Giới hạn định lượng (LOQ) là 0,0860 µg/ml (tín hiệu gấp khoảng 10 lần nhiễu nền, S/N trung bình đạt 10,96 với RSD = 7,2% < 8,0%).

4. Dược liệu thu hái vào thời điểm nào trong năm cho hàm lượng oxostephanin cao nhất?

Số liệu khảo sát tại thành phố Bắc Giang năm 2020 cho thấy hàm lượng oxostephanin đạt đỉnh cao nhất vào ngày 06/09 (đạt 0,873%) và ngày 08/10 (đạt 0,819%), trong khi thấp nhất vào ngày 29/03 (chỉ đạt 0,337%). Do đó, thời điểm thích hợp nhất để thu hái thân lá củ dòm nhằm đạt hàm lượng hoạt chất tối đa là vào khoảng từ giữa tháng 9 đến giữa tháng 10.

5. Vì sao không có số liệu định lượng dược liệu trong các tháng 6, 7 và 8?

Do điều kiện thời tiết thực tế tại miền Bắc trong năm 2020 xuất hiện nắng nóng kéo dài, cây củ dòm là loài thực vật ưa bóng mát dưới tán rừng nên đã bị lụi tàn tự nhiên trong mùa hè. Do đó, người nghiên cứu không thể thu thập được mẫu thân lá của loài cây này trong 3 tháng nói trên tại địa điểm Bắc Giang.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Bùi Văn Sơn đã hoàn thiện quy trình chiết xuất và thẩm định thành công phương pháp định lượng oxostephanin trong thân lá cây củ dòm bằng kỹ thuật HPLC pha đảo rửa giải đẳng dòng. Toàn bộ các chỉ tiêu kỹ thuật bao gồm tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, LOD và LOQ đều đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của AOAC và Hướng dẫn ASEAN. Ứng dụng thực tế trên các mẫu dược liệu tại Bắc Giang đã xác định được khoảng thời gian thu hái tối ưu là từ giữa tháng 9 đến tháng 10, cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu tự nhiên này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ung thư hiện nay là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên thế giới với gần 9,8 triệu ca tử vong (tức 1/6 số ca tử vong) [16]. Trong đó tình trạng kháng thuốc là một trong những nguyên nhân dẫn đến thất bại điều trị, do đó việc tìm những liệu pháp điều trị mới trở nên cấp thiết trong việc điều trị ung thư hiện nay. Trong đó oxostephanin là một trong những hoạt chất được phân lập trong củ và lá của loài Stephania dielsiana Y. Do đó với những nghiên cứu về oxostephanin đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.

Hiện nay mức độ quan tâm về oxostephanin chỉ tập trung về tác dụng của chúng trên lâm sàng mà chưa có nhiều nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu. Đáp ứng nhu cầu này và dựa trên một số nghiên cứu khả quan của một số tác giả đã tiến hành trên Stephania dielsiana Y.Wu, cùng với điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài: “Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng phương pháp HPLC. Ứng dụng khảo sát hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu hái tại các thời điểm khác nhau trong năm.

Tổng quan về củ dòm 1. Đặc điểm thực vật Cây củ dòm có tên khoa học Stephania dielsiana Y.Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê (Menispermaceae) [4, 11]. Chúng có một số đặc điểm thực vật như: cây thảo leo, có củ thuôn dài hơn củ bình vôi, mọc nổi, ngang mặt đất, hình giống tư thế con gà mái đang ấp trứng, củ cắt ngang có màu vàng rõ hơn, ít xơ hơn, có vị đắng và tê hơn so với củ bình vôi [10], phiến lá hình khiên; gốc bằng hoặc hơi lõm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc có ít răng rất nhỏ ở phía đầu lá, hơi lượn, bấm sóng, bấm lá có nhựa màu tím hồng, cuống lá dài 4,5 - 8,5 cm, đính vào 2/3 phiến lá; gân lá xếp dạng chân vịt, nửa cuống lá phía trên và gân lá mặt sau có màu tím hoặc màu hồng [11]. Hoa nhỏ, đơn tính, khác gốc; hoa đực tụ hợp thành tán giả, có 6 lá đài màu tím xếp thành hai vòng; 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị đính trên môi trụ ngắn; hoa cái thành dang đầu, có 1 lá đài màu tím, 2 cánh hoa màu vàng cam có vân tím, đầu nhụy chia thùy.

Quả hình trứng, dẹt, dài 0,8 - 0,9 cm; hạt có 4 hàng gai cong và có lỗ ở giữa. Mùa hoa: tháng 4 - 5; mùa quả: tháng 6 - 7 [11]. Chi Stephania Lour. gồm các loài là dây leo, rụng lá mùa đông; phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á, có 10 - 12 loài, trong đó có 2 - 3 loài không có rễ phình thành củ [11].

Củ dòm có thể sống cả ở vùng núi đá lẫn rừng núi đất, cả ở nơi có nhiều đá lộ đầu, phân bố nhiều tại các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Ba Vì, Hà Bắc, Quảng Ninh, ngoài ra chúng cũng có thể tìm thấy tại Trung Quốc [10]. Thành phần hóa học Năm 2009, Zhang Yi và các cộng sự đã công bố phân lập được 12 hợp chất từ loài Stephania dielsiana là sinoacutin, stephanin, ayuthianin, dehydrostephanin, cephamorphinanin, aknadinin, liriodenin, sinomenin, L-tetrahydropalmatin, (-) corydalmin, oxocrebanin, nor-canelillin [8, 17]. Năm 2011, Yecheng Deng và các cộng sự đã công bố phân lập được các alkaloid từ thân của Stephania dielsiana Y.Wu trong đó stephanin và crebanin thuộc nhóm aporphin được chứng minh có khả năng kháng khuẩn phổ rộng trên nấm gây bệnh và vi khuẩn Gram (+). Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng các chất thuộc nhóm aporphin cũng có tính ức chế chống lại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật [13].

3 Năm 2009, Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự đã phân lập được 21 hợp chất có trong Stephania dielsiana Y.Wu trong đó có chủ yếu là các alcaloid, một số là flavonoid và terpenoid. Trong đó, dehydrocrebanin và oxostephanin lần đầu tiên được phân lập từ loài S. Năm 2020, James Knockleby và các cộng sự đã công bố tiến hành phân lập được và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và chống co thắt của 7 alkaloid có trong Stephania dielsiana Y.Wu bao gồm: oxostephanin, thailandin, stephanin, crebanin, O - methylbulbocapin, palmatin clorid, tetrahydropalmatin. Kết quả cho thấy oxostephanin, thailandin, stephanin, crebanin, O -methylbulbocapin có khả năng chống lại sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư [14].

Oxostephanin Sau khi được phân lập, một số đặc tính lý hóa của oxostephanin đã được nghiên cứu và có đặc điểm như sau: Hình 1.1:Cấu trúc hóa học của oxostephanin • Danh pháp IUPAC: 9-methoxy-8H-[1,3]dioxolo[4',5':4,5]benzo[1,2,3- de]benzo[g]quinolin-8-on. • Công thức phân tử: C18H11NO4 [15]. • Khối lượng phân tử: 305,3 đvC [15] • Cảm quan: tinh thể hình kim, màu vàng [6, 8] • Điểm chảy: 160-162oC [6, 8]. • Độ tan: không tan trong nước, tan được trong methanol, diclomethan.

Tuy nhiên khi acid hóa dịch chiết, chúng dễ dàng chiết tách được bằng ethanol hoặc methanol, ít tan trong nước và không tan trong diclomethan [6-8]. Tác dụng sinh học của S.Wu và oxostephanin 1. Tác dụng sinh học của S.Wu Theo Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự [5] dịch chiết S.Wu có một số tác dụng như : 4 - Tác dụng giảm đau ngoại biên theo kiểu aspirin nhưng không có tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự morphin. - Tác dụng chống viêm xuất hiện sau 24 giờ, tác dụng chống viêm này chậm và không giống tác dụng của indomethacin.

- Tác dụng gây độc tế bào: đã thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dòng ung thư thì chỉ có hợp chất oxostephanin dương tính với cả 3 dòng tế bào thử nghiệm là tế bào ung thư gan (Hep-2) và ung thư cơ vân (RD), tế bào ung thư phổi (LU) [5, 14]. Tác dụng sinh học của oxostephanin Trong các alkaloid được phân lập từ Stephania dielsiana Y.Wu thì oxostephanin có hoạt động chống lại mạnh nhất các dòng tế bào ung thư, mặc dù thailandin và stephanin cũng cho khả năng ức chế mạnh [14]. Oxostephanin có khả năng kháng mạnh các dòng tế bào ung thư như: HeLa (tế bào ung thư cổ tử cung), HepG2 (tế bào ung thư gan), OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng), MDA và H358 (tế bào ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người) với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 1,66 đến 4,35 µM [1, 14]. Các phương pháp định lượng oxostephanin Hiện nay trong các dược điển chưa có chuyên luận về củ dòm cũng như oxostephanin.

Bên cạnh đó các bài báo các công bố khoa học về định lượng oxostephanin vẫn còn hạn chế về mặt số lượng. Qua tìm hiểu nhóm nghiên cứu nhận thấy có hai phương pháp đã được áp dụng định lượng oxostephanin đó là HPLC và HPTLC (Bảng 1. Tuy nhiên HPTLC lại có độ lặp lại kém và sai số lớn hơn so với HPLC, ngoài ra khi phân tích bằng HPTLC kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm… 5 Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng oxostephanin Tài Phương pháp Điều kiện phân tích liệu phân tích - Bản mỏng: silica gel 60 F254.

[7] HPTLC - Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH (9:1) - Bước sóng phát hiện: 366 nm - Cột Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) - Detector PDA, bước sóng phát hiện 254 nm - Thể tích tiêm: 20 µL - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Pha động: hỗn hợp dung môi A (ACN) và dung môi B (dung dịch đệm KH2PO4 20 mM : TEA (100:0,3)), điều chỉnh đến pH = 3 bằng H3PO4 đặc), chương trình gradient dung môi. [5] HPLC - Chương trình gradient: Thời gian Dung môi A Dung môi B (phút) (%) (%) 0-21 20 80 21-22 20-40 80-60 22-29 40 60 29-30 40-20 60-80 30-35 20 80 - Cột Supelco C18 (5µm, 250mm x 4,6mm) - Detector DAD, bước sóng 254nm. - Pha động: MeOH : HCOOH 0,1% (v/v) = 35:65 [8] HPLC - Thể tích tiêm mẫu 10µl - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thời gian sắc ký: 50 phút Với điều kiện có sẵn máy tại phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng HPLC làm thiết bị phân tích. Nhận thấy với 2 phương pháp HPLC được sử dụng như trên thì đều dùng sắc ký pha đảo với cột pha tĩnh C18 và detector DAD để phân tích.

Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại hai pha động theo các tài liệu tham khảo, lựa chọn phương pháp thích hợp và thẩm định lại phương pháp lựa chọn. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Trong nghiên cứu này, việc thẩm định lại phương pháp phân tích được tiến hành theo “Hướng dẫn Asean về thẩm định quy trình phân tích” [3] và AOAC [12]. Theo hướng dẫn này đối với phương pháp phân tích định lượng cần thẩm định lại các chỉ tiêu sau: - Độ phù hợp hệ thống - Độ đặc hiệu - Độ đúng - Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) - Khoảng tuyến tính - Khoảng xác định - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 1.

Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là phép thử để đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích như máy móc, thiết bị. Độ phù hợp hệ thống được tiến hành bằng cách tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn đồng nhất chứa hoạt chất phân tích. Độ thích hợp hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thí nghiệm. Mẫu đánh giá tính thích hợp hệ thống thường sử mẫu có nồng độ 100% nồng độ định lượng, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng các mẫu nồng độ khác miễn là mẫu đó vẫn thuộc khoảng tuyến tính.

Yêu cầu: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích (chiều cao) và thời gian lưu của chất phân tích nhỏ hơn 2%. Độ đặc hiệu Là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác như tạp chất, chất phân hủy, chất nền… Để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPLC cần tiến hành chuẩn bị một số dung dịch sau: - Mẫu dung môi - Mẫu nền (giả dược - placebo): mẫu giả dược bao gồm các thành phần tương tự như chế phẩm thuốc nhưng không chứa chất phân tích, được chuẩn bị giống như mẫu thử. - Mẫu chuẩn: có chứa chất phân tích bằng với lượng mẫu thử được chuẩn bị giống mẫu thử. - Mẫu thử: mẫu thử tại nồng độ 100%.