ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ung thư hiện nay là nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên thế giới với gần 9,8 triệu ca tử vong (tức 1/6 số ca tử vong) [16]. Trong đó tình trạng kháng thuốc là một trong những nguyên nhân dẫn đến thất bại điều trị, do đó việc tìm những liệu pháp điều trị mới trở nên cấp thiết trong việc điều trị ung thư hiện nay. Trong đó oxostephanin là một trong những hoạt chất được phân lập trong củ và lá của loài Stephania dielsiana Y. Do đó với những nghiên cứu về oxostephanin đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học.
Hiện nay mức độ quan tâm về oxostephanin chỉ tập trung về tác dụng của chúng trên lâm sàng mà chưa có nhiều nghiên cứu định lượng oxostephanin trong dược liệu. Đáp ứng nhu cầu này và dựa trên một số nghiên cứu khả quan của một số tác giả đã tiến hành trên Stephania dielsiana Y.Wu, cùng với điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài: “Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu và ứng dụng khảo sát hàm lượng hoạt chất theo thời gian thu hái” được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Thẩm định lại phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng phương pháp HPLC. Ứng dụng khảo sát hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu hái tại các thời điểm khác nhau trong năm.
Tổng quan về củ dòm 1. Đặc điểm thực vật Cây củ dòm có tên khoa học Stephania dielsiana Y.Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê (Menispermaceae) [4, 11]. Chúng có một số đặc điểm thực vật như: cây thảo leo, có củ thuôn dài hơn củ bình vôi, mọc nổi, ngang mặt đất, hình giống tư thế con gà mái đang ấp trứng, củ cắt ngang có màu vàng rõ hơn, ít xơ hơn, có vị đắng và tê hơn so với củ bình vôi [10], phiến lá hình khiên; gốc bằng hoặc hơi lõm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc có ít răng rất nhỏ ở phía đầu lá, hơi lượn, bấm sóng, bấm lá có nhựa màu tím hồng, cuống lá dài 4,5 - 8,5 cm, đính vào 2/3 phiến lá; gân lá xếp dạng chân vịt, nửa cuống lá phía trên và gân lá mặt sau có màu tím hoặc màu hồng [11]. Hoa nhỏ, đơn tính, khác gốc; hoa đực tụ hợp thành tán giả, có 6 lá đài màu tím xếp thành hai vòng; 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị đính trên môi trụ ngắn; hoa cái thành dang đầu, có 1 lá đài màu tím, 2 cánh hoa màu vàng cam có vân tím, đầu nhụy chia thùy.
Quả hình trứng, dẹt, dài 0,8 - 0,9 cm; hạt có 4 hàng gai cong và có lỗ ở giữa. Mùa hoa: tháng 4 - 5; mùa quả: tháng 6 - 7 [11]. Chi Stephania Lour. gồm các loài là dây leo, rụng lá mùa đông; phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á, có 10 - 12 loài, trong đó có 2 - 3 loài không có rễ phình thành củ [11].
Củ dòm có thể sống cả ở vùng núi đá lẫn rừng núi đất, cả ở nơi có nhiều đá lộ đầu, phân bố nhiều tại các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Ba Vì, Hà Bắc, Quảng Ninh, ngoài ra chúng cũng có thể tìm thấy tại Trung Quốc [10]. Thành phần hóa học Năm 2009, Zhang Yi và các cộng sự đã công bố phân lập được 12 hợp chất từ loài Stephania dielsiana là sinoacutin, stephanin, ayuthianin, dehydrostephanin, cephamorphinanin, aknadinin, liriodenin, sinomenin, L-tetrahydropalmatin, (-) corydalmin, oxocrebanin, nor-canelillin [8, 17]. Năm 2011, Yecheng Deng và các cộng sự đã công bố phân lập được các alkaloid từ thân của Stephania dielsiana Y.Wu trong đó stephanin và crebanin thuộc nhóm aporphin được chứng minh có khả năng kháng khuẩn phổ rộng trên nấm gây bệnh và vi khuẩn Gram (+). Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng các chất thuộc nhóm aporphin cũng có tính ức chế chống lại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật [13].
3 Năm 2009, Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự đã phân lập được 21 hợp chất có trong Stephania dielsiana Y.Wu trong đó có chủ yếu là các alcaloid, một số là flavonoid và terpenoid. Trong đó, dehydrocrebanin và oxostephanin lần đầu tiên được phân lập từ loài S. Năm 2020, James Knockleby và các cộng sự đã công bố tiến hành phân lập được và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và chống co thắt của 7 alkaloid có trong Stephania dielsiana Y.Wu bao gồm: oxostephanin, thailandin, stephanin, crebanin, O - methylbulbocapin, palmatin clorid, tetrahydropalmatin. Kết quả cho thấy oxostephanin, thailandin, stephanin, crebanin, O -methylbulbocapin có khả năng chống lại sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư [14].
Oxostephanin Sau khi được phân lập, một số đặc tính lý hóa của oxostephanin đã được nghiên cứu và có đặc điểm như sau: Hình 1.1:Cấu trúc hóa học của oxostephanin • Danh pháp IUPAC: 9-methoxy-8H-[1,3]dioxolo[4',5':4,5]benzo[1,2,3- de]benzo[g]quinolin-8-on. • Công thức phân tử: C18H11NO4 [15]. • Khối lượng phân tử: 305,3 đvC [15] • Cảm quan: tinh thể hình kim, màu vàng [6, 8] • Điểm chảy: 160-162oC [6, 8]. • Độ tan: không tan trong nước, tan được trong methanol, diclomethan.
Tuy nhiên khi acid hóa dịch chiết, chúng dễ dàng chiết tách được bằng ethanol hoặc methanol, ít tan trong nước và không tan trong diclomethan [6-8]. Tác dụng sinh học của S.Wu và oxostephanin 1. Tác dụng sinh học của S.Wu Theo Nguyễn Quốc Huy và các cộng sự [5] dịch chiết S.Wu có một số tác dụng như : 4 - Tác dụng giảm đau ngoại biên theo kiểu aspirin nhưng không có tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự morphin. - Tác dụng chống viêm xuất hiện sau 24 giờ, tác dụng chống viêm này chậm và không giống tác dụng của indomethacin.
- Tác dụng gây độc tế bào: đã thử tác dụng gây độc tế bào trên 3 dòng ung thư thì chỉ có hợp chất oxostephanin dương tính với cả 3 dòng tế bào thử nghiệm là tế bào ung thư gan (Hep-2) và ung thư cơ vân (RD), tế bào ung thư phổi (LU) [5, 14]. Tác dụng sinh học của oxostephanin Trong các alkaloid được phân lập từ Stephania dielsiana Y.Wu thì oxostephanin có hoạt động chống lại mạnh nhất các dòng tế bào ung thư, mặc dù thailandin và stephanin cũng cho khả năng ức chế mạnh [14]. Oxostephanin có khả năng kháng mạnh các dòng tế bào ung thư như: HeLa (tế bào ung thư cổ tử cung), HepG2 (tế bào ung thư gan), OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng), MDA và H358 (tế bào ung thư biểu mô cuống phổi và phế nang ở người) với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 1,66 đến 4,35 µM [1, 14]. Các phương pháp định lượng oxostephanin Hiện nay trong các dược điển chưa có chuyên luận về củ dòm cũng như oxostephanin.
Bên cạnh đó các bài báo các công bố khoa học về định lượng oxostephanin vẫn còn hạn chế về mặt số lượng. Qua tìm hiểu nhóm nghiên cứu nhận thấy có hai phương pháp đã được áp dụng định lượng oxostephanin đó là HPLC và HPTLC (Bảng 1. Tuy nhiên HPTLC lại có độ lặp lại kém và sai số lớn hơn so với HPLC, ngoài ra khi phân tích bằng HPTLC kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm… 5 Bảng 1. 1: Các phương pháp định lượng oxostephanin Tài Phương pháp Điều kiện phân tích liệu phân tích - Bản mỏng: silica gel 60 F254.
[7] HPTLC - Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH (9:1) - Bước sóng phát hiện: 366 nm - Cột Apollo C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) - Detector PDA, bước sóng phát hiện 254 nm - Thể tích tiêm: 20 µL - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Pha động: hỗn hợp dung môi A (ACN) và dung môi B (dung dịch đệm KH2PO4 20 mM : TEA (100:0,3)), điều chỉnh đến pH = 3 bằng H3PO4 đặc), chương trình gradient dung môi. [5] HPLC - Chương trình gradient: Thời gian Dung môi A Dung môi B (phút) (%) (%) 0-21 20 80 21-22 20-40 80-60 22-29 40 60 29-30 40-20 60-80 30-35 20 80 - Cột Supelco C18 (5µm, 250mm x 4,6mm) - Detector DAD, bước sóng 254nm. - Pha động: MeOH : HCOOH 0,1% (v/v) = 35:65 [8] HPLC - Thể tích tiêm mẫu 10µl - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thời gian sắc ký: 50 phút Với điều kiện có sẵn máy tại phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng HPLC làm thiết bị phân tích. Nhận thấy với 2 phương pháp HPLC được sử dụng như trên thì đều dùng sắc ký pha đảo với cột pha tĩnh C18 và detector DAD để phân tích.
Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại hai pha động theo các tài liệu tham khảo, lựa chọn phương pháp thích hợp và thẩm định lại phương pháp lựa chọn. Vài nét về thẩm định phương pháp phân tích Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Trong nghiên cứu này, việc thẩm định lại phương pháp phân tích được tiến hành theo “Hướng dẫn Asean về thẩm định quy trình phân tích” [3] và AOAC [12]. Theo hướng dẫn này đối với phương pháp phân tích định lượng cần thẩm định lại các chỉ tiêu sau: - Độ phù hợp hệ thống - Độ đặc hiệu - Độ đúng - Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) - Khoảng tuyến tính - Khoảng xác định - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 1.
Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là phép thử để đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích như máy móc, thiết bị. Độ phù hợp hệ thống được tiến hành bằng cách tiêm lặp lại nhiều lần một dung dịch chuẩn đồng nhất chứa hoạt chất phân tích. Độ thích hợp hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thí nghiệm. Mẫu đánh giá tính thích hợp hệ thống thường sử mẫu có nồng độ 100% nồng độ định lượng, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng các mẫu nồng độ khác miễn là mẫu đó vẫn thuộc khoảng tuyến tính.
Yêu cầu: Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích (chiều cao) và thời gian lưu của chất phân tích nhỏ hơn 2%. Độ đặc hiệu Là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác như tạp chất, chất phân hủy, chất nền… Để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPLC cần tiến hành chuẩn bị một số dung dịch sau: - Mẫu dung môi - Mẫu nền (giả dược - placebo): mẫu giả dược bao gồm các thành phần tương tự như chế phẩm thuốc nhưng không chứa chất phân tích, được chuẩn bị giống như mẫu thử. - Mẫu chuẩn: có chứa chất phân tích bằng với lượng mẫu thử được chuẩn bị giống mẫu thử. - Mẫu thử: mẫu thử tại nồng độ 100%.