Tổng quan luận án

Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 70% dân số toàn cầu sử dụng thuốc từ dược liệu trong công tác chăm sóc sức khỏe ban đầu. Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng các sản phẩm này tại nhiều nước đang phát triển gặp trở ngại do thiếu các chất chuẩn đối chiếu (CCĐC) đặc trưng. Dược điển Việt Nam III (năm 2002) ban hành 312 chuyên luận dược liệu và thuốc từ dược liệu, trong đó chỉ có 48/275 chuyên luận dược liệu sử dụng CCĐC chiết xuất từ tự nhiên. Đến Dược điển Việt Nam IV (năm 2009), số lượng chuyên luận dược liệu và thuốc từ dược liệu là 314. Do thiếu hụt nguồn chất chuẩn đối chiếu thương mại hoặc chuẩn dược điển, tiêu chuẩn cơ sở của nhiều chế phẩm đông dược phải áp dụng phương pháp định lượng hỗn hợp toàn phần không đặc hiệu, chưa thể định lượng chính xác các hoạt chất chính có hoạt tính sinh học. Xuất phát từ yêu cầu thực tế của công tác kiểm nghiệm và giám sát chất lượng thuốc lưu hành, luận án "Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc" được triển khai.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm ba nội dung được đánh số cụ thể:

  1. Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 03 hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu là Conessin, Kaempferol và Nuciferin đạt độ tinh khiết trên 95% để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
  2. Thiết lập 03 chất chuẩn đối chiếu có nguồn gốc dược liệu trên.
  3. Ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để đánh giá chất lượng một số dược liệu và chế phẩm đông dược.

Để thực hiện các mục tiêu trên, luận án xác định 05 nội dung cụ thể:

  1. Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin từ vỏ thân cây Mức hoa trắng, Nuciferin từ lá cây Sen, Kaempferol từ lá cây Đơn lá đỏ đạt độ tinh khiết trên 95%, với khối lượng mỗi hợp chất tinh khiết tối thiểu là 02 gam.
  2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất.
  3. Xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất chuẩn đối chiếu và phương pháp phân tích để đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu.
  4. Nghiên cứu độ ổn định của 03 chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện bảo quản 2 – 8°C.
  5. Ứng dụng chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu lá cây Đơn lá đỏ, lá cây Chè vằng, Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Ba hợp chất tự nhiên gồm Conessin (alcaloid chính trong vỏ thân cây Mức hoa trắng), Kaempferol (flavonol trong lá cây Đơn lá đỏ), Nuciferin (alcaloid chính trong lá cây Sen). Đối tượng ứng dụng là dược liệu lá Chè vằng và chế phẩm viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT.
  • Phạm vi không gian: Dược liệu vỏ thân Mức hoa trắng (Holarrhena antidysenterica Wall.) thu mua qua Công ty Cổ phần Dược phẩm và Thiết bị Y tế Hà Tĩnh; lá Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) thu hái tại Thái Bình (tháng 5/2008); lá Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.); lá Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) thu mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội; chế phẩm viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT (số kiểm soát 270611, hạn dùng 26/6/2013) do Công ty Cổ phần Dược phẩm và Thiết bị Y tế Hà Tĩnh sản xuất. Các thực nghiệm phân tích được tiến hành tại Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
  • Phạm vi thời gian: Thực nghiệm triển khai từ năm 2008 đến năm 2011; thời gian theo dõi độ ổn định của chất chuẩn kéo dài qua các mốc 9 tháng và 15 tháng.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến ba hợp chất mục tiêu và hệ thống thiết lập chất chuẩn đối chiếu:

Về Conessin và cây Mức hoa trắng (Holarrhena antidysenterica Wall., họ Apocynaceae): Hợp chất Conessin có công thức $C_{24}H_{40}N_{2}$, phân tử lượng 356,59, danh pháp (3β)-N,N-dimethylcon-5-enin-3-amine, điểm chảy 125°C, $[α]_D = 1,9^\circ$ (trong $CHCl_3$) và $+21,6^\circ$ (trong $C_2H_5OH$). Về phương pháp chiết xuất, Phí Tùng Lâm (năm 1999) chiết alcaloid toàn phần từ vỏ thân cây Mức hoa trắng thu hái tại Hải Dương bằng cách làm ẩm bột dược liệu bằng $NH_4OH$ trong 12 giờ rồi chiết Soxhlet với cloroform. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (năm 2000) phân lập Conessin và Norconessin từ alcaloid toàn phần bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hỗn hợp $CHCl_3 : MeOH$ theo tỷ lệ tăng dần độ phân cực ($99,5:0,5$ đến $98:2,0$). Tác giả nước ngoài chiết bột vỏ thân cây bằng methanol 5 lần, xử lý qua dung dịch acid HCl 2M, tẩy tạp bằng cloroform, kiềm hóa bằng $NH_4OH$ 30% đến pH 8 rồi chiết lại bằng cloroform (hiệu suất cắn 1,19%), sau đó phân lập Conessin qua cột nhồi alumina với hệ dung môi benzen dầu hỏa : ethyl acetat ($95:5$). Các phương pháp định tính, định lượng Conessin đã công bố gồm sắc ký khí GC-FID (detector FID, pha tĩnh silica gel WHP 100-120 mesh, nhiệt độ 250°C), HPTLC quét densitometry ở bước sóng 520 nm sau khi phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff và $NaNO_2$ 10%, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC cột C18 detector khúc xạ hoặc HPLC-MS.

Về Kaempferol và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour., họ Euphorbiaceae): Kaempferol có công thức phân tử $C_{15}H_{10}O_6$, phân tử lượng 286,2, danh pháp 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on, điểm chảy dạng tinh thể hình kim là 276 – 278°C, dạng vi tinh thể là 278 – 280°C; cực đại hấp thụ tử ngoại tại 266 nm và 362 nm trong methanol. Nguyễn Thái An (năm 2004) chiết xuất flavonoid từ lá Đơn lá đỏ bằng methanol, cất thu hồi dung môi rồi phân đoạn bằng cloroform, ethyl acetat và aceton:nước; sau đó phân lập Kaempferol từ phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột silica gel G60 và tinh chế lại trên cột Sephadex LH-20 rửa giải bằng methanol 60%. Nguyễn Minh Đức và cộng sự (năm 2004) phân lập acid gallic, ethyl gallat và liquiritigenin. Các nghiên cứu quốc tế đã sử dụng HPLC-UV phân tích Kaempferol cùng Quercetin, Myricetin trên cột Hypersil-ODS bước sóng 266 nm, hoặc phân tích trên dịch chiết Hippophae rhamnoides L. bằng cột C18 bước sóng 368 nm.

Về Nuciferin và cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., họ Nelumbonaceae): Nuciferin có công thức phân tử $C_{19}H_{21}NO_2$, phân tử lượng 295,2, danh pháp 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-dimethoxy-6-methyl-dibenzoquinolin, điểm chảy 164 – 165°C, cực đại phổ UV tại 210 nm, 228 nm, 270 nm trong methanol. Nguyễn Thị Nhung (năm 2004) chiết alcaloid toàn phần từ lá sen sau khi làm ẩm bằng $NH_4OH$ 10% rồi chiết bằng cồn 70°, acid hóa bằng HCl 5% đến pH 2, loại tạp bằng ether dầu hỏa, kiềm hóa bằng $NH_4OH$ 10% đến pH 10 – 11 và chiết bằng cloroform; phân lập qua cột silica gel 60 $GF_{254}$ kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế silica gel G với hệ dung môi $CHCl_3 : MeOH : NH_4OH$ ($50:9:1$). Nghiên cứu nước ngoài phân tích đồng thời Nuciferin với N-nornuciferin, O-nornuciferin và roemerin bằng hệ thống HPLC-DAD-ESI-MS trên cột Shimadzu VP-ODS ở bước sóng 280 nm.

Về hoạt động thiết lập chuẩn: Luận án tham chiếu quy định của Hội đồng Dược điển Anh (BP), Hội đồng Dược điển Châu Âu (EDQM ban hành EPCRS), Hội đồng Dược điển Mỹ (USP ban hành USPRS), Ủy ban chất đối chiếu ASEAN (ACRS do WHO, UNDP, JPMA hỗ trợ). Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã thực hiện đề tài cấp bộ giai đoạn 2004-2006 (thiết lập 14 CCĐC), giai đoạn 2006-2008 (thiết lập 8 CCĐC kháng sinh) và đề tài cấp Nhà nước giai đoạn 2008-2010 thiết lập 10 CCĐC có nguồn gốc từ dược liệu.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Các công trình trước đây chủ yếu tập trung phân lập một lượng nhỏ hợp chất nhằm mục đích nhận diện cấu trúc hóa học hoặc đo phổ sơ bộ, kiểm tra độ tinh khiết đơn thuần bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), không định lượng chính xác độ tinh khiết và không xác định hàm lượng tạp chất liên quan. Chưa có quy trình công nghệ nào được chuẩn hóa để tinh chế Conessin, Kaempferol và Nuciferin ở quy mô pilot (tối thiểu 02 gam/chất) đạt độ tinh khiết trên 95% nhằm làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Đồng thời, chưa có công trình nào xây dựng đầy đủ tiêu chuẩn chất lượng, thẩm định phương pháp phân tích tạp chất bằng HPLC, thực hiện đánh giá liên phòng thí nghiệm và khảo sát độ ổn định dài hạn (15 tháng) cho 03 chất chuẩn này theo các hướng dẫn quốc tế của WHO và ASEAN.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên khung hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO Technical Report Series), hướng dẫn ISO Guide 32, Guide 33, và quy định của Ủy ban chất đối chiếu ASEAN (ACRS) về phân loại nguyên liệu đối chiếu:

  • Chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp (PCRS): Nguyên liệu có tính đồng nhất cao, được thừa nhận rộng rãi và công bố giá trị mà không cần so sánh với chất khác.
  • Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (SCRS): Chất chuẩn có giá trị ấn định được xác định thông qua so sánh liên kết với một PCRS, được thẩm định qua chương trình hợp tác liên phòng thí nghiệm. Chuẩn thiết lập trong luận án thuộc nhóm chất chuẩn phòng thí nghiệm (chuẩn làm việc), tuân thủ quy trình thiết lập chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn liên kết sử dụng:

  • Thuốc thử và dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA): Amoniac 10%, ethanol 96%, dung dịch HCl 10%, dung dịch NaOH 10%, ether dầu hỏa (sôi 30 – 60°C), n-hexan, cloroform, ethyl acetat, methanol, toluen, aceton, đệm phosphat pH 7,4; các thuốc thử đặc hiệu alcaloid (Mayer, Dragendorff, Bouchardat, acid picric 1%).
  • Chất chuẩn đối chiếu liên kết đối chứng: Conessin (chuẩn phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Trung Quốc, số kiểm soát 110853-200605); Kaempferol (chuẩn phòng thí nghiệm của Sigma-Aldrich, số kiểm soát 018K1225); Nuciferin (chuẩn phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Trung Quốc, số kiểm soát 111566-200402).

Phương pháp thực nghiệm chi tiết:

  • Chiết xuất, phân lập và tinh chế: Sử dụng phương pháp ngấm kiệt, chiết hồi lưu nhiệt dung môi hữu cơ, chiết Soxhlet; phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng chọn lọc dựa trên sự biến đổi pH đối với alcaloid; sắc ký cột cổ điển sử dụng chất hấp phụ silica gel (cỡ hạt 0,02 – 0,06 mm); sắc ký lớp mỏng điều chế silica gel G và $GF_{254}$; phương pháp kết tinh lại phân đoạn trong các dung môi thích hợp.
  • Xây dựng dữ liệu nhận dạng chất và xác định độ tinh khiết:
    • Điểm nóng chảy: Đo trên máy BUCHI 535.
    • Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS): Đo trên máy Agilent Technologies 8453.
    • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy 670-FTIR Nicolet-Nexus.
    • Phổ khối lượng (ESI-MS): Đo trên hệ thống Thermo-Finnigan LCQ advantage max và Agilent 1100 LC-MSD TRAP.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR): Đo trên máy Bruker Avance AM500FT-NMR (tần số 500 MHz).
    • Độ tinh khiết nhiệt động: Quét nhiệt vi sai DSC trên máy Shimadzu DSC-60.
  • Phương pháp phân tích và thẩm định trên HPLC:
    • Thiết bị: Agilent Technologies 1200, đầu dò UV-VIS dãy diod (DAD/PDA), buồng cột điều nhiệt, cột sắc ký pha đảo C18.
    • Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH/ASEAN: Khảo sát độ thích hợp của hệ thống (hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic), tính đặc hiệu (độ tinh khiết pic bằng DAD), khoảng tuyến tính và phương trình hồi quy, độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian khác ngày), độ đúng (tỷ lệ phục hồi qua phương pháp thêm chuẩn), xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
  • Đóng gói và đánh giá liên phòng thí nghiệm:
    • Đóng gói nguyên liệu trong buồng sạch chuyên dụng Glove Box Labconco, sử dụng lọ thủy tinh màu nâu, nút cao su gắn nắp nhôm niêm phong, gắn nhãn kiểm soát.
    • Kiểm tra độ đồng nhất lô theo quy định thống kê.
    • Phân tích liên phòng thí nghiệm tại các đơn vị độc lập để tính toán giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo.
  • Nghiên cứu độ ổn định: Bảo quản mẫu ở điều kiện nhiệt độ 2 – 8°C, độ ẩm 40%; tiến hành lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ ẩm/giảm khối lượng do sấy khô, tạp chất liên quan và hàm lượng tại các mốc thời gian 9 tháng và 15 tháng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các vấn đề lý luận và thực tiễn về dược liệu và chất chuẩn:

  • Trình bày xu thế phát triển các chế phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên trên thế giới và tại Việt Nam. Thống kê số lượng văn bản quản lý và quy chế thuốc dược liệu của các nước thành viên WHO giai đoạn 1986 – 2007.
  • Tổng quan cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, tác dụng dược lý của ba đối tượng nghiên cứu: Conessin (vỏ thân Mức hoa trắng), Kaempferol (lá Đơn lá đỏ), Nuciferin (lá Sen).
  • Điểm luận chi tiết các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các phương pháp chiết xuất, phân lập, định tính, định lượng ba hợp chất này bằng các kỹ thuật hóa lý và sắc ký (TLC, HPTLC, GC, HPLC-UV, HPLC-MS).
  • Phân tích nguyên tắc, quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học (sơ cấp, thứ cấp, chuẩn làm việc) theo các tài liệu chuẩn của WHO, ISO (ISO Guide 32, 33), Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu, Dược điển Mỹ, Ủy ban chất chuẩn ASEAN và thực trạng nghiên cứu chất chuẩn tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất thuốc thử, danh mục thiết bị và các phương pháp tiến hành:

  • Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào: Vỏ thân Mức hoa trắng thái lát sấy khô dưới 60°C; lá Đơn lá đỏ thu hái tại Thái Bình sấy ở 65°C trong 24 giờ; lá Sen thu hái đạt tiêu chuẩn; lá Chè vằng phơi khô; chế phẩm viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT (chứa 136 mg cao đặc Mộc hoa trắng, 5 mg berberin clorid, 10 mg cao mộc hương).
  • Danh mục hóa chất phân tích và các chất chuẩn liên kết đối chứng (Conessin, Kaempferol, Nuciferin).
  • Các thiết bị phân tích hiện đại đáp ứng tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025.
  • Thiết kế sơ đồ nghiên cứu tổng thể gồm 5 khối nội dung: chiết xuất/tinh chế; xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng; thiết lập tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm chất chuẩn; nghiên cứu độ ổn định; ứng dụng phân tích định lượng.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua các giai đoạn:

  1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế hợp chất:
  • Conessin từ vỏ thân Mức hoa trắng: Chiết xuất alcaloid toàn phần bằng dung môi hữu cơ sau khi kiềm hóa dược liệu. Khảo sát hiệu suất chiết alcaloid toàn phần từ vỏ thân đạt kết quả ổn định. Phân lập Conessin qua sắc ký cột silica gel và tinh chế kết tinh lại thu được trên 02 gam Conessin tinh khiết.
  • Kaempferol từ lá Đơn lá đỏ: Chiết flavonoid toàn phần bằng cồn, xử lý cắn qua các dung môi có độ phân cực tăng dần. Khảo sát hàm lượng Kaempferol trong cắn ethyl acetat và hàm lượng chiết xuất được từ dược liệu. Phân lập qua cột sắc ký silica gel với các hệ dung môi giải hấp phụ xác định (Bảng 3. Thành phần và thể tích các hệ dung môi giải hấp phụ cột silicagel), kiểm tra các phân đoạn bằng TLC với các hệ dung môi I, II, III; kết tinh lại thu được trên 02 gam Kaempferol vi tinh thể.
  • Nuciferin từ lá Sen: Chiết xuất alcaloid toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt có kiềm hóa, so sánh hiệu suất thu hồi giữa hai phương pháp chiết. Phân lập qua sắc ký cột silica gel kết hợp tinh chế kết tinh lại trong dung môi thích hợp, thu được trên 02 gam Nuciferin tinh khiết.
Hợp chất Dược liệu nguồn Dạng cảm quan Điểm chảy (°C) Khối lượng tinh chế (g) Độ tinh khiết DSC (%)
Conessin Vỏ thân Mức hoa trắng Tinh thể hình lăng trụ, trắng 125,0 – 125,8 > 2,0 98,62
Kaempferol Lá Đơn lá đỏ Vi tinh thể, màu vàng nhạt 276,5 – 278,2 > 2,0 97,85
Nuciferin Lá Sen Tinh thể hình khối, vàng nhạt 164,2 – 165,1 > 2,0 98,14
  1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng và độ tinh khiết:
  • Điểm chảy: Đo điểm chảy xác nhận sự đồng nhất của tinh thể các hợp chất.
  • Phổ UV-VIS: Conessin hấp thụ yếu ở vùng tử ngoại sâu; Kaempferol có cực đại hấp thụ ở bước sóng 266 nm và 366 nm; Nuciferin có các cực đại hấp thụ ở bước sóng 210 nm, 228 nm và 270 nm.
  • Phổ FT-IR: Xác định đầy đủ các vân hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức dao động hóa học trong phân tử từng chất.
  • Phổ khối ESI-MS: Xác nhận ion giả phân tử $[M+H]^+$ phù hợp với khối lượng phân tử lý thuyết: Conessin ($m/z$ 357,3), Kaempferol ($m/z$ 287,1), Nuciferin ($m/z$ 296,2).
  • Phổ 1H-NMR và 13C-NMR: Gán đầy đủ các tín hiệu dịch chuyển hóa học (chemical shift) của các nguyên tử hydro và carbon trong phân tử, đối chiếu hoàn toàn phù hợp với cấu trúc lý thuyết của Conessin, Kaempferol và Nuciferin.
  • Quét nhiệt vi sai (DSC): Xác định độ tinh khiết nhiệt động học tuyệt đối của ba hợp chất đều đạt trên 97% (Conessin: 98,62%; Kaempferol: 97,85%; Nuciferin: 98,14%).
  1. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu:
  • Khảo sát các điều kiện sắc ký HPLC: Loại cột phân tích, thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, bước sóng phát hiện bằng detector DAD.
  • Thẩm định phương pháp phân tích HPLC: Các thông số tính thích hợp của hệ thống, tính tuyến tính ($R^2 > 0,999$), độ chính xác (RSD < 2%), độ đúng (tỷ lệ tìm lại trong khoảng 98,0 – 102,0%), xác định LOD và LOQ.
Thông số thẩm định HPLC Conessin Kaempferol Nuciferin
Bước sóng phát hiện (nm) 210 266 / 365 270
Khoảng tuyến tính (µg/mL) 10,0 – 200,0 5,0 – 100,0 5,0 – 150,0
Hệ số tương quan ($R^2$) 0,9996 0,9998 0,9997
Độ lặp lại (RSD %) 0,85 0,62 0,74
Tỷ lệ phục hồi trung bình (%) 99,42 99,85 99,16
LOD (µg/mL) 0,15 0,08 0,10
LOQ (µg/mL) 0,50 0,25 0,33
  • Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn: Ban hành các chỉ tiêu cảm quan, độ ẩm/mất khối lượng do sấy khô, điểm nóng chảy, định tính (IR, HPLC, UV), tạp chất liên quan và hàm lượng hoạt chất.
  • Phân tích tạp chất liên quan trên HPLC: Tạp chất trong mẫu Conessin < 1,5%; tạp chất trong Kaempferol < 2,0%; tạp chất trong Nuciferin < 1,5%.
  • Đóng gói và kiểm tra độ đồng nhất lô: Đóng gói thành các lọ nhỏ trong buồng sạch Labconco. Kiểm tra độ đồng nhất giữa các lọ trong lô theo tiêu chuẩn phân tích phương sai, kết quả đạt độ đồng nhất quy định.
  • Đánh giá liên phòng thí nghiệm: Thu thập số liệu phân tích từ các phòng thí nghiệm thành viên, xử lý thống kê loại trừ sai số thô, tính toán xác định giá trị ấn định (GTAĐ) cho ba chất chuẩn đối chiếu: Conessin đạt 98,54%; Kaempferol đạt 98,12%; Nuciferin đạt 98,35% (tính trên nguyên trạng).
  1. Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu:
  • Theo dõi định kỳ sau 9 tháng và 15 tháng bảo quản ở 2 – 8°C.
  • Các chỉ tiêu cảm quan, tạp chất liên quan và hàm lượng công bố không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê; độ sai khác hàm lượng nằm trong giới hạn cho phép (< 1,0% so với giá trị ấn định ban đầu).
Mốc thời gian đánh giá Conessin (Hàm lượng %) Kaempferol (Hàm lượng %) Nuciferin (Hàm lượng %)
Ban đầu (0 tháng) 98,54 98,12 98,35
Sau 9 tháng 98,41 98,05 98,24
Sau 15 tháng 98,32 97,98 98,15
  1. Kết quả ứng dụng chất chuẩn đối chiếu:
  • Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Kaempferol trong lá Đơn lá đỏ bằng HPLC-DAD: Phương pháp có tính đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính phù hợp, độ lặp lại có RSD < 1,5%, tỷ lệ tìm lại đạt 98,5 – 101,2%.
  • Ứng dụng định lượng Kaempferol trong dược liệu Chè vằng: Phân tích và xác định hàm lượng Kaempferol có trong lá Chè vằng đạt độ lặp lại cao.
  • Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT: Sử dụng chương trình gradient dung môi, tách hoàn toàn pic Conessin ra khỏi pic tá dược và các alcaloid khác (như berberin). Khảo sát độ thích hợp của hệ thống, tính đặc hiệu pic, độ chính xác trong ngày và độ chính xác trung gian khác ngày, độ đúng và LOD/LOQ đều đạt yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích dược phẩm.

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung biện giải các khía cạnh khoa học và kỹ thuật:

  • Bàn luận về việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu: Khẳng định tính đại diện của Mức hoa trắng, Đơn lá đỏ và Sen trong hệ thống y học cổ truyền Việt Nam, cũng như nhu cầu cấp thiết về chuẩn phân tích cho các dược liệu này.
  • Bàn luận về nhóm các phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế: Phân tích ưu nhược điểm của việc chiết alcaloid bằng hệ dung môi hữu cơ phân cực trong môi trường kiềm so với chiết acid; cơ chế tách các tạp chất flavonoid bằng dung môi chọn lọc; vai trò của việc kết hợp sắc ký cột silica gel với quá trình kết tinh lại phân đoạn nhằm nâng cao độ tinh khiết sản phẩm từ mức >80% lên >95%.
  • Bàn luận về các phương pháp nhận dạng và đánh giá độ tinh khiết: Khẳng định sự đồng thuận giữa dữ liệu phổ lý thuyết và phổ thực nghiệm (UV, FT-IR, MS, NMR). Đánh giá vai trò của kỹ thuật quét nhiệt vi sai (DSC) như một phương pháp tuyệt đối độc lập xác định độ tinh khiết nhiệt động không cần chất chuẩn đối chứng.
  • Bàn luận về tiêu chuẩn chất lượng và quy trình thiết lập chất chuẩn: Sự cần thiết của việc kiểm soát tạp chất liên quan bằng HPLC gradient; quy trình kiểm tra độ đồng nhất lô khi đóng gói khối lượng nhỏ trong buồng thao tác Glove Box.
  • Bàn luận về độ ổn định của chất chuẩn sau 9 tháng và 15 tháng: Phân tích các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ bảo quản 2 – 8°C, độ ẩm và loại đồ bao gói thủy tinh màu nút kín; khẳng định mức độ suy giảm hàm lượng dưới 1% chứng minh độ bền vững của mẫu chuẩn đã thiết lập.
  • Bàn luận về tính khả thi của quy trình ứng dụng: So sánh phương pháp định lượng trực tiếp hoạt chất chính Conessin và Kaempferol bằng HPLC với các phương pháp định lượng toàn phần không đặc hiệu trước đây, chứng minh độ chính xác và tính tương thích của phương pháp trong công tác kiểm nghiệm định kỳ.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

  • Xây dựng thành công quy trình công nghệ chiết xuất, phân lập và tinh chế 03 hợp chất Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ nguồn dược liệu trong nước đạt quy mô điều chế trên 02 gam/chất, đạt độ tinh khiết cao trên 95% (xác định bằng DSC và HPLC).
  • Thiết lập đầy đủ bộ dữ liệu phổ cấu trúc chuẩn hóa cho 03 hợp chất bao gồm: điểm nóng chảy, phổ UV-VIS, phổ FT-IR, phổ khối lượng ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
  • Xây dựng bộ tiêu chuẩn chất lượng hoàn chỉnh cho 03 chất chuẩn đối chiếu phòng thí nghiệm; thẩm định phương pháp phân tích độ tinh khiết, định lượng và phân tích tạp chất liên quan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC theo chuẩn mực quốc tế.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm có hệ thống về độ ổn định của Conessin, Kaempferol và Nuciferin trong điều kiện bảo quản 2 – 8°C qua các mốc thời gian 9 tháng và 15 tháng.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất:

  • Cung cấp 03 chất chuẩn đối chiếu kèm theo giá trị ấn định (Conessin: 98,54%; Kaempferol: 98,12%; Nuciferin: 98,35%) phục vụ trực tiếp cho hệ thống kiểm nghiệm thuốc, các viện nghiên cứu và nhà sản xuất dược phẩm.
  • Thiết lập quy trình định lượng hoạt chất chính Kaempferol trong lá Đơn lá đỏ, lá Chè vằng và Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT bằng HPLC-DAD, thay thế cho các phương pháp đo màu hoặc định lượng toàn phần không đặc hiệu.
  • Đề xuất Hội đồng Dược điển Việt Nam và Cục Quản lý Dược đưa các phương pháp định lượng đặc hiệu sử dụng chất chuẩn đối chiếu này vào chuyên luận Dược điển Việt Nam và tiêu chuẩn cơ sở của các chế phẩm lưu hành.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Nghiên cứu độ ổn định mới dừng lại ở điều kiện bảo quản mát (2 – 8°C) trong thời gian 15 tháng; chưa triển khai thử nghiệm độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ và độ ẩm cao) hoặc điều kiện dài hạn trên 3 năm theo khuyến cáo hoàn chỉnh của ASEAN đối với chất đối chiếu hóa học.
  • Quy mô tinh chế dừng ở mức pilot phòng thí nghiệm (thu nhận trên 02 gam mỗi chất), chưa nâng lên quy mô bán công nghiệp để cung cấp số lượng lớn cho thị trường thương mại.
  • Phạm vi ứng dụng định lượng thực tế mới tiến hành trên hai loại dược liệu (Đơn lá đỏ, Chè vằng) và một dạng chế phẩm thương mại (viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT).

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Tiếp tục theo dõi độ ổn định dài hạn của 03 chất chuẩn đối chiếu ở các mốc thời gian 24 tháng và 36 tháng để xác định chu kỳ đánh giá lại chính thức.
  • Tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất và tinh chế ở quy mô lớn hơn nhằm phục vụ nhu cầu cung cấp chất chuẩn quốc gia cho Quỹ chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
  • Mở rộng ứng dụng chất chuẩn Kaempferol và Nuciferin vào việc xây dựng tiêu chuẩn định lượng cho các thành phẩm đông dược khác có chứa thành phần lá Sen, tâm Sen hoặc các dược liệu chứa flavonoid.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc, Hóa thực vật và Dược liệu: Tham khảo quy trình phân lập, tinh chế các hợp chất tự nhiên đạt độ tinh khiết cao (>95%) và phương pháp giải đoán dữ liệu phổ đa chiều (FT-IR, MS, NMR, DSC).
  • Cán bộ kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh, các Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh, thành phố: Ứng dụng quy trình thẩm định phương pháp phân tích HPLC, quy trình phân tích tạp chất liên quan và phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu theo ISO/IEC 17025.
  • Các doanh nghiệp sản xuất thuốc từ dược liệu: Áp dụng phương pháp định lượng đặc hiệu Conessin trong các chế phẩm trị lỵ amip từ Mức hoa trắng, và Kaempferol trong các chế phẩm tiêu độc, thanh nhiệt từ Đơn lá đỏ nhằm nâng cao chất lượng tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Mục tiêu độ tinh khiết của nguyên liệu làm chất chuẩn trong luận án là bao nhiêu và được xác định bằng phương pháp nào? Mục tiêu độ tinh khiết của ba hợp chất Conessin, Kaempferol và Nuciferin là đạt trên 95% với khối lượng thu hồi tối thiểu 02 gam/chất. Độ tinh khiết nhiệt động tuyệt đối được xác định bằng kỹ thuật quét nhiệt vi sai DSC (kết quả đạt: Conessin 98,62%; Kaempferol 97,85%; Nuciferin 98,14%) kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để kiểm soát tạp chất liên quan.

  2. Giá trị ấn định (GTAĐ) của 03 chất chuẩn đối chiếu được thiết lập là bao nhiêu? Giá trị ấn định được xác định thông qua chương trình đánh giá liên phòng thí nghiệm giữa các đơn vị độc lập và xử lý thống kê, kết quả thu được: Conessin đạt 98,54%; Kaempferol đạt 98,12%; Nuciferin đạt 98,35% (tính trên hàm lượng nguyên trạng).

  3. Các chất chuẩn đối chiếu đã thiết lập có độ ổn định ra sao trong quá trình theo dõi? Chất chuẩn được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8°C, độ ẩm 40%. Sau 9 tháng và 15 tháng theo dõi, các chỉ tiêu về cảm quan, độ ẩm, tạp chất liên quan và hàm lượng hoạt chất của Conessin, Kaempferol và Nuciferin không có sự biến đổi có ý nghĩa thống kê; độ lệch hàm lượng đều nằm trong giới hạn kiểm soát cho phép dưới 1% so với giá trị ấn định ban đầu.

  4. Chất chuẩn thiết lập được ứng dụng để định lượng trên những đối tượng cụ thể nào? Chất chuẩn Kaempferol được ứng dụng xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng hoạt chất trong dược liệu lá Đơn lá đỏ và lá Chè vằng. Chất chuẩn Conessin được ứng dụng định lượng hoạt chất chính trong chế phẩm viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT của Công ty Cổ phần Dược phẩm và Thiết bị Y tế Hà Tĩnh.

  5. Vì sao luận án phải sử dụng phương pháp quét nhiệt vi sai (DSC) bên cạnh HPLC? DSC là phương pháp phân tích nhiệt động học dựa trên sự thay đổi nhiệt lượng trong quá trình chuyển pha nóng chảy của chất tinh khiết. Đây là phương pháp phân tích tuyệt đối, không đòi hỏi phải có chất chuẩn đối chứng bên ngoài, cho phép đo độ tinh khiết nội tại của hợp chất một cách độc lập để phối hợp khẳng định cùng kỹ thuật HPLC.

Kết luận

Luận án đã hoàn thành toàn diện việc xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế 03 hợp chất Conessin (từ vỏ thân Mức hoa trắng), Kaempferol (từ lá Đơn lá đỏ) và Nuciferin (từ lá Sen) đạt khối lượng trên 02 gam mỗi chất với độ tinh khiết trên 95%. Công trình đã thiết lập thành công 03 chất chuẩn đối chiếu phòng thí nghiệm với đầy đủ bộ dữ liệu nhận dạng hóa lý, tiêu chuẩn chất lượng, giá trị ấn định và số liệu độ ổn định sau 15 tháng bảo quản ở 2 – 8°C theo đúng các nguyên tắc quốc tế. Kết quả ứng dụng chất chuẩn vào định lượng hoạt chất trong dược liệu Đơn lá đỏ, Chè vằng và viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT đã chứng minh tính khả thi, độ tin cậy và giá trị thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm và chuẩn hóa chất lượng thuốc từ dược liệu.