Luận văn bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng - ĐH HUTECH

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét plasmodium spp và hướng ứng dụng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn thiện trong

• Tác giả: Trần Minh Quí
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Tiến Thắng
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và Hướng Ứng Dụng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.3. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.4. Nội dung nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa khoa học
• 1.6. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.7. Tổng quan về bệnh sốt rét
• 1.7.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét
• 1.7.2. Định nghĩa bệnh sốt rét
• 1.7.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét
• 1.7.4. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới
• 1.7.5. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam
• 1.7.6. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước
• 1.7.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét
• 1.7.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người
• 1.7.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi
• 1.7.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét
• 1.7.8.1. Định nghĩa kháng thuốc
• 1.7.8.2. Trên thế giới
• 1.7.8.3. Tại Việt Nam
• 1.7.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và Việt Nam
• 1.7.9.1. Trên thế giới
• 1.8. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
• 1.8.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.8.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.8.2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 1.8.2.3. Phương pháp phân tích mẫu
• 1.8.2.4. Phát hiện KST Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa
• 1.8.2.5. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR
• 1.8.2.5.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện KST SR bằng kỹ thuật PCR
• 1.8.2.5.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp.
• 1.8.2.5.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR
• 1.8.2.5.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan đến kháng artemisinin
• 1.8.2.6. Đọc kết quả điện di
• 1.8.2.7. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự
• 1.8.2.7.1. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự
• 1.8.2.7.2. Kỹ thuật PCR giải trình tự
• 1.8.2.7.3. Phân tích kết quả giải trình tự
• 1.8.2.8. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét
• 1.8.2.9. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp.
• 1.8.2.9.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P.
• 1.8.2.9.2. Môi trường nuôi cấy
• 1.8.2.9.3. Chuẩn bị hồng cầu lành
• 1.8.2.9.4. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy
• 1.8.2.9.5. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp.
• 1.8.2.9.6. Điều kiện nuôi cấy
• 1.8.2.9.6.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp.
• 1.8.2.9.6.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa
• 1.8.2.10. Thống kê và xử lý số liệu
• 1.9. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 1.9.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa
• 1.9.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR
• 1.9.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp.
• 1.9.4. Kết quả giải trình tự kháng K13
• 1.9.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi cấy trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm
• 1.9.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13 liên quan đến kháng artemisinin
• 1.10. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra là một trong những vấn đề y tế nghiêm trọng tại các khu vực nhiệt đới. Việc bảo tồn các chủng ký sinh trùng này không chỉ giúp duy trì nguồn gen mà còn hỗ trợ cho các nghiên cứu y học trong tương lai. Nghiên cứu về Plasmodium có thể cung cấp thông tin quý giá về sự phát triển và kháng thuốc của các chủng ký sinh trùng này.

1.1. Định nghĩa và Tình hình Bệnh Sốt Rét

Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Plasmodium gây ra, thường gặp ở các nước nhiệt đới. Tình hình dịch tễ học cho thấy số ca mắc bệnh vẫn còn cao, đặc biệt ở những vùng có điều kiện sống khó khăn.

1.2. Vai trò của Ký Sinh Trùng Plasmodium trong Y Học

Ký sinh trùng Plasmodium không chỉ gây ra bệnh sốt rét mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu về chúng giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả và vaccine phòng ngừa.

II. Vấn đề và Thách thức trong Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng

Việc bảo tồn các chủng ký sinh trùng Plasmodium spp. gặp nhiều thách thức, bao gồm sự kháng thuốc ngày càng gia tăng và sự biến đổi của môi trường sống. Những yếu tố này làm cho việc thu thập và bảo tồn trở nên khó khăn hơn.

2.1. Kháng Thuốc và Tác Động của Plasmodium

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị sốt rét. Các chủng Plasmodium đã phát triển khả năng kháng lại các loại thuốc điều trị, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

2.2. Biến Đổi Môi Trường và Ảnh Hưởng đến Ký Sinh Trùng

Biến đổi khí hậu và các hoạt động con người đã làm thay đổi môi trường sống của muỗi truyền bệnh, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển và lây lan của ký sinh trùng Plasmodium.

III. Phương Pháp Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Plasmodium spp

Để bảo tồn các chủng ký sinh trùng Plasmodium spp., các phương pháp như nuôi cấy trong môi trường thích hợp và bảo quản trong nitơ lỏng được áp dụng. Những phương pháp này giúp duy trì sự sống của các chủng ký sinh trùng trong thời gian dài.

3.1. Nuôi Cấy Chủng Ký Sinh Trùng

Nuôi cấy chủng ký sinh trùng Plasmodium trong môi trường nhân tạo giúp tạo ra các chủng thuần, phục vụ cho nghiên cứu và phát triển thuốc.

3.2. Bảo Quản Chủng Ký Sinh Trùng trong Nitơ Lỏng

Bảo quản trong nitơ lỏng là phương pháp hiệu quả để giữ gìn các chủng ký sinh trùng Plasmodium trong điều kiện lạnh, giúp duy trì tính sinh học của chúng.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn của Nghiên Cứu Bảo Tồn Ký Sinh Trùng

Nghiên cứu về bảo tồn các chủng ký sinh trùng Plasmodium spp. không chỉ có giá trị trong việc phát triển thuốc mà còn hỗ trợ cho các nghiên cứu về vaccine và các phương pháp phòng ngừa bệnh sốt rét.

4.1. Phát Triển Thuốc Điều Trị Mới

Việc bảo tồn các chủng ký sinh trùng giúp các nhà nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới, hiệu quả hơn trong việc điều trị sốt rét.

4.2. Nghiên Cứu Vaccine Phòng Ngừa

Nghiên cứu về các chủng ký sinh trùng Plasmodium có thể dẫn đến việc phát triển vaccine hiệu quả, giúp ngăn ngừa sự lây lan của bệnh sốt rét.

V. Kết Luận và Tương Lai của Bảo Tồn Ký Sinh Trùng

Bảo tồn các chủng ký sinh trùng Plasmodium spp. là một nhiệm vụ quan trọng trong việc đối phó với bệnh sốt rét. Tương lai của nghiên cứu này sẽ phụ thuộc vào sự hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế để phát triển các giải pháp hiệu quả.

5.1. Tầm Quan Trọng của Hợp Tác Quốc Tế

Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu và bảo tồn ký sinh trùng Plasmodium là cần thiết để chia sẻ kiến thức và tài nguyên.

5.2. Định Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp mới để bảo tồn và nghiên cứu các chủng ký sinh trùng, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh sốt rét.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra vẫn là một trong những gánh nặng y tế toàn cầu nghiêm trọng. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, vào năm 2010, thế giới ghi nhận khoảng 216 triệu ca mắc và 655.000 trường hợp tử vong do sốt rét, với 3,3 tỷ người sinh sống tại các vùng có nguy cơ lây nhiễm. Tại Việt Nam, công tác phòng chống sốt rét đã đạt được nhiều thành tựu lớn khi tỷ lệ mắc bệnh liên tục giảm mạnh từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991 xuống còn 0,2 ca/1.000 dân vào năm 2013. Tuy nhiên, cả nước vẫn còn hơn 11,7 triệu người sống trong vùng sốt rét lưu hành, trong đó tỉnh Bình Phước được xác định là điểm nóng với số ca nhiễm chiếm 19,28% tổng số ca bệnh của cả nước vào năm 2015.

Tình hình bệnh sốt rét giảm mạnh trên diện rộng dẫn đến sự khan hiếm nguồn mẫu ký sinh trùng tự nhiên phục vụ công tác nghiên cứu, trong khi tình trạng ký sinh trùng kháng thuốc điều trị, đặc biệt là artemisinin, có diễn biến phức tạp. Đề tài nghiên cứu được triển khai nhằm giải quyết vấn đề cấp bách này với mục tiêu thu thập, nuôi cấy, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trong môi trường nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C, đồng thời bước đầu xây dựng ngân hàng dữ liệu gene mã hóa 18S Ribosome và xác định các đột biến kháng artemisinin. Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017 tại tỉnh Bình Phước và Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch thuộc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng TP. Hồ Chí Minh. Kết quả của công trình mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp nguồn chứng dương đạt độ chính xác 100% cho các xét nghiệm sinh học phân tử và tạo nền tảng vững chắc cho việc phát triển thuốc, vaccine thế hệ mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết chu kỳ sinh học hai giai đoạn của ký sinh trùng sốt rét gồm giai đoạn sinh sản vô tính trong cơ thể người và giai đoạn sinh sản hữu tính trong cơ thể muỗi Anopheles. Trong cơ thể người, ký sinh trùng trải qua các dạng biến thái hình thái học quan trọng gồm: thể nhẫn (ring form), thể tư dưỡng (trophozoite), thể phân liệt (schizont) và thể giao bào (gametocyte). Ký sinh trùng gây bệnh cho người bao gồm 5 loài: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale và Plasmodium knowlesi, trong đó P. falciparum và P. vivax chiếm tỷ lệ chủ yếu với hơn 90% tổng số ca mắc tại Việt Nam.

Khung phân tích kháng thuốc áp dụng hướng dẫn giám sát dịch tễ của Tổ chức Y tế Thế giới về cơ chế kháng artemisinin. Theo mô hình sinh học phân tử, vùng cánh quạt của gene Kelch 13 (K13 propeller) trên nhiễm sắc thể số 13 của P. falciparum được xác định là chỉ thị phân tử cốt lõi. Sự hiện diện của các đột biến điểm không đồng nghĩa tại vùng K13 có liên quan trực tiếp đến hiện tượng làm chậm tốc độ làm sạch ký sinh trùng trong máu bệnh nhân sau điều trị.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế điều tra mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 30 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng như sốt, rét run, tiền sử đi rừng ngủ rẫy và được xác định dương tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa tại tỉnh Bình Phước. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm thu nhận các chủng hoang dã phục vụ nuôi cấy và bảo tồn.

Quy trình phân tích mẫu được tiến hành đồng bộ qua các giai đoạn:

1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu thấm khô trên giấy Whatman 3MM bằng bộ kit màng lọc silica.
2. Thực hiện kỹ thuật Nested-PCR khuếch đại đoạn gene 18S rRNA nhằm định danh chính xác loài với ngưỡng phát hiện đạt 0,1 ký sinh trùng/µl máu, vượt trội so với ngưỡng 10-50 ký sinh trùng/µl của kỹ thuật soi kính hiển vi quang học.
3. Khuếch đại và giải trình tự chuỗi nucleotide vùng gene K13 propeller để phát hiện đột biến điểm kháng artemisinin bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
4. Nuôi cấy in vitro dài ngày các chủng phân lập được theo phương pháp bình nến của Trager và Jensen (1976) trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% huyết thanh người nhóm AB, hồng cầu nhóm O, duy trì ở 37°C với nồng độ 5% CO2 và O2 thấp, sau đó tiến hành hạ nhiệt độ cất đông bảo tồn trong bình nitơ lỏng -196°C.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã thu thập và định danh thành công 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét từ thực địa. Kết quả phân tích sinh học phân tử bằng kỹ thuật Nested-PCR đã xác định được 14 mẫu nhiễm P. falciparum đơn thuần. Khi tiến hành giải trình tự chuỗi gene mã hóa K13 propeller trên 14 chủng P. falciparum này, nghiên cứu phát hiện có tới 9/14 chủng mang đột biến điểm, chiếm tỷ lệ 64,3%.

Tần suất xuất hiện của các điểm đột biến cánh quạt K13 phân bố cụ thể như sau:

• Đột biến C580Y xuất hiện ở 4 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất là 28,6%.
• Đột biến P553L xuất hiện ở 3 chủng, chiếm tỷ lệ 21,4%.
• Đột biến C447G ghi nhận ở 1 chủng, chiếm tỷ lệ 7,1%.
• Đột biến I543T ghi nhận ở 1 chủng, chiếm tỷ lệ 7,1%.

Bên cạnh đó, quy trình nuôi cấy dài ngày trong phòng thí nghiệm đã tạo được các chủng thuần khiết và lưu trữ thành công trong nitơ lỏng ở -196°C, đảm bảo khả năng phục hồi và tái sinh trưởng của ký sinh trùng sau quá trình rã đông đạt hiệu suất ổn định.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ đột biến K13 lên tới 64,3% tại Bình Phước phản ánh mức độ áp lực chọn lọc thuốc rất lớn tại khu vực này. Nguyên nhân xuất phát từ việc sử dụng rộng rãi và kéo dài các dẫn xuất artemisinin, kết hợp với đặc điểm di biến động dân cư phức tạp qua lại giữa biên giới Việt Nam và Campuchia. Tỷ lệ đột biến C580Y chiếm ưu thế (28,6%) hoàn toàn tương đồng với các công bố dịch tễ học phân tử tại khu vực tiểu vùng sông Mê Kông như Tây Campuchia và Đông Nam Myanmar, khẳng định sự lan truyền của dòng ký sinh trùng kháng thuốc trong khu vực.

Dữ liệu so sánh giữa kỹ thuật nhuộm Giemsa truyền thống và Nested-PCR cho thấy kỹ thuật sinh học phân tử giúp loại bỏ các trường hợp chẩn đoán sai sót ở mật độ ký sinh trùng thấp hoặc nhiễm phối hợp nhiều loài. Việc trực quan hóa các kết quả này thông qua biểu đồ phân bố alen đột biến và cây phát sinh loài đã chứng minh tính đa dạng di truyền cao của các chủng sốt rét thu thập tại miền Đông Nam Bộ. Quá trình bảo tồn thành công nguồn chủng sống ở nhiệt độ -196°C tạo ra kho lưu trữ sinh học vô giá trong bối cảnh các ca bệnh tự nhiên đang suy giảm nhanh chóng.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp cụ thể:

1. Tăng cường giám sát dịch tễ học phân tử: Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật và Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng cần định kỳ lấy mẫu giải trình tự gene K13 mỗi 6 tháng tại các vùng trọng điểm sốt rét, hướng tới mục tiêu phát hiện sớm 100% các ổ ký sinh trùng mang đột biến kháng thuốc trước năm 2020.
2. Mở rộng và chuẩn hóa ngân hàng gene và chủng sống: Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch cần duy trì quy trình bảo tồn nitơ lỏng -196°C, bổ sung tối thiểu 20-30 chủng mới mỗi năm từ các vùng sinh thái khác nhau nhằm xây dựng thư viện sinh phẩm phục vụ thử nghiệm thuốc in vitro.
3. Cập nhật và giám sát phác đồ điều trị: Bộ Y tế cùng các cơ sở y tế tuyến tỉnh cần thay thế triệt để các phác đồ đơn trị liệu bằng liệu pháp phối hợp có gốc artemisinin (ACTs) thế hệ mới, đảm bảo tỷ lệ tuân thủ điều trị của bệnh nhân đạt trên 95% nhằm ngăn chặn chủng đột biến C580Y phát tán.
4. Chuẩn hóa kỹ thuật chẩn đoán kép tại tuyến cơ sở: Kết hợp kỹ thuật soi kính hiển vi với các xét nghiệm chẩn đoán nhanh phân tử tại các trạm y tế xã vùng sâu, rút ngắn thời gian phát hiện ca bệnh xuống dưới 24 giờ kể từ khi xuất hiện triệu chứng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ lâm sàng và cán bộ điều trị bệnh truyền nhiễm: Nắm bắt được thực trạng kháng thuốc và sự phân bố của các đột biến K13 tại thực địa, từ đó chỉ định phác đồ điều trị thay thế kịp thời cho các ca bệnh sốt rét dai dẳng.
2. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và ký sinh trùng học: Tiếp cận quy trình chi tiết về nuôi cấy dài ngày bằng bình nến Trager-Jensen, kỹ thuật tách chiết DNA từ máu khô và quy trình Nested-PCR định danh đoạn gene 18S rRNA.
3. Cán bộ quản lý y tế dự phòng và hoạch định chính sách: Sử dụng các dữ liệu dịch tễ học tại Bình Phước để xây dựng chiến lược phòng chống, phân bổ nguồn lực hóa chất và thuốc điều trị phù hợp cho từng vùng nguy cơ.
4. Học viên sau đại học và sinh viên chuyên ngành Y Dược, Sinh học: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo học thuật chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp giữa dịch tễ thực địa và sinh học phân tử hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật Nested-PCR có ưu điểm gì vượt trội so với phương pháp soi kính hiển vi Giemsa? Nested-PCR sử dụng hai cặp mồi liên tiếp để khuếch đại đoạn gene 18S rRNA, giúp nâng cao độ nhạy lên mức 0,1 ký sinh trùng/µl máu, phát hiện chính xác các trường hợp nhiễm mật độ thấp dưới ngưỡng kính hiển vi (10-50 ký sinh trùng/µl) và phân biệt rõ ràng các ca nhiễm phối hợp loài.

Đột biến K13 propeller liên quan như thế nào đến khả năng kháng thuốc artemisinin? Các đột biến không đồng nghĩa trên vùng cánh quạt của protein Kelch 13, đặc biệt là C580Y và P553L, làm biến đổi chức năng protein, dẫn đến khả năng sống sót cao hơn của ký sinh trùng ở thể nhẫn non trước nồng độ thuốc diệt ký sinh trùng, biểu hiện lâm sàng là thời gian làm sạch ký sinh trùng trong máu kéo dài.

Điều kiện môi trường nào là bắt buộc để nuôi cấy thành công ký sinh trùng sốt rét in vitro? Hệ thống nuôi cấy đòi hỏi môi trường RPMI 1640 chuẩn, bổ sung 10% huyết thanh người nhóm AB không có kháng thể kháng sốt rét, hồng cầu người nhóm O lành, duy trì nghiêm ngặt ở nhiệt độ 37°C với thành phần khí nồng độ 5% CO2 và nồng độ O2 thấp trong bình nến chuyên dụng.

Tại sao việc bảo tồn chủng ký sinh trùng trong nitơ lỏng -196°C lại có tính cấp thiết cao? Khi tỷ lệ mắc sốt rét giảm mạnh nhờ các biện pháp phòng chống, nguồn ký sinh trùng tự nhiên tại thực địa trở nên cực kỳ khan hiếm. Trữ đông ở nhiệt độ -196°C giúp bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc di truyền và hoạt tính sinh học của chủng trong nhiều năm phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc và vaccine.

Đột biến C580Y xuất hiện tại Bình Phước có ý nghĩa gì đối với dịch tễ khu vực? Đột biến C580Y chiếm tỷ lệ 28,6% trong nghiên cứu là chỉ dấu phân tử điển hình của dòng ký sinh trùng kháng artemisinin tại tiểu vùng sông Mê Kông. Điều này cho thấy nguy cơ lan truyền kháng thuốc xuyên biên giới và đòi hỏi phải có sự phối hợp giám sát dịch tễ chặt chẽ giữa các quốc gia láng giềng.

Kết luận

• Thu thập và định danh thành công 30 mẫu ký sinh trùng sốt rét từ thực địa Bình Phước, phân lập được 14 chủng Plasmodium falciparum đơn thuần.
• Xác định tỷ lệ mang đột biến kháng artemisinin trên gene K13 propeller ở các chủng P. falciparum lên tới 64,3%.
• Ghi nhận 4 dạng đột biến điểm gồm C580Y (28,6%), P553L (21,4%), C447G (7,1%) và I543T (7,1%), trong đó C580Y chiếm ưu thế tuyệt đối.
• Làm chủ quy trình nuôi cấy in vitro dài ngày và thiết lập hệ thống bảo tồn chủng sống ổn định trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C.
• Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gene 18S rRNA chuẩn, đóng góp nguồn sinh phẩm quan trọng cho công tác kiểm định xét nghiệm và thử nghiệm tiền lâm sàng.

Công trình là bước đột phá trong việc kết hợp giám sát dịch tễ chủ động với bảo tồn nguồn gen vi sinh vật tại Việt Nam. Các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế quan tâm có thể khai thác nguồn chủng và dữ liệu trình tự gene này để phục vụ các dự án thử nghiệm dược chất và hợp tác phát triển vaccine phòng chống sốt rét trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới [12] [17]. Bệnh truyền từ người bệnh qua người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) [3] [5] [17] [45] [58] [74]. Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và Plasmodium knowlesi [4] [5] [12], trong đó Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax là 2 loài thường gặp [3] [6] [7] [45] [74].

Ngày nay, tuy tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm so với những thập niên gần đây, nhưng nó vẫn một vấn đề liên quan đến sức khỏe con người và nhận được sự quan tâm của toàn cầu, là bệnh truyền nhiễm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, kinh tế [4] [71] và gây nhiều thiệt hại, tổn thất cho nhân loại [35], đặc biệt là đối với phụ nữ mang thai và trẻ em [68]. Hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 350 - 500 triệu người mắc SR và hơn 1 triệu người chết do SR. Đến năm 2010, trên thế giới có 216 triệu người mắc SR và 655.000 người chết do SR và có khoàng 3,3 tỷ người sống trong vùng dịch tể sốt rét và có nguy cơ mắc bệnh sốt rét [65]. Theo ước tính của WHO khoảng 40% dân số thế giới hiện nay đang sống trong vùng có nguy cơ mắc SR.

Dân số Việt Nam năm 2013 là 89,9 triệu người, với khoảng 14,4 triệu người sống ở những vùng có SR lưu hành (khoảng 16% dân số), có 35.406 ca SR được ghi nhận, trong đó có 17.128 ca xác định có KST SR (60% số ca xác nhận SR là do KST Plasmodium falciparum gây ra. 6 ca tử vong do SR [1]. Tính cấp thiết của đề tài Tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã liên tục giảm, từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991 xuống 0,87 ca/1.000 dân năm 2001 và năm 2013 chỉ còn 0,2 ca/1. Tỷ lệ mắc sốt rét giảm là do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật để hạn chế số lượng mắc và tử vong do KST SR, nhưng vẫn còn hơn 11 triệu người sống trong vùng dịch tể sốt rét [2].

Theo một báo cáo khác về tình hình tử vong do sốt rét ở Việt Nam, được đăng trên tạp chí The Guardian năm 2012, số ca tử vong do sốt rét/1.000 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 dân ở các năm 1980, 1990, 2000 và 2010 lần lượt là: 57,5 ca; 36,2 ca; 15,0 ca; 1,4 ca [59]. Trước tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm mạnh [7], áp lực điều trị thuốc SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp,. làm cho tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao [62] [63] [69], gia tăng nguy cơ thành dịch SR. Do đó việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR.

Từ các vấn đề trên, đòi hỏi phải có sẵn nguồn chủng KST SR. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine kháng sốt rét sau này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bảo tồn chủng Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng”. Mục tiêu nghiên cứu  Bảo tồn chủng KST SR các mẫu được thu thập ở thực địa, trong quá trình làm đề tài tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí Minh.

 Bước đầu xây dựng trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome từ các mẫu KST SR thu thập được trong quá trình thực đề tài. Nội dung nghiên cứu  Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng – 196oC. + Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa. + Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử nghiệm,.

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 + Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR [40] [46]. + Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST SR [33] [41] [44] [46]. + Giải trình tự đoạn gene kháng thuốc Artemisinin đối với chủng Plasmodium falciparum 1.

Ý nghĩa đề tài Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên kết hợp giữa giám sát ca bệnh chủ động, thu thập và bảo tồn chủng KST SR, đồng thời thời bước đầu xây dựng được trình tự đoạn Gene bảo tồn các chủng KST SR, làm tiền đề cho việc so cho các nghiên cứu sau này. Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như hiện nay. Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác đào tạo nguồn nhân lực y tế. Ý nghĩa khoa học Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR để phát hiện KST SR, đã góp phần vào việc chuẩn đoán chính xác các chủng KST SR gây bệnh SR để có phát đồ điều trị thích hợp.

Góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR, nguồn dữ liệu về Gene trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng thuốc ngày càng gia tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về sốt rét và phát triển thuốc, vaccine sau này. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ý nghĩa thực tiễn Bình Phước là vùng có sốt rét lưu hành, lưu hành nặng nhất là ở các xã vùng sâu, vùng xa, giáp ranh với rừng, biên giới Cam-pu-chia [18]. Trước tình trạng dân di biến động, dân đi rừng, ngủ rẫy [24], thì việc chuẩn đoán nhanh và chính xác ca bệnh sốt rét sẽ giúp y bác sĩ đề ra những biện pháp phòng tránh, có phác đồ điều trị hiệu quả, kịp thời.

Góp phần cho công tác phòng chống sốt rét ở tỉnh Bình Phước riêng và sự thành công của chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia nói chung. Bên cạnh đó việc bảo tồn được nguồn chủng, nguồn gene KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu sau này như: đánh giá hiệu lực của các thuốc điều trị SR thế hệ mới, cũng như nuôi cấy để thử nghiệm trong điều kiện in vitro, nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch, sinh học phân tử, phát triển vaccine chống sốt rét,. là những đóng góp có ý nghĩa của luận văn này. Tổng quan về bệnh sốt rét 1.

Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét Bệnh sốt rét được biết đến cách đây hơn 2000 năm, đã được Hipocrates (Hy Lạp) và bệnh sốt rét được ông mô tả chi tiết từ thế kỷ V trước Công nguyên. Ông phân chia bệnh SR ra nhiều loại như sốt định kỳ mỗi ngày, sốt mỗi hai ngày hoặc mỗi bốn ngày [58]. Nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về bệnh này và đặt ra những tên gọi khác nhau như: ở Trung Quốc gọi là nghịch tật, Việt Nam gọi là sốt rét rừng hay sốt ngã nước, tuy nhiên mới chỉ nêu lên một số đặc điểm lâm sàng và vài yếu tố liên quan [10]. Từ những năm 1600, ở Pêru người da đỏ đã dùng vỏ cây Cinchona để chữa sốt rét, đến năm 1820 Pelletier và Caventou đã chiết xuất ra hoạt chất alkaloide quinine và cinchonin từ vỏ cây Cinchona [21].

Đến thế kỷ XIX từ những hiểu biết khá đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh sốt rét, tác nhân gây bệnh sốt rét, véc tơ truyền bệnh sốt rét, cơ chế lan truyền và chu kỳ phát triển của KST SR. Vào năm 1880, giáo sư Alphonse Laveran (Đại học Rome) lần đầu tiên phát hiện và mô tả KST SR trong máu người, đã mở ra một kỷ nguyên mới về quá trình LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 nghiên cứu sinh bệnh học và các yếu tố liên quan về bệnh sốt rét làm cơ sở cho việc tìm kiếm những chiến lược phòng chống quy mô góp phần giảm thiểu tối đa những thiệt hại do bệnh sốt rét gây nên. Năm 1885, nhà bệnh học Ettore Marchiafava (người Ý) tìm thấy những sinh vật gây bệnh có trong hồng huyết cầu người bệnh và ông đặt tên là Plasmodium. Năm 1897, bác sĩ Sir Ronald Ross (người Anh), chứng minh có sự hiện diện của Plasomodium trong muỗi Anopheles cái.

Năm 1924, Schuleman (Đức) đã phát hiện ra thuốc Pamaquine (Plasmoquine) đến năm 1930 – 1952 hàng loạt thuốc chống sốt rét tổng hợp lần lượt ra đời như Chloroquine, Proguanil, Primaquine. Năm 1974 – 1982, Trung Quốc phát triển thuốc trị sốt rét từ cây Quing Hao Su (Artemisia annua) [21]. Năm 1985 – 1990 Việt Nam đã chiết xuất thành công Artemisinine từ hoạt chất của cây Thanh Hao hoa vàng mọc hoang ở vùng núi phí Bắc làm giảm rõ rệt tử vong sốt rét và sốt rét ác tính [10]. Từ những nghiên cứu trên, các nhà khoa học đã đúc kết lại rằng nguyên nhân của bệnh sốt rét do ký sinh trùng sốt rét (mầm bệnh phát triển trong máu bệnh nhân) được muỗi Anopheles (trung gian truyền bệnh) đốt truyền từ người bệnh sang người lành (cơ thể cảm thụ).

Định nghĩa bệnh sốt rét Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng sốt rét ký sinh trong hồng cầu người bệnh và gây ra bệnh SR với các triệu chứng toàn thân. Bệnh SR có thể gây ra tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, có thể gây ra tử vong (ở thể sốt rét ác tính) [3] [12]. Với các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: cơn sốt rét run, sốt, vã mồ hôi hoặc có kèm theo gan to, lách to hoặc thiếu máu [6] [17] [58]. Bệnh SR lưu hành chủ yếu vùng rừng, đồi, núi, ven biển nước lợ; bệnh xảy ra quanh năm, phát triển mạnh vào mùa mưa [6].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.