Mở đầu Chƣơng 2. Tổng quan tài liệu Chƣơng 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu Chƣơng 4. Kết quả và thảo luận Chƣơng 5.
Kết luận và kiến nghị 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về cây african violet 2. Phân loại và đặc điểm Ngành : Tracheobionta Phân ngành : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Scrophulariales Họ : Gesneriaceae Chi : Saintpaulia Hình 2.
Cây hoa african violet Loài : Saintpaulia ionantha H. thuộc họ Gesneriaceae, giống Saintpaulia H. đƣợc phân loại vào nhóm cây cỏ lƣu niên. Thân cây gồm các lá ngắn, dày và kéo dài chậm chạp, hoặc có thân bò ngang.
Rễ mọc ra từ các đốt thân (Jungnickel, Zaid, 1992). Lá có cuống dày, phiến lá từ dạng hình tim hơi tròn đến hình elip. Các lá mọc đối, khít với nhau và xếp lại giống nhƣ hình vƣơng miện. Lớp lông c ng góp phần vào sự phân biệt giữa các loài.
Các lông tuyến có cuống ngắn hoặc không có cuống thì không có giá trị phân loại trong giống này. Các lông che chở trên lá có thể dài hoặc ngắn, dựng đứng hoặc nằm ngang, sự phân bố các lông trên lá chỉ có ở dạng thẳng đứng, có lá các lông chỉ ở dạng nằm ngang hoặc có cả hai dạng phân bố trên cùng một lá (Jungnickel, Zaid, 1992). Cây african violet phát triển cao khoảng 30 cm. Các lá thuôn tròn thành hình bầu dục, dài 2,5 – 8,5 cm với một cuống 2 – 10 cm, lông mịn, kết cấu nhiều thịt.
Các ho có đƣờng kính 2 – 3 cm, với một thùy tràng hoa có 3 – 10 bông hoặc nhiều hơn trên một cành hoa mảnh mai. Các loài hoang dã có màu tím, xanh nhạt, hoặc trắng. African violet là loài hoa với đ dạng màu sắc, có cánh đơn cánh kép rất đẹp mắt, có thể nở và sống dƣới ánh sáng trắng, ánh sáng nhân tạo, không gian kín nhƣ các văn phòng làm việc mà không phải chăm sóc nhiều. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Tình hình nghiên cứu african violet Nhiều giống Saintpaulia đã đƣợc nhân giống thƣơng mại và sự phát triển của các cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh đƣợc thu nhận nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Các cây con khỏe mạnh, sạch bệnh và giống nhau về mặt di truyền đã đƣợc lƣu trữ trong in vitro trong một thời gian dài (Jungnickel, Zaid, 1992). Theo Bilkey và Cocking (1982), khả năng tái tạo khác nh u củ mô biểu bì và hạ bì ở Saintpaulia ionantha H. tùy thuộc vào môi trƣờng muối khoáng cơ bản đƣợc sử dụng trong nuôi cấy.
Môi trƣờng chứa 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA cho sự tạo thành mô sẹo trên cuống lá cắt ngang còn nguyên lớp tế bào biểu bì và trên cuống lá bị tách bỏ lớp biểu bì (chỉ còn lớp các tế bào hạ bì). Sự tạo cây chỉ xảy ra trên cuống lá có chứa các lớp tế bào biểu bì. Trên môi trƣờng B5 với cùng nồng độ các chất điều hò sinh trƣởng đã diễn ra sự tạo chồi trên cả hai loại mẫu cấy. Khi trồng các cây thu đƣợc trên cả hai loại mô biểu bì và hạ bì đến khi ra hoa,các tác giả nhận thấy rằng, các cây thu đƣợc từ mô hạ bì khỏe mạnh hơn, lớn hơn về khối lƣợng tƣơi 25%, đƣờng kính lá lớn hơn 11%, nhiều lá hơn 28%, cuống lá mập hơn 14% và dài hơn 18% so với các cây thu từ các lớp tế bào biểu bì.
Theo Dallon (1987), từ lá, cuống lá và phần phát hoa của african violet có thể phát sinh tạo cơ qu n bình thƣờng và hoàn chỉnh trên môi trƣờng có 0,5 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l NAA. Theo George (1993), việc nuôi cấy phát hoa in vitro của các cây african violet thể khảm đã tạo ra các cây con đồng kiểu gene với cây mẹ. Điều này có thể là do các chồi con đƣợc tạo ra từ đỉnh sinh trƣởng bên hoặc đỉnh sinh trƣờng củ phát ho đã biệt hóa thành chồi sinh dƣỡng. Chồi con african violet có thể nuôi cấy đƣợc trong môi trƣờng đơn giản gồm 23 g đƣờng, 240 ml nƣớc cất, 1 viên inositol 125 mg, 1 viên vitamin có chứa B1 và các khoáng tố, 4 muỗng nƣớc dừa và 1 viên vôi nhỏ để điều chỉnh pH.
H koz ki (1993) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng và pH môi trƣờng lên sự tạo mô sẹo, tái sinh và tăng trƣởng chồi từ lá african violet. Thời gian hình thành mô sẹo và chồi ngắn nhất trên môi trƣờng MS có chứ 30 g/l đƣờng, pH 5,8 và đây c ng là môi trƣờng cho chỉ số tái sinh chồi cao nhất. Shizuk Ohki (1993) đã qu n sát các th y đổi bề mặt mô học của 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com quá trình biệt hóa chồi từ lá cây african violet bằng kính hiển vi điện tử SEM (scanning electron microscopy). Trong nghiên cứu này, Ohki qu n sát động thái của các sự th y đổi ở các tế bào biểu bì của lá trong suốt quá trình nuôi cấy và xác định sự tồn tại của các loại tế bào đặc biệt mà chúng sẽ tạo ra chồi.
Đồng thời c ng xác định nồng độ chất điều hò sinh trƣởng ảnh hƣởng đến sự tạo chồi trực tiếp không qua sự hình thành mô sẹo trên các giống đƣợc thử nghiệm. Phạm Tấn Trƣờng và Võ Thị Bạch M i (2008) đã vào mẫu thành công cây Saintpaulia spp. khi sử dụng Ca(ClO)2 10% trong 10 phút và c ng đạt kết quả tƣơng tự khi dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút; theo các tác giả, môi trƣờng 0,5 mg/l IBA và 2,5 mg/l BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất và môi trƣờng chứa 0,5 mg/l IBA cho khả năng tạo rễ cao nhất. Nguyễn Thị Kim Luyến và đồng tác giả (2008) cho rằng trong sự ra hoa của african violet, mô phân sinh ngọn ở nách lá hoạt động trở thành mô phân sinh hoa và cuối cùng thành nụ ho đầu tiên.
Các nụ ho s u đó xuất hiện ở bên dƣới nụ hoa đầu tiên. C ng trong nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận acid salicylic có khả năng cảm ứng sự chuyển mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh hoa. Bên cạnh đó, nồng độ AgNO3 2,5x10-4 g/l giúp cho sự nở và ngăn cản sự héo sớm của hoa african violet in vitro. Sơ lƣợc về giai đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sơ đồ xử lý mẫu cấy ex vitro: Mẫu cấy ex vitro Rửa kỹ bằng xà phòng và nƣớc máy Cho vào bình tam giác ngâm trong cồn 70oC khoảng 20 – 60 giây Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Tiếp tục lắc mẫu trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25% trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80 Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 5 – 6 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử Mẫu cấy Cấy lên môi trƣờng nuôi cấy Hình 2.
Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy (Minh, 2004) 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong quá trình xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn; các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng, loại bỏ những phần bị dập trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nuôi cấy (Minh, 2004). Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài r , ngƣời ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn.
Street (1975) đã đƣ r khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ s u: Bảng 2. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác nhân vô trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý (phút) Hypochlorite calcium [Ca(ClO)2] 9 – 10% 5 – 30 Hypochlorite sodium (NaClO) 2% 5 – 30 Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12% 5 – 15 Nƣớc brom 1 – 2% 2 – 10 Mecury chloride (HgCl2) 0,1 – 1% 2 – 10 Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 2. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 2. Giới thiệu Ca(ClO)2 là một hợp chất thuộc nhóm chlorine, có màu trắng, dễ t n trong nƣớc, giải phóng khí Cl2 làm cho nƣớc có mùi hắc đặc trƣng.
Trong công nghệ hó học: dùng trong nƣớc sơn, chất hò t n, chất tạo bọt, thuốc trừ sâu, hó chất chống đông,… Xử lý nƣớc sinh hoạt, nƣớc thải công nghiệp và khu đô thị. Trong thủy sản: tẩy trùng o, hồ, tr ng thiết bị, dụng cụ,… Diệt vi khuẩn, virus, tảo, vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc. Oxi hó các vật chất hữu cơ và mầm bệnh ngoại l i trong sản xuất 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Trong nuôi cấy mô thực vật: sử dụng nhƣ một chất để khử trùng khi đƣ các nguồn mẫu b n đầu từ môi trƣờng ex vitro chuyển s ng in vitro, nồng độ từ 5 – 10% trong khoảng từ 5 – 30 phút.
Ca(ClO)2 là chất oxi hó mạnh có tác dụng oxi hó vật chất hữu cơ sống trên cơ thể sinh vật. Chúng tác động lên thành tế bào, hệ enzyme củ vi sinh vật tiếp xúc với Ca(ClO)2 thì nguyên tử hydro trong cấu trúc phân tử đƣợc th y thế bởi Cl2, phá hủy hệ enzyme củ vi khuẩn, gây chết vi sinh vật. Nhƣợc điểm Ca(ClO)2 có tính ăn mòn c o và đây c ng chính là cơ chế diệt khuẩn của chúng – ăn mòn màng tế bào; vì thế, chúng t không khó để gặp phải tình trạng mẫu cấy sống nhƣng bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm hay mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, không nhiễm nấm nhƣng lại chết hoặc không thể tái sinh; bởi vì các mô tế bào thực vật rất dễ bị tổn thƣơng khi tiếp xúc với Ca(ClO)2 dẫn đến mẫu cấy sẽ khó tái sinh, thời gian tái sinh kéo dài.