Tổng quan nghiên cứu

Ung thư da là một trong những bệnh lý ác tính có tốc độ gia tăng nhanh chóng trên toàn cầu, với khoảng 2 đến 3 triệu ca ung thư da không hắc tố và hơn 130.000 ca ung thư da hắc tố (melanoma) mới được ghi nhận mỗi năm. Mặc dù melanoma chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong tổng số các ca mắc ung thư da, nhưng căn bệnh này lại là nguyên nhân dẫn đến hơn 50% tổng số ca tử vong do ung thư da trên toàn thế giới. Tại Hoa Kỳ, số liệu thống kê ghi nhận hơn 135.000 trường hợp chẩn đoán mới hàng năm, trong đó có khoảng 73.870 ca u ác tính có xu hướng di căn xâm lấn. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư da dao động trong khoảng 2,9 đến 4,5 ca trên 100.000 dân với tỷ lệ tử vong ước tính từ 0,2 đến 0,4 trên 100.000 dân. Đáng chú ý, thống kê lâm sàng tại Bệnh viện Da liễu Trung ương cho thấy số ca ung thư da điều trị năm 2013 đã tăng gấp 3 lần so với năm 2009.

Vấn đề nghiên cứu then chốt xuất phát từ thực trạng phần lớn bệnh nhân melanoma tại nước ta chỉ được phát hiện khi đã ở giai đoạn muộn (giai đoạn III hoặc IV), khi khối u đã di căn đến các hạch bạch huyết khu vực hoặc các cơ quan nội tạng xa như phổi, gan và não. Ở giai đoạn này, tỷ lệ sống sót sau 5 năm sụt giảm nghiêm trọng từ 69% ở giai đoạn IIIA xuống chỉ còn 7% đến 9% ở giai đoạn IV. Cơ chế sinh học phân tử điều hòa quá trình xâm lấn và di căn của tế bào melanoma vẫn còn nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ, đặc biệt là vai trò của các protein điều hòa liên quan đến phức hợp Deltex.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là tạo dòng tế bào ung thư da dạng melanoma G361 có biểu hiện tăng cường protein BBAP (B-lymphoma and BAL associated protein), đồng thời khảo sát bước đầu ảnh hưởng của protein BBAP lên khả năng xâm lấn, di căn của tế bào G361 thông qua các con đường truyền tín hiệu nội bào quan trọng.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm từ năm 2014 đến tháng 12 năm 2015 tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh học và Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phối hợp cùng Phòng thí nghiệm Y Sinh học thuộc Đại học Nagoya và Đại học Chubu (Nhật Bản). Luận văn được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong khuôn khổ đề tài mã số 106-NN.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp dẫn liệu thực nghiệm đầu tiên về vai trò của BBAP trong bệnh sinh melanoma, xác định mối liên hệ trực tiếp giữa mức độ biểu hiện BBAP và hoạt tính xâm lấn tế bào qua trục tín hiệu FAK/AKT. Kết quả này mở ra hướng tiếp cận mới trong việc xác lập các dấu ấn sinh học chẩn đoán sớm và phát triển các liệu pháp điều trị trúng đích nhằm kiểm soát quá trình di căn của ung thư da.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử ung thư hiện đại, tập trung vào hai trục tín hiệu trung tâm:

Con đường tín hiệu NOTCH và PI3K/AKT: Tín hiệu NOTCH đóng vai trò thiết yếu trong việc định đoạt số phận tế bào gốc và duy trì các tổn thương tiền ung thư. Khi tín hiệu NOTCH bị kích hoạt bất thường, nó thúc đẩy quá trình chuyển tiếp biểu mô - trung mô (EMT), ngăn chặn quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và kích thích hình thành mạch máu nuôi khối u. Sự biến đổi này thường phối hợp với con đường chuyển hóa PI3K/AKT. Kinase AKT (bao gồm các đồng dạng Akt1, Akt2, Akt3) khi được phosphoryl hóa sẽ hoạt hóa chuỗi phản ứng nội bào thúc đẩy tế bào khối u tăng sinh vô hạn và xâm lấn qua màng đáy.

Mô hình cấu trúc và chức năng của họ protein Deltex và BBAP: BBAP (còn gọi là DTX3L - Deltex-3-like) là một thành viên của họ protein Deltex, có kích thước 740 acid amin và hoạt tính của một enzym E3 ubiquitin ligase. Gen mã hóa BBAP nằm trên băng 2.1 của cánh dài nhiễm sắc thể số 3 (3q21), có chung vùng promoter với gen BAL1 (B aggressive lymphoma 1). Cấu trúc của BBAP chứa hai vùng tín hiệu định vị nhân (aa 20-26 và 462-478), một vùng xuất nhân (aa 325-334) và một domain RING-HC ở đầu C-terminal (aa 561-599) có độ bảo tồn tiến hóa cao. BBAP tham gia vào quá trình monoubiquitin hóa protein Histone H4, điều hòa đáp ứng sửa chữa tổn thương DNA và liên kết chặt chẽ với động lực di căn của nhiều dòng tế bào ung thư.

Các khái niệm chính được ứng dụng xuyên suốt gồm: Ung thư hắc tố ác tính (Malignant Melanoma), Kinase bám dính khu trú FAK (Focal Adhesion Kinase), Kinase serine/threonine AKT và Hiện tượng xâm lấn qua chất nền ngoại bào in vitro (In vitro Cell Invasion).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và mẫu vật nghiên cứu: Nghiên cứu sử dụng 6 dòng tế bào ung thư hắc tố da gồm SKMEL-28, G361, MNT1, SKMEL-37, A375P, A375M được cung cấp bởi Đại học Nagoya (Nhật Bản), đối chiếu với dòng tế bào hắc tố biểu bì người bình thường (NHEM). Đồng thời, các mẫu mô u lành tính, u tiền ác tính và mô ung thư ác tính được thu thập từ mô hình chuột chuyển gen 304-RET (304-RET-Transgenic mice). Phương pháp chọn mẫu tập trung vào việc sàng lọc mức độ biểu hiện tự nhiên của BBAP nhằm xác định dòng tế bào có mức biểu hiện thấp nhất (G361) để làm đối tượng biến nạp gen tái tổ hợp.

Phương pháp phân tích thực nghiệm:

  • Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kít High Pure RNA (Roche) và tổng hợp cDNA bằng enzym phiên mã ngược SuperScript III (Invitrogen).
  • Nhân dòng gen BBAP bằng kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu trên hệ thống máy GenAmp PCR System 9700. Cặp mồi khuếch đại gen gồm mồi xuôi 5'-AAA CAC CGT CTG GTG ATA TGC-3' (21 bp) và mồi ngược 5'-GTA TGC CCT CTG CTC TTT GG-3' (20 bp). Cặp mồi tạo dòng gồm mồi xuôi 5'-GAC ATT TCA GCT GCC AAA CAA A-3' (22 bp) và mồi ngược 5'-TCG ATC TCT GAT ATC TCC TGT AG-3' (23 bp).
  • Tạo vector nhân dòng pGEMT-easy (3,0 kb) và chuyển nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5α, chọn lọc thể biến nạp bằng hệ thống màu khuẩn lạc trắng/xanh với X-gal và IPTG 0,5 mM.
  • Tái tổ hợp gen BBAP vào vector biểu hiện thế hệ mới pCMV-Flag tagged (4,8 kb) và chuyển nạp vào tế bào melanoma G361 bằng phương pháp màng phức hệ Cationic Lipid (Lipofectamine LTX phối hợp PLUS Reagent).
  • Định lượng mức độ phiên mã gen bằng kỹ thuật Real-time PCR trên hệ thống ABI Prism 7500 Sequence Detection System với hóa chất Power SYBR Green Master Mix, sử dụng gen TATA-box-binding làm nội chứng.
  • Định lượng mức độ biểu hiện protein bằng Western Blot điện di gel SDS-PAGE, thẩm tách lên màng lai nitrocellulose và ủ với các kháng thể đơn dòng đặc hiệu: kháng thể kháng BBAP (81 kDa), p-FAK Tyr397 (125 kDa), FAK tổng số (125 kDa), p-AKT Thr308 (60 kDa), AKT tổng số (60 kDa) và kháng thể nội chứng Tubulin (50 kDa).
  • Đánh giá khả năng xâm lấn tế bào in vitro qua buồng khuếch tán Boyden chamber phủ màng sinh học tái tạo Matrigel, nhuộm cố định bằng dung dịch Hematoxylin - Eosin và đếm số lượng tế bào di chuyển dưới kính hiển vi quang học.

Timeline nghiên cứu: Toàn bộ quy trình từ khâu nuôi cấy tế bào, tạo dòng plasmid tái tổ hợp, chuyển nạp liposome đến phân tích Western Blot và thử nghiệm xâm lấn được thực hiện liên tục trong thời gian 12 tháng (từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Khảo sát biểu hiện BBAP trên mô và các dòng tế bào: Phân tích Real-time PCR cho thấy mức độ biểu hiện mRNA của gen BBAP ở các dòng tế bào melanoma cao vượt trội so với tế bào da bình thường NHEM. Cụ thể, dòng SKMEL-28 có mức biểu hiện BBAP cao gấp khoảng 4,5 lần và dòng A375 cao gấp 3,8 lần so với NHEM. Trên mô hình chuột chuyển gen 304-RET, mức phiên mã BBAP trong mô ung thư ác tính cao hơn 280% so với mô u lành tính và cao hơn 160% so với mô tiền ung thư. Đáng chú ý, dòng tế bào melanoma G361 có mức biểu hiện BBAP tự nhiên rất thấp, chỉ tương đương khoảng 25% so với dòng SKMEL-28.

Tạo dòng thành công tế bào G361 tăng cường biểu hiện BBAP: Gen mã hóa BBAP kích thước khoảng 2,2 kb được nhân dòng thành công vào vector nhân dòng pGEMT-easy và sau đó gắn chính xác vào vector biểu hiện pCMV-Flag tagged (4,8 kb). Sau khi chuyển nạp vector tái tổ hợp vào tế bào G361 thông qua phức hợp liposome, phân tích Western Blot xác nhận sự hiện diện mạnh mẽ của protein BBAP có trọng lượng phân tử 81 kDa. Mức độ biểu hiện protein BBAP trong dòng G361 mang plasmid tái tổ hợp cao gấp hơn 4,2 lần so với dòng G361 nguyên bản và dòng G361 mang vector rỗng đối chứng.

Gia tăng vượt bậc khả năng xâm lấn in vitro: Thử nghiệm trên buồng Boyden chamber phủ Matrigel sau 24 đến 48 giờ nuôi cấy ghi nhận số lượng tế bào G361-BBAP xâm lấn xuyên qua màng lọc tăng từ 210% đến 260% so với nhóm tế bào G361 đối chứng không mang gen tái tổ hợp. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê rõ rệt, chứng minh BBAP thúc đẩy mạnh mẽ khả năng tiêu hủy chất nền và vận động xuyên màng của tế bào ung thư.

Hoạt hóa con đường truyền tín hiệu FAK/AKT: Phân tích mức độ phosphoryl hóa các protein truyền tin chỉ ra rằng sự gia tăng protein BBAP trong tế bào G361 kích hoạt mạnh mẽ sự phosphoryl hóa FAK tại vị trí Tyrosine 397 (125 kDa), đạt mức tăng khoảng 185% so với đối chứng. Đồng thời, mức độ phosphoryl hóa AKT tại vị trí Threonine 308 (60 kDa) tăng hơn 220%. Trong khi đó, hàm lượng protein tổng số của FAK (125 kDa) và AKT (60 kDa) vẫn duy trì ổn định, với mức đối chứng nội bào Tubulin (50 kDa) đồng đều giữa các mẫu thử.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm đã làm sáng tỏ cơ chế sinh học phân tử qua đó BBAP đóng vai trò như một yếu tố điều hòa dương tính đối với động lực xâm lấn của tế bào ung thư da hắc tố. Protein FAK (Focal Adhesion Kinase) là một tyrosine kinase tế bào chất định vị tại các điểm bám dính khu trú, giữ vai trò then chốt trong việc tái tổ chức bộ khung xương tế bào actin và tương tác với thụ thể integrin để kích hoạt quá trình di chuyển tế bào. Sự gia tăng phosphoryl hóa FAK tại vị trí Tyrosine 397 dưới tác động của BBAP tạo điều kiện hình thành phức hợp FAK-Src, từ đó kích hoạt tiếp dòng thác phosphoryl hóa AKT tại vị trí Threonine 308.

Con đường AKT được hoạt hóa sẽ truyền tín hiệu ức chế các con đường chết tế bào theo chương trình và kích hoạt các enzym tiêu hủy chất nền ngoại bào (như Matrix Metalloproteinases - MMPs), giúp tế bào melanoma dễ dàng xâm lấn qua màng đáy biểu bì để tiến vào lớp trung bì và hệ thống mao mạch.

Dữ liệu nghiên cứu được trình bày một cách chuẩn mực và trực quan qua hệ thống biểu đồ cột so sánh tỷ lệ phiên mã tương đối của mRNA, hình ảnh điện di gel agarose kiểm tra kích thước đoạn gen cắt bằng enzym giới hạn, và các băng tín hiệu Western Blot sắc nét. Biểu đồ định lượng mật độ quang học của các băng protein p-FAK (Tyr397) và p-AKT (Thr308) khi chuẩn hóa với băng nội chứng Tubulin đã cung cấp bằng chứng định lượng thuyết phục về sự tương quan trực tiếp giữa hàm lượng BBAP và trạng thái hoạt hóa của trục FAK/AKT.

So sánh với các công bố quốc tế về u lympho tế bào B lớn lan tỏa (DLBCL) và ung thư vú, phát hiện của luận văn khẳng định BBAP không chỉ tham gia sửa chữa DNA gây kháng hóa trị mà còn là một mắt xích then chốt thúc đẩy kiểu hình di căn xâm lấn trong ung thư da dạng melanoma.

Đề xuất và khuyến nghị

Từ các kết quả nghiên cứu thực nghiệm đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm khuyến nghị và giải pháp hành động cụ thể:

  1. Xây dựng quy trình sàng lọc dấu ấn sinh học BBAP phục vụ chẩn đoán sớm: Khuyến nghị các viện nghiên cứu ung bướu và trung tâm giải phẫu bệnh triển khai kỹ thuật hóa mô miễn dịch và Real-time PCR định lượng mức độ biểu hiện protein BBAP trên các mẫu sinh thiết nốt ruồi loạn sản hoặc tổn thương da nghi ngờ. Mục tiêu là nâng cao độ nhạy chẩn đoán giai đoạn xâm lấn sớm lên 35%, hoàn thành việc chuẩn hóa quy trình kỹ thuật trong lộ trình 18 đến 24 tháng tới do nhóm nghiên cứu sinh học phân tử chủ trì.

  2. Nghiên cứu phát triển các phân tử ức chế đặc hiệu hoạt tính của BBAP: Đề xuất các đơn vị dược lý học và công nghệ sinh học thiết kế các hợp chất phân tử nhỏ hoặc peptide can thiệp nhằm ức chế domain RING-HC của enzym E3 ligase BBAP. Giải pháp này hướng tới mục tiêu giảm ít nhất 50% khả năng xâm lấn của tế bào khối u in vitro, thực hiện trong khung thời gian 3 đến 5 năm với sự phối hợp của các trường đại học y dược.

  3. Thử nghiệm kết hợp thuốc ức chế trục tín hiệu FAK/AKT trong phác đồ điều trị melanoma: Khuyến nghị các bác sĩ ung bướu lâm sàng và các nhóm nghiên cứu tiền lâm sàng đánh giá hiệu quả phối hợp giữa các chất ức chế FAK (như Defactinib) và ức chế AKT cùng với hóa trị liệu truyền thống. Mục tiêu là giảm 40% tỷ lệ kháng thuốc và hạn chế nguy cơ tái phát di căn, triển khai thử nghiệm trên mô hình động vật trong thời gian 24 tháng.

  4. Tăng cường chương trình truyền thông y tế dự phòng ung thư da trong cộng đồng: Đề nghị Bộ Y tế và Bệnh viện Da liễu Trung ương đẩy mạnh chiến dịch giáo dục sức khỏe về các dấu hiệu cảnh báo ung thư hắc tố theo quy tắc ABCDE (Bất đối xứng, Bờ không đều, Màu sắc biến đổi, Đường kính trên 6mm, Độ dày phát triển). Mục tiêu nâng cao 60% nhận thức của người dân tại các vùng có cường độ bức xạ tia tử ngoại cao trong vòng 12 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

  1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Di truyền học và Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình chuẩn hóa từ tách chiết RNA, thiết kế mồi PCR, tạo dòng plasmid tái tổ hợp trên vector pGEMT-easy và pCMV-Flag tagged, kỹ thuật chuyển gen bằng cationic liposome cho đến phân tích Western Blot và Real-time PCR. Đây là tài liệu tham khảo trực tiếp phục vụ triển khai các đề tài nghiên cứu thao tác gen trên tế bào động vật.

  2. Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Da liễu: Luận văn giúp cập nhật nền tảng sinh học phân tử sâu sắc về cơ chế tiến triển của melanoma từ u lành sang u xâm lấn, hỗ trợ bác sĩ lâm sàng trong việc đánh giá tiên lượng di căn hạch dựa trên các đột biến và biến đổi biểu hiện protein.

  3. Chuyên viên nghiên cứu và phát triển thuốc (R&D) tại các công ty dược sinh học: Dữ liệu về hoạt tính của BBAP và chuỗi tín hiệu FAK/AKT cung cấp cơ sở khoa học để thiết lập các mô hình sàng lọc hoạt chất kháng ung thư mới nhắm trúng đích phân tử.

  4. Giảng viên và sinh viên các trường Đại học Y Dược và Khoa học Tự nhiên: Tài liệu đóng vai trò như một giáo trình tham khảo chuyên đề chất lượng cao cho các môn học Sinh học ung thư, Sinh học phân tử nâng cao và Kỹ thuật nuôi cấy tế bào mô bào.

Câu hỏi thường gặp

  1. Protein BBAP có nguồn gốc và chức năng sinh học chính là gì? BBAP (B-lymphoma and BAL associated protein) là một protein gồm 740 acid amin có hoạt tính E3 ubiquitin ligase, định vị trên nhiễm sắc thể 3q21. BBAP có chức năng monoubiquitin hóa Histone H4 giúp tế bào sửa chữa DNA bị tổn thương. Trong tế bào ung thư, sự tăng cường biểu hiện của BBAP kích hoạt các kinase nội bào thúc đẩy khối u tăng sinh và di căn.

  2. Tại sao nghiên cứu lại chọn dòng tế bào G361 để tiến hành chuyển nạp gen? Dòng tế bào melanoma G361 có đặc tính sinh học đặc biệt với mức biểu hiện BBAP tự nhiên rất thấp, chỉ bằng khoảng 25% so với dòng SKMEL-28. Đây là mô hình tế bào lý tưởng để tạo dòng biểu hiện tăng cường pCMV-Flag-BBAP, giúp quan sát rõ rệt sự thay đổi kiểu hình xâm lấn và trạng thái phosphoryl hóa protein trước và sau can thiệp.

  3. Phương pháp buồng Boyden chamber đánh giá khả năng nào của tế bào ung thư? Buồng Boyden chamber phủ màng sinh học Matrigel mô phỏng cấu trúc chất nền ngoại bào của màng đáy trong cơ thể. Thử nghiệm này đo lường chính xác số lượng tế bào ung thư có khả năng tự tiết enzym tiêu hủy chất nền và vận động xuyên qua các lỗ màng lọc, phản ánh trực tiếp năng lực xâm lấn và di căn in vitro của tế bào.

  4. Trục tín hiệu FAK/AKT bị BBAP chi phối như thế nào trong tế bào melanoma? BBAP làm tăng cường độ phosphoryl hóa của FAK tại vị trí Tyrosine 397 lên khoảng 185% và AKT tại vị trí Threonine 308 lên hơn 220%, mà không làm thay đổi tổng lượng protein FAK và AKT. Trạng thái hoạt hóa kép này kích thích tái cấu trúc khung tế bào và tăng cường bám dính động, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào melanoma xâm lấn mô xung quanh.

  5. Nghiên cứu trên mô hình chuột chuyển gen 304-RET mang lại giá trị gì cho luận văn? Mô hình chuột 304-RET có khả năng tự phát triển khối u trải qua đầy đủ 3 giai đoạn: u lành tính, tiền ung thư và ung thư ác tính. Việc định lượng biểu hiện BBAP tăng dần theo từng giai đoạn tiến triển trên mô chuột chứng minh BBAP là một yếu tố đồng hành trực tiếp trong quá trình ác tính hóa tế bào hắc tố.

Kết luận

  • Luận văn đã xác định thành công sự biểu hiện tăng cường rõ rệt của gen và protein BBAP trong các mô ung thư ác tính và các dòng tế bào melanoma so với tế bào da người bình thường.
  • Thiết kế và chuyển nạp thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pCMV-Flag-BBAP vào dòng tế bào melanoma G361 bằng phương pháp màng cationic liposome, làm tăng mức biểu hiện protein BBAP lên gấp hơn 4,2 lần.
  • Chứng minh thực nghiệm rằng sự tăng cường protein BBAP làm gia tăng khả năng xâm lấn in vitro của tế bào G361 qua màng Matrigel từ 210% đến 260% trong buồng Boyden chamber.
  • Làm sáng tỏ cơ chế phân tử điều hòa xâm lấn của BBAP thông qua việc kích hoạt trạng thái phosphoryl hóa của kinase bám dính FAK tại Tyrosine 397 và kinase AKT tại Threonine 308.
  • Đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho các nghiên cứu tiếp nối giai đoạn 2016-2020 nhằm phát triển liệu pháp điều trị trúng đích ức chế di căn ung thư da hắc tố.

Để khai thác tối đa các giá trị khoa học từ đề tài, các nhà nghiên cứu và chuyên gia y tế được khuyến khích tiếp tục mở rộng thử nghiệm ức chế BBAP trên các mô hình động vật sống nhằm sớm hoàn thiện các giải pháp can thiệp lâm sàng hiệu quả cho người bệnh.