BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PULLULAN TRONG SẢN XUẤT BÁNH KẸO VÀ BẢO QUẢN THỊT” Chủ nhiệm Đề tài: NGÔ THỊ VÂN 7314 23/4/2009 Hà Nội, 12-2008 1 I.1 C¬ së ph¸p lý /xuÊt xø cña ®Ò tµi • C¨n cø vµo QuyÕt ®Þnh sè 1999/Q§-BCT ngµy 03 th¸ng 12 n¨m 2007 cña Bé tr−ëng Bé C«ng nghiÖp vÒ viÖc giao kÕ ho¹ch KHCN n¨m 2008; • C¨n cø vµo Hîp ®ång nghiªn cøu Khoa häc vµ Ph¸t triÓn C«ng nghÖ sè 85.08RD/H§- KHCN gi÷a Bé C«ng th−¬ng vµ ViÖn C«ng nghiÖp Thùc phÈm ký ngµy 28 th¸ng 01 n¨m 2008 ( Chi tiÕt xem trong phÇn phô lôc) 2 1.2 TÝnh cÊp thiÕt vµ môc tiªu cña ®Ò tµi 1. TÝnh cÊp thiÕt cña ®Ò tµi Một sản phẩm mới cã nguån gèc sinh häc ®ang ®−îc chó ý, quan t©m nhiÒu trªn thế giới hiÖn nay lµ pullulan. Pullulan có những tính chất như là tan hoàn toàn trong nước l¹nh t¹o dung dÞch cã ®é nhít, độ dÝnh cao, dung dÞch trong vµ æn ®Þnh, kh«ng hoµ tan trong dung m«i h÷u c¬, chịu được khoảng pH rộng 2- 12, kh«ng t¹o gel, cã søc c¨ng bÒ mÆt lín h¬n n−íc, nhiÖt ®é ch¸y 250- 2800 C. Dung dÞch pullulan dÔ dµng h×nh thµnh mµng film máng trong suèt, có thể tô màu, trang trí lên và ®Æc biÖt h¬n là mµng pullulan ngăn không cho không khí thấm qua, cã thÓ so s¸nh víi polypropulen, polyeste, polyvinyl [4,17,18] Chính vì c¸c ®Æc tÝnh trªn nªn pullulan được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược, mü phÈm và các ngành công nghiệp khác( Desh et al.
Trong công nghiệp thực phẩm, pullulan được sử dụng ®Ó t¨ng ®é bãng, gi÷ mµu s¾c, n©ng cao chÊt l−îng cña s¶n phÈm kÑo, làm tăng độ nhớt, ®é dÝnh cho đồ uống, kem, xúc xích. Màng pullulan có khả năng ngăn không cho không khí thấm qua nên được sử dụng để bao gói, phñ bªn ngoµi cho các sản phẩm thực phẩm chèng oxy ho¸ nhÊt lµ c¸c s¶n phÈm cã dÇu vµ t¨ng c−êng kh¶ n¨ng chèng mÊt mµu cña s¶n phÈm. Ngoài ra, pullulan được sử dụng là thực phẩm chức năng (thực phẩm ít calo). Trong công nghệ dược phẩm, y học, pullulan được sử dụng để làm vỏ nang thuốc t©n d−îc, làm chất giữ cân bằng áp suất trong máu.
Trong công nghệ mĩ phẩm, víi kh¶ n¨ng kÕt dÝnh cao pullulan ®−îc øng dông trong s¶n xuÊt dÇu géi ®Çu, lµm chÊt t¹o sîi, t¹o bät vµ ®é nhít thÊp gióp cho dÞch dÔ thÊm s©u vµo da, tãc. Trong các ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt thì nó là tác nhân hồ vải. Víi kh¶ n¨ng t¹o mµng máng trong suèt, ng¨n oxy pullulan ®ang ®ù¬c chó ý nh− mét nguån nguyªn liÖu míi thay thÕ mét phÇn bao b× polyethylen nh»m gi¶i quyÕt vÊn ®Ò « nhiÔm m«i tr−êng bøc b¸ch hiÖn nay. 3 HiÖn nay pullulan được nghiªn cøu vµ sản xuất trên quy mô công nghiệp ở rất nhiều nước trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Thổ Nhĩ Kỳ .C¸c C«ng ty lín s¶n xuÊt pullulan lµ C«ng ty Hayashibare Biochemical – Osaka NhËt b¶n víi s¶n phÈm pullulan PI20 øng dông nhiÒu trong ngµnh thùc phÈm, d−îc phÈm.
C¸c c«ng ty Ayurvedic Remedie Holistic, c«ng ty Feinkost ingredient, c«ng ty Dow Chemical, Sumitomo Chemical s¶n xuÊt ra pullulan d¹ng bét dïng cho c«ng nghiÖp giÊy, ph©n bãn, vµ phô gia thùc phÈm ë n−íc ta, pullulan hÇu nh− ch−a ®−îc chó ý ®Õn. §Ó cã thÓ øng dông ®−îc pullulan, chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu ®Ò tµi “Nghiªn cøu øng dông pullulan trong s¶n xuÊt b¸nh kÑo vµ b¶o qu¶n thÞt” nh»m b−íc ®Çu t¹o ra c¸c s¶n phÈm cã chÊt l−îng cao gãp phÇn ®¶m b¶o ®−îc vÖ sinh an toµn thùc phÈm, t¹o tiÒn ®Ò cho nghiªn cøu s¶n xuÊt pullulan ë n−íc ta. Môc tiªu cña ®Ò tµi øng dông pullulan trong chÕ biÕn vµ b¶o qu¶n thùc phÈm 1. Néi dung nghiªn cøu 1.
Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn c«ng nghÖ øng dông pullulan trong s¶n xuÊt b¸nh kÑo 1. Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn c«ng nghÖ sö dông pullulan trong b¶o qu¶n thÞt 1. øng dông s¶n xuÊt s¶n phÈm kÑo quy m« thö nghiÖm 4 1. Tæng quan tµi liÖu 1.
Giíi thiÖu vÒ pullulan Pullulan ®−îc sinh tæng hîp tõ chñng Aureobasidium pullulans, ®−îc h×nh thµnh khi tÕ bµo ®ang trong tr¹ng th¸i pha log muén (Catley,1971) vµ sù h×nh thµnh phô thuéc ®èi víi nhiÒu nh©n tè bao gåm pH, nhiÖt ®é, c¬ chÊt vµ chñng gièng (Catley,1971; Yuen, 1974; Madi et al, 1997; Gibb,1996). HiÖu suÊt vµ khèi l−îng ph©n tö phô thuéc nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn lªn men. Bender ng−êi ®Çu tiªn miªu t¶ sù h×nh thµnh polysacarit ngo¹i bµo tõ chñng Aureobasidium pullulan ( Bender etal. N¨m 1938 nhµ khoa häc Bayer ®· quan s¸t sù h×nh thµnh polymer ngo¹i bµo tõ chñng Aureobasidium pullulan vµ m·i ®Õn n¨m 1958 t¸c gi¶ Bayer míi ph©n lËp ®−îc vµ b¾t ®Çu nghiªn cøu c¸c ®Æc tÝnh cña polysacarit nµy.
N¨m 1959 polysacarit ngo¹i bµo tõ chñng Aureobasidium pullulan ®−îc ®Æt tªn lµ pullulan. Trong suèt nh÷ng n¨m 1961 pullulan ®−îc nghiªn cøu vµ xem xÐt cÊu tróc ph©n tö. Sau khi ph¸t hiÖn mét enzim pullulanase cã thÓ thuû ph©n liªn kÕt alpha 1,6 glucozit ®Ó chuyÓn pullulan thµnh maltotrioza th× cÊu tróc pullulan cµng ®−îc lµm s¸ng tá [4,5,6,9] HiÖn nay theo hÖ thèng sè quèc tÕ (INS), m· sè pullulan lµ E 1204. Trong s¶n phÈm th−¬ng m¹i PI 20 mét s¶n phÈm pullulan ®· deion tån t¹i 1250 ®¬n vÞ glucoza.
Trªn thÕ giíi, Công ty Hayshibara Co.ltd, NhËt b¶n sản xuất pullulan trên quy mô công nghiệp từ năm 1972 với sản lượng 1000 tấn/ năm vµ C«ng ty Shanghai Puao BioTech Co.Ltd -Trung quèc ®ang s¶n xuÊt pullulan trªn quy m« c«ng nghiÖp [17] 1. CÊu t¹o vµ cÊu tróc cña pullulan Pullulan là một polysaccharit được tạo bởi chủ yếu các đơn vị maltotrioza và một phần nhỏ các đơn vị maltotetraoza theo liên kết α- 1,6 glucozit. Các đơn vị này được cấu tạo từ các glucoza theo liên kết α- 1,4 glucozit. Pullulan cã c«ng thøc ho¸ häc (C6H10O5)n.
Pullulan được sản xuất từ tinh bột thông qua quá trình lên men tõ chủng Aureobasidium pullulans. Cấu trúc của pullulan [5] Polysacarit ngo¹i bµo của chủng Aureobasidium pullulans có hai d¹ng sản phẩm: polysaccarit dị hình và glucan trung hoà. Glucan trung hoà được gọi là pullulan , chứa hai liên kết α- 1,4 và α- 1,6 glucozit. Pullulan được xác định dựa trên cơ sở sự quay cực, thuỷ phân axit fomic, phổ hồng ngoại, phương pháp phân tích methyl hoá.
Người ta đã đưa ra tỉ lệ liên kết α- 1,4 : α- 1,6 glucozit trong ph©n tö pullulan là 3:2 dựa trên phương pháp methyhoá và oxyhoá. Cấu trúc của pullulan được mô tả như là một chuỗi mạch thẳng bao gồm các đơn vị maltotrioza liên kết với nhau theo liên kết α - 1,6 glucozit và đơn vị này lại được tạo thành từ ba đơn vị glucoza liên kết với nhau theo liên kết α - 1,4 glucozit [5, 6,12] Khảo sát pullulan từ một chủng khác của Aureobasidium pullulans, Bouveng và các cộng sự [10] cũng đưa ra kết quả tương tự với tỉ lệ liên kết α - 1,4: α - 1,6 glucozit là 2:1, đây cũng là giá trị lí thuyết về chuỗi polymaltotrioza. Sự thay đổi liên kết α - 1,4 và α - 1,6 glucozit cho pullulan từ các chủng khác nhau đã được công bố rộng rãi. Cấu trúc đơn giản của pullulan [5] Bằng ph−¬ng ph¸p thuỷ phân hoàn toàn của enzim pullulanaza – enzim đặc hiệu tác động lên liên kết α - 1,6 glucozit cho thÊy cấu trúc polymaltotrioza trên (hình 1.2) cã chót thay đổi sau khi tìm thấy maltotetraoza, những đơn vị tetrasaccharit này xuất hiện ë cuối phân tử pullulan.
Sau này người ta xác định được những đơn vị này là maltotetraoza và nó không chỉ xuất hiện ở cuối chuỗi mà nó được phân bố một cách ngẫu nhiên trên phân tử polymaltotrioza. Tỉ lệ này có thể lên tới 7%.[10,9,15] Cấu trúc pullulan đã được chỉ ra ở hình 1.1 cho ®Õn nay vÉn được chấp nhận một cách rộng rãi. Tuy nhiªn trong cấu trúc ph©n tö cña pullulan vẫn có nhiều sự thay đổi, ®ó là khả năng phân nhánh (nh−ng không đáng kể). Bouveng và các cộng sự [10] cho r»ng kh«ng loại khả năng có liên kết α - 1,3 glucozit trong phân tử (1%- 2%).
Bởi vì, ông đã tìm thấy glucoza không bị oxyhoá còn lại sau sự ôxyhoá tuần hoàn. T¸c gi¶ Elinov và Mateeva [15] cũng cho thấy có liên kết α - 1,3 glucozit nhưng ở mức cao hơn 7%. Do vậy đã có nhiều ý kiến khác nhau về cấu trúc mạch thẳng trong đó có liên kết α - 1,3 glucozit với α - 1,4 glucozit với độ dài khác nhau đã ảnh hưởng trực tiếp lên liên kết α - 1,6 glucozit. Bằng cách kết tủa với cetyl trimetylamoni hydroxit, Bouveng và các cộng sự [10,15] đã tách được cả β-glucan và các axit polysaccharit dị hình chứa glucoza, manoza, galactoza và axit uronic có trong pullulan.
Bằng phương pháp 7 metyl hoá, oxihoá hoàn toàn, thuỷ phân axit và enzim, người ta tìm thấy trong β -glucan có chứa liên kết β - 1,3 glucozit liên kết với liên kết β - 1,6 glucozit. Một β-glucan chứa 68% liên kết 1,3 glucozit và 32% liên kết 1,6 glucozit và axit malic cũng được tách ra sau khi kết tủa phân đoạn với cetyl trimethylamoni bromua[15] 1. Khèi luîng ph©n tö cña pullulan Khèi l−îng ph©n tõ pullulan phô thuéc vµo ®iÒu kiÖn nu«i cÊy (thêi gian, pH, phosphat, .), tuy nhiªn nã kho¶ng 10- 3000 kDa (Sugimoto, 1978; Wiley et al. Đã có nhiều nghiên cứu về phân tử lượng của pullulan và cho thấy có sự biến thiên đáng kể.
Sự phân cắt bởi enzim amylaza vµ sự phân cắt của enzim pullulanase lên pullulan phân tử lượng thấp đã tạo ra các tetrasaccharit phân nhánh thay vì các đơn vị maltotetraoza.Và các đơn vị maltotetraoza trong pullulan cũng bị phân cắt bởi enzim α- amylaza ở tuyến nước bọt. T¸c gi¶ Yeun [17] cho rằng có thể điều chỉnh được phân tử lượng bằng cách lựa chọn chủng và thay đổi các điều kiện nuôi cấy. T¸c gi¶ Sugimoto [12] thì lại cho rằng pH và nồng độ photphat là hai yếu tố quan trọng quyÕt định phân tử lượng của pullulan. Phân tử lượng giảm khi tăng pH và t¨ng nồng độ photphat trong canh trường.
Pullulan cã khèi l−îng ph©n tö 500,000- 600,000 dalton khi ®−îc s¶n xuÊt ë pH ban ®Çu lµ 3, trong khi pullulan cã khèi l−îng ph©n tö 200,000- 300,000 dalton khi pH ban ®Çu lµ 4,5. §Ó cã pullulan ph©n tö luîng cao cÇn ®iÒu chØnh pH canh tr−êng từ 3,0 – 6,0 sau hai ngày nu«i cÊy và tăng nồng độ nguồn cácbon. Phân tử lượng cña pullulan cũng tăng khi tỉ lệ tế bào tăng, tăng tốc độ khuấy. Ngoµi ra pullulan cã khèi l−îng ph©n tö trªn 1000000 danton nÕu sö dông glucoza kÕt hîp víi glucozamin trong m«i tr−êng nu«i cÊy.
