Ứng Dụng Công Nghệ Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vật Để Nhân Giống Cây Chuối Tiêu Tiên Phước

Khám phá ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây chuối tiêu Tiên Phước, nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

• Tác giả: Đặng Hữu Trí
• Người hướng dẫn: Th.S: Hồ Thị Kim Cúc
• Trường học: Trường Đại Học Quảng Nam
• Chuyên ngành: Sinh - Kỹ Thuật Nông Nghiệp
• Đề tài: Ứng Dụng Công Nghệ Nuôi Cấy Mô Tế Bào Thực Vật Để Nhân Giống Cây Chuối Tiêu Tiên Phước
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Quảng Nam

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.2. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng
• 1.2.1. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới
• 1.2.2. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam
• 1.2.3. Sơ lược phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Quảng Nam
• 1.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro
• 1.4. Môi trường nuôi cấy
• 1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.6. Giới thiệu chung về cây chuối
• 1.6.1. Nguồn gốc và phân bố
• 1.6.2. Đặc điểm hình thái
• 1.6.3. Đặc điểm sinh thái
• 1.6.4. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống cây chuối bằng phương pháp nuôi cây mô
• 1.6.4.1. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới
• 1.6.4.2. Tình hình nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nguyên liệu khởi đầu
• 2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
• 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Qui trình nuôi cấy mô chuối tiêu
• 2.5.1. Các bước thực hiện qui trình nghiên cứu
• 2.5.1.1. Cách chọn mẫu cấy
• 2.5.1.2. Khử trùng mẫu
• 2.5.1.3. Chọn môi trường
• 2.5.1.4. Hấp môi trường
• 2.5.1.5. Đưa mẫu vào môi trường khởi động
• 2.5.1.6. Tạo mô sẹo
• 2.5.1.7. Tái sinh chồi từ mô sẹo
• 2.5.1.8. Nhân nhanh chồi
• 2.5.1.9. Tạo rễ cây
• 2.5.1.10. Chuyển ra vườn ươm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nước javen đến khử trùng mẫu cấy
• 3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy cây chuối tiêu
• 3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của chuối tiêu
• 3.4. Kết quả nuôi cấy mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng
• 3.5. Kết quả nuôi cấy mô sẹo gián tiếp từ mẫu chuối đã được nuôi cấy khởi động
• 3.6. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng bật chồi của chuối tiêu
• PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• PHẦN 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Ứng Dụng Nuôi Cấy Mô Chuối Tiêu Tiên Phước

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày càng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong việc nhân giống các giống cây quý hiếm, có giá trị kinh tế cao hoặc đang có nguy cơ tuyệt chủng. Mục tiêu chính là sản xuất ra các giống cây sạch bệnh, đồng nhất, mang lại hiệu quả kinh tế vượt trội trong sản xuất nông nghiệp. Nuôi cấy mô không chỉ giới hạn ở việc nhân giống mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc phục hồi các giống cây bị nhiễm virus, vi khuẩn. Kỹ thuật này còn cho phép bảo quản nguồn gen trong ống nghiệm, từ đó nhân nhanh các giống cây có giá trị kinh tế trong thời gian ngắn. Ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến này đang trở thành xu hướng tất yếu trong phát triển nông nghiệp hiện đại, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về giống cây trồng chất lượng.

1.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào có lịch sử phát triển lâu dài, bắt đầu từ cuối thế kỷ 19 với những nghiên cứu của Haberlandt về tính toàn năng của tế bào. Những năm sau đó, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt, mở ra một kỷ nguyên mới cho công nghệ sinh học. Kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn cũng được phát triển, và đến những năm 1960, tính toàn năng của tế bào được khẳng định khi tế bào cà rốt có thể tạo thành phôi trong môi trường thạch. Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được ứng dụng rộng rãi để nhân giống các cây trồng có giá trị, đánh dấu sự phát triển vượt bậc của công nghệ này. Kỹ thuật vi nhân giống đã trở thành một công nghệ quan trọng trong nền nông nghiệp thế giới.

1.2. Vai trò của nuôi cấy mô trong bảo tồn và phát triển giống

Một trong những ứng dụng quan trọng của nuôi cấy mô là khả năng bảo tồn các giống cây quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng. Kỹ thuật này cho phép duy trì nguồn gen trong điều kiện in vitro, bảo vệ chúng khỏi các tác động tiêu cực từ môi trường bên ngoài. Đồng thời, vi nhân giống giúp nhân nhanh số lượng cây con giống từ một cây mẹ duy nhất, đảm bảo nguồn cung ổn định và chất lượng cao. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các giống cây bản địa, có giá trị văn hóa và kinh tế đối với cộng đồng địa phương. Công nghệ sinh học này chính là chìa khóa để bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển nông nghiệp bền vững.

II. Thách Thức Trong Nhân Giống Chuối Tiêu Tiên Phước Truyền Thống

Giống chuối tiêu Tiên Phước là giống bản địa lâu đời, được người dân địa phương trồng trọt qua nhiều thế hệ. Tuy nhiên, do không được phục tráng, trồng không thâm canh, giống chuối này ngày càng thoái hóa, năng suất và chất lượng giảm sút đáng kể. Mặc dù vẫn được ưa chuộng tại thị trường địa phương, nhưng số lượng chuối tiêu Tiên Phước bán ra không nhiều, do nguồn cung hạn chế. Việc duy trì và phát triển giống chuối này gặp nhiều khó khăn do phương pháp nhân giống truyền thống không đảm bảo chất lượng và khả năng chống chịu bệnh tật. Thoái hóa giống, năng suất thấp và sâu bệnh hại là những thách thức lớn đối với người trồng chuối tiêu Tiên Phước.

2.1. Thực trạng thoái hóa giống chuối tiêu Tiên Phước

Qua nhiều năm canh tác, giống chuối tiêu Tiên Phước đang đối mặt với tình trạng thoái hóa nghiêm trọng. Việc nhân giống bằng phương pháp truyền thống, sử dụng chồi bên, không đảm bảo tính đồng nhất và sạch bệnh cho cây con. Hậu quả là năng suất giảm, chất lượng trái kém, cây dễ bị nhiễm bệnh. Điều này khiến người dân dần mất hứng thú với việc trồng chuối tiêu Tiên Phước, đe dọa sự tồn tại của giống cây quý này. Theo khóa luận tốt nghiệp, chuối tiêu Tiên Phước không được phục tráng, trồng không thâm canh nên năng suất, chất lượng giảm đáng kể và ngày càng bị thoái hóa nghiêm trọng.

2.2. Nhu cầu cấp thiết về giống chuối tiêu sạch bệnh chất lượng cao

Trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu về giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng cao ngày càng tăng cao. Người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến nguồn gốc và chất lượng sản phẩm, đặc biệt là các loại trái cây đặc sản địa phương như chuối tiêu Tiên Phước. Do đó, việc cung cấp giống chuối tiêu sạch bệnh, có năng suất và chất lượng ổn định là yêu cầu cấp thiết để đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo tồn giống cây quý này. Ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất giống là giải pháp tối ưu để giải quyết vấn đề này.

III. Phương Pháp Nuôi Cấy Mô Tế Bào Nhân Giống Chuối Tiêu Hiệu Quả

Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp hiệu quả để nhân giống chuối tiêu Tiên Phước, giúp tạo ra cây con sạch bệnh, đồng nhất và có năng suất cao. Quy trình bao gồm nhiều giai đoạn, từ chọn lọc cây mẹ, khử trùng mẫu, tạo mô sẹo, tái sinh chồi, nhân nhanh chồi đến tạo rễ và chuyển ra vườn ươm. Mỗi giai đoạn đều đòi hỏi điều kiện môi trường và dinh dưỡng tối ưu để đảm bảo thành công. Đặc biệt, việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng như BA (6-benzyladenine) và IBA (3-indolebutyric acid) đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích tạo chồi và rễ.

3.1. Quy trình nuôi cấy mô chuối tiêu chi tiết

Quy trình nuôi cấy mô chuối tiêu bắt đầu bằng việc chọn lọc cây mẹ khỏe mạnh, không mang mầm bệnh. Mẫu cấy, thường là chồi non hoặc đỉnh sinh trưởng, được khử trùng cẩn thận để loại bỏ vi sinh vật gây hại. Sau đó, mẫu được đưa vào môi trường nuôi cấy chứa đầy đủ dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng để kích thích tạo mô sẹo. Từ mô sẹo, chồi được tái sinh và nhân nhanh, trước khi được chuyển sang môi trường tạo rễ. Cuối cùng, cây con có rễ khỏe mạnh được chuyển ra vườn ươm để thích nghi với điều kiện tự nhiên. Các bước thực hiện qui trình nghiên cứu bao gồm: Cách chọn mẫu cấy, Khử trùng mẫu, Chọn môi trường, Hấp môi trường, Đưa mẫu vào môi trường khởi động, Tạo mô sẹo, Tái sinh chồi từ mô sẹo, Nhân nhanh chồi, Tạo rễ cây và Chuyển ra vườn ươm.

3.2. Tối ưu hóa môi trường và chất điều hòa sinh trưởng

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò then chốt trong sự thành công của nuôi cấy mô. Môi trường phải cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng. Việc điều chỉnh nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng như BA và IBA có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo chồi và rễ của cây. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tìm ra công thức môi trường tối ưu cho từng giai đoạn phát triển của cây chuối tiêu, đảm bảo hiệu quả nhân giống cao nhất.Khảo sát ảnh huỏng của nước javen đến khử trùng mẫu cấy. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy cây chuối tiêu . Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo của chuối tiêu.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của BA Và IBA Lên Chuối Tiêu

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi và IBA đến khả năng bật chồi của chuối tiêu. Kết quả cho thấy, nồng độ BA và IBA tối ưu có thể kích thích sự phát triển của chồi và rễ, tạo ra cây con khỏe mạnh. Tuy nhiên, nồng độ quá cao hoặc quá thấp có thể gây ức chế sự phát triển. Việc tìm ra nồng độ tối ưu là yếu tố quan trọng để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô và nâng cao hiệu quả nhân giống.

4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi

Các thí nghiệm đã chứng minh rằng nồng độ BA ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy chuối tiêu. Nồng độ BA phù hợp sẽ kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi mới. Tuy nhiên, nồng độ quá cao có thể gây ra tình trạng chồi phát triển không bình thường hoặc ức chế sự phát triển của rễ. Cần xác định nồng độ BA tối ưu để đạt được số lượng chồi cao nhất với chất lượng tốt nhất. Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy cây chuối tiêu và Biểu đồ 3.2 2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của mẫu cấy cây chuối tiêu là những chứng minh cụ thể.

4.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng bật chồi

IBA là chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong việc kích thích ra rễ. Nghiên cứu cho thấy, nồng độ IBA phù hợp sẽ thúc đẩy sự hình thành và phát triển của rễ, giúp cây con có khả năng hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn khi chuyển ra vườn ươm. Tương tự như BA, nồng độ IBA quá cao cũng có thể gây ra tác dụng ngược lại, ức chế sự phát triển của chồi và rễ. Do đó, việc xác định nồng độ IBA tối ưu là rất quan trọng để đảm bảo cây con phát triển khỏe mạnh. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng bật chồi của chuối tiêu được thể hiện rõ qua Bảng 3.7 và Biểu đồ 3.4.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Nuôi Cấy Mô Chuối Tiêu Tiên Phước

Ứng dụng thành công nuôi cấy mô vào nhân giống chuối tiêu Tiên Phước mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho người nông dân và cộng đồng địa phương. Thứ nhất, đảm bảo nguồn cung giống sạch bệnh, chất lượng cao, giúp nâng cao năng suất và chất lượng trái. Thứ hai, góp phần bảo tồn và phát triển giống chuối tiêu Tiên Phước, một đặc sản địa phương có giá trị kinh tế và văn hóa. Thứ ba, tạo ra cơ hội phát triển kinh tế bền vững cho người nông dân, nâng cao thu nhập và cải thiện đời sống. Mô hình nuôi cấy mô chuối tiêu Tiên Phước có thể được nhân rộng ra các vùng khác, góp phần phát triển ngành trồng chuối nói riêng và nông nghiệp nói chung.

5.1. Cung cấp giống sạch bệnh cho người nông dân

Một trong những ưu điểm lớn nhất của nuôi cấy mô là khả năng tạo ra cây con sạch bệnh. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các giống cây dễ bị nhiễm bệnh như chuối tiêu. Việc sử dụng giống sạch bệnh giúp giảm thiểu rủi ro mất mùa, giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật và nâng cao năng suất cây trồng. Công nghệ sinh học này mang lại lợi ích kinh tế lớn cho người nông dân, giúp họ yên tâm sản xuất và nâng cao thu nhập.

5.2. Bảo tồn và phát triển đặc sản địa phương

Chuối tiêu Tiên Phước là một đặc sản địa phương có giá trị kinh tế và văn hóa. Việc ứng dụng nuôi cấy mô vào nhân giống giúp bảo tồn và phát triển giống chuối này, tránh nguy cơ bị thoái hóa hoặc mất giống. Đồng thời, việc cung cấp giống chất lượng cao giúp nâng cao giá trị sản phẩm, tạo ra lợi thế cạnh tranh trên thị trường và góp phần quảng bá thương hiệu chuối tiêu Tiên Phước.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nuôi Cấy Mô Chuối Tiêu

Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô vào nhân giống chuối tiêu Tiên Phước là một giải pháp hiệu quả để giải quyết các vấn đề về giống và nâng cao hiệu quả sản xuất. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc tối ưu hóa môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng có thể cải thiện đáng kể khả năng tạo chồi và rễ của cây. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô, giảm chi phí sản xuất và mở rộng quy mô ứng dụng, góp phần phát triển ngành trồng chuối bền vững.Ngoài ra cần nghiên cứu chuyên sâu về những yếu tố có thể ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chuối.

6.1. Tổng kết các kết quả nghiên cứu chính

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng quy trình nuôi cấy mô cho chuối tiêu Tiên Phước, xác định được nồng độ BA và IBA tối ưu cho từng giai đoạn phát triển của cây. Kết quả cho thấy, việc ứng dụng công nghệ sinh học này có thể tạo ra cây con sạch bệnh, đồng nhất và có khả năng sinh trưởng tốt. Đây là cơ sở quan trọng để nhân rộng mô hình nuôi cấy mô và cung cấp giống chất lượng cao cho người nông dân.

6.2. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo

Để nâng cao hiệu quả và tính bền vững của mô hình nuôi cấy mô chuối tiêu Tiên Phước, cần tiếp tục nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và dinh dưỡng. Đồng thời, cần tìm kiếm các nguồn dinh dưỡng thay thế, rẻ tiền hơn để giảm chi phí sản xuất. Nghiên cứu về khả năng kháng bệnh của cây con cũng là một hướng đi quan trọng, giúp giảm thiểu rủi ro và nâng cao năng suất cây trồng.Việc sử dụng thêm nhiều loại chất kích thích sinh trưởng khác nhau cũng nên được quan tâm và nghiên cứu để tìm ra công thức tối ưu nhất.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một nhánh quan trọng của công nghệ sinh học, đóng vai trò then chốt trong việc nhân giống sạch bệnh, phục tráng giống thoái hóa và bảo tồn nguồn gen thực vật có giá trị kinh tế cao. Nhờ khả năng duy trì tính ổn định di truyền và tạo ra số lượng lớn cây con đồng nhất trong thời gian ngắn, vi nhân giống in vitro đã trở thành phương thức sản xuất giống tiên tiến trong nông nghiệp hiện đại.

Cây chuối (Musa spp.) thuộc chi Musa, họ Musaceae, là loại cây ăn quả nhiệt đới quen thuộc và có giá trị thương mại lớn. Tại huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam, giống chuối tiêu Tiên Phước là nguồn giống bản địa lâu đời, nổi tiếng với chất lượng thơm ngon và thịt quả chắc. Tuy nhiên, qua nhiều thế hệ canh tác tự phát, giống chuối này không được phục tráng và chăm sóc theo quy trình thâm canh, dẫn đến tình trạng thoái hóa giống nghiêm trọng, năng suất suy giảm rõ rệt. Việc nhân giống truyền thống bằng chồi nách làm tăng nguy cơ tích lũy mầm bệnh qua đất (như tuyến trùng và nấm bệnh), khiến diện tích trồng bị thu hẹp dù nhu cầu thị trường tiêu thụ vẫn rất cao và giá bán ổn định.

Nhằm bảo tồn nguồn giống bản địa và cung ứng cây giống sạch bệnh phục vụ sản xuất nông nghiệp tại địa phương, đề tài khóa luận xác định các nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu cụ thể như sau:

1. Nghiên cứu tỉ lệ chất khử trùng để vô mẫu cây chuối tiêu.
2. Xác định môi trường thích hợp để tạo mô sẹo.
3. Nghiên cứu tạo chồi từ mô sẹo của cây chuối tiêu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của khóa luận được giới hạn như sau:

• Đối tượng nghiên cứu: Củ chuối tiêu (Musa spp.) thu hoạch từ cây con 6 tháng tuổi hoặc chồi non sinh ra từ gốc cây mẹ 2 đến 3 tháng tuổi tại huyện Tiên Phước, tỉnh Quảng Nam; bộ phận lấy mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng có kích thước 1 đến 2 cm², chiều cao từ 0,5 đến 1,5 cm chứa các chồi bên.
• Không gian nghiên cứu: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc Trung tâm Ứng dụng và Thông tin Khoa học - Công nghệ tỉnh Quảng Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 3 năm 2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về mặt lý luận học thuật, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vận hành dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật được nhà khoa học Gottlieb Haberlandt đề xuất năm 1902. Theo nguyên lý này, mỗi tế bào thực vật chuyên hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể và có tiềm năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được cung cấp điều kiện ngoại cảnh và nguồn dinh dưỡng thích hợp trong môi trường vô trùng. Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro được định hướng chủ yếu bởi tương quan nồng độ giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng cơ bản: auxin và cytokinin (được chứng minh bởi Folke Skoog và Carlos O. Miller năm 1957). Khi tỷ lệ auxin/cytokinin lớn hơn 1, quá trình cảm ứng kích thích phân hóa mô sẹo (callus) hoặc rễ; khi tỷ lệ auxin/cytokinin nhỏ hơn 1, quá trình kích thích phân hóa chồi bất định và phát triển chồi nách; khi hai nhóm chất này ở mức cân bằng, mô tế bào duy trì trạng thái tăng sinh vô định hình.

Trong khóa luận, tác giả sử dụng hệ thống môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản Murashige và Skoog (MS, 1962) ở nồng độ giảm một nửa (1/2 MS), kết hợp với các chất bổ sung hữu cơ và các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật chuyên biệt:

• Cytokinin: 6-benzyladenin (BA) và Kinetin, có vai trò kích thích sự phân chia tế bào, phá vỡ trạng thái ngủ của chồi nách và cảm ứng tạo chồi bất định.
• Auxin: Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D), là một auxin tổng hợp mạnh có tác dụng chuyên biệt kích hoạt chu kỳ tế bào nhằm tạo mô sẹo; Axit Indol-3-Butyric (IBA) và Axit $\alpha$-Napthaleneacetic (NAA), giữ vai trò kích thích sự hình thành rễ bất định và phát triển hệ rễ hoàn chỉnh.
• Chất hữu cơ và phụ gia môi trường: Nước dừa tự nhiên (CW) tỷ lệ 8-10% (tương đương 100 ml/l) bổ sung nguồn cytokinin nội sinh tự nhiên, vitamin và axit amin; đường saccharose (15-30 g/l) cung cấp nguồn cacbon; than hoạt tính (0,5 g/l) có tác dụng hấp phụ các hợp chất phenol độc hại sinh ra do quá trình hóa nâu của mô chuối; agar (7 g/l) làm chất tạo đông thể nền; độ pH môi trường được chỉnh về 5,6 - 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 30 phút.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo quy trình nuôi cấy in vitro nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm vô trùng:

• Phương pháp thu thập tài liệu: Tổng quan các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về vi nhân giống chuối.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm thực nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm khử trùng mẫu bằng dung dịch nước Javen thương phẩm ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau; thí nghiệm cảm ứng tạo chồi khởi động bằng BA; thí nghiệm tạo mô sẹo bằng tổ hợp 2,4-D và Kinetin; thí nghiệm so sánh tạo mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng tự nhiên và gián tiếp từ mẫu vô trùng; thí nghiệm kích thích bật chồi và tạo rễ bằng IBA.
• Phương pháp thống kê xử lý số liệu: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với dung lượng 100 mẫu cho mỗi công thức thí nghiệm chính; các chỉ tiêu theo dõi gồm tỷ lệ mẫu nhiễm (%), tỷ lệ mẫu sống (%), tỷ lệ tạo mô sẹo (%), tỷ lệ bật chồi (%), chất lượng mô sẹo và chồi. Dữ liệu được tính toán và xử lý thống kê trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Excel 9.0.

Hợp phần môi trường	Nồng độ / Dạng hóa chất sử dụng	Vai trò sinh học
Môi trường khoáng cơ bản	1/2 MS (Murashige & Skoog, 1962)	Cung cấp các nguyên tố đa lượng và vi lượng
Nguồn cacbon	Đường Saccharose 30 g/l	Cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất
Chất tạo gel	Agar-agar 7 g/l	Cố định mẫu cấy trên bề mặt dinh dưỡng
Nước dừa (CW)	100 ml/l (khoảng 10%)	Bổ sung phytohormone, vitamin, khoáng hữu cơ
Than hoạt tính	0,5 g/l	Hấp phụ độc tố và hợp chất phenol chống hóa nâu
Chất điều hòa sinh trưởng	BA, Kinetin, 2,4-D, IBA	Định hướng phân hóa hình thái (chồi, mô sẹo, rễ)

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa toàn diện các vấn đề lý luận và thực tiễn liên quan đến công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và cây chuối:

• Lịch sử vi nhân giống: Khái quát các mốc phát triển của nuôi cấy mô trên thế giới (từ Haberlandt năm 1902, White năm 1934 nuôi cấy rễ cà chua, Overbeck năm 1941 và Steward năm 1948 ứng dụng nước dừa, Morel năm 1960 nhân giống lan và làm sạch virus thược dược bằng đỉnh sinh trưởng). Phân tích quá trình phát triển nuôi cấy mô tại Việt Nam từ năm 1975, nhấn mạnh sự hình thành các trung tâm nuôi cấy mô tại Đà Lạt, Hà Nội, Lạng Sơn, Phú Yên, Bình Định và các đề tài vi nhân giống hoa, cây ăn quả tại Quảng Nam.
• Đặc điểm sinh học cây chuối: Mô tả nguồn gốc phân loại thực vật học (Musa spp., họ Musaceae), phân loại thương mại và phân loại theo hệ gen (nhóm AA, AAA, AAB, ABB, BB theo Simmonds, Shepherd, Vakili). Mô tả giải phẫu hình thái gồm củ chuối (thân ngầm thực sự), thân giả tạo thành từ các bẹ lá ép chặt, rễ chùm mềm ăn nông, hoa chuối lưỡng tính và quả không hạt hình thành đơn tính. Về sinh thái học, chuối sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 24-25°C, cần độ ẩm cao và đất tơi xốp không sỏi đá.
• Tình hình nghiên cứu nhân giống chuối in vitro: Trích dẫn các công trình quốc tế về quy trình 4 giai đoạn của Viện Nghiên cứu Chuối Quốc tế (Đài Loan), kỹ thuật nuôi cấy phun mù của Weathers và cs. (1988), công thức giá thể vườn ươm của Kawit-Wanichkul (1993) và Đại học Quảng Tây (1991). Tổng hợp các công trình tại Việt Nam: quy trình 6 công đoạn của Nguyễn Văn Uyển (1985), quy trình 5 công đoạn của Đoàn Thị Ái Thuyền (1993), nghiên cứu nồng độ BAP (7-9 mg/l) của Đỗ Năng Vịnh (1994), phương pháp bóc bẹ không khử trùng của Nguyễn Quang Thạch và cs. (1995), công thức giá thể của Phạm Kim Thu và Đặng Thị Vân (1997).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các trang thiết bị, nguyên vật liệu thực vật, công thức hóa chất và quy trình thao tác kỹ thuật:

• Chuẩn bị mẫu thực vật: Củ chuối tiêu thu thập tại Tiên Phước được rửa sạch đất dưới vòi nước, cắt bỏ rễ, ngâm rửa trong xà phòng loãng 10% khoảng 15 phút, dùng bàn chải chà sạch và xả nước 10 phút. Mẫu được lau cồn 70° nhiều lần và rửa nước cất vô trùng trước khi đưa vào tủ cấy.
• Quy trình khử trùng và cắt mẫu trong tủ cấy vô trùng: Mẫu tiếp tục được xử lý cồn, bóc dần các bẹ lá cho tới khi lộ chồi đỉnh sinh trưởng kích thước khoảng 1,5 cm² rồi đưa vào xử lý bằng dung dịch khử trùng.
• Thiết kế các công thức thí nghiệm:
  • Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ thể tích Nước : Javen gồm CT1 (1:2), CT2 (1:1), CT3 (2:1).
  • Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ BA gồm 5 công thức: CT1 (1,0 ml/l), CT2 (2,0 ml/l), CT3 (3,0 ml/l), CT4 (4,0 ml/l), CT5 (5,0 ml/l) trên môi trường khởi động MT1.
  • Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng phối hợp giữa 2,4-D và Kinetin đến cảm ứng mô sẹo trên môi trường MT2, ủ tối 10 ngày sau đó chuyển ra sáng 10 ngày.
  • Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả nuôi cấy mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và gián tiếp từ mẫu vô trùng khởi động.
  • Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ IBA (từ 1,5 đến 3,5 ml/l) đến khả năng bật chồi và tạo rễ hoàn chỉnh (MT3).
• Hệ thống chỉ tiêu và thang đánh giá: Thiết lập công thức toán học tính tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ bật chồi, hệ số chồi và phân hạng chất lượng mô sẹo (*, **, ***) cùng chất lượng chồi (+, ++, +++).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày và biện luận các dữ liệu số liệu thu thập được qua từng đợt thực nghiệm:

• Hiệu quả khử trùng mẫu cấy bằng Javen: Sau 2 tuần theo dõi, nồng độ Javen ảnh hưởng quyết định đến tỷ lệ sống và sự biến màu của mẫu. Công thức CT2 (Nước : Javen = 1:1) cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ sống sạch bệnh đạt 90%, tỷ lệ nhiễm và chết chỉ chiếm 10%, mẫu giữ được màu sáng trắng và có xu hướng bật chồi nhanh. Ngược lại, CT1 (tỷ lệ 1:2) có nồng độ chất tẩy quá cao làm mô bị cháy, thâm đen với 50% mẫu chết; CT3 (tỷ lệ 2:1) nồng độ Javen quá loãng dẫn tới tỷ lệ nhiễm lên tới 70%.
• Khả năng tạo chồi khởi động dưới tác động của BA: Môi trường 1/2 MS bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau tạo ra sự phân hóa rõ rệt. Nồng độ BA 3,0 ml/l (CT3) là tối ưu nhất với tỷ lệ tạo chồi đạt 92%, tỷ lệ mẫu chết hoặc không tạo chồi chỉ 8%, thời gian bật chồi ngắn nhất (10-15 ngày), chồi sinh trưởng mập khỏe và xanh tốt. Khi nồng độ BA thấp (1,0 - 2,0 ml/l), tỷ lệ nảy chồi chỉ đạt 20-25%, chồi phát triển yếu. Khi tăng nồng độ BA lên 4,0 - 5,0 ml/l, tỷ lệ tạo chồi giảm xuống 70% và 50%, thời gian tạo chồi kéo dài và chồi có dấu hiệu suy thoái.
• Khả năng cảm ứng tạo mô sẹo bởi 2,4-D và Kinetin: Công thức CT2 đạt kết quả cao nhất với tỷ lệ tạo mô sẹo 83%, thời gian hình thành nhanh nhất (10-15 ngày), mô sẹo đạt chất lượng tốt nhất (xanh non, bề mặt căng phồng, xuất hiện nhiều khối tiền phôi bất định). Ở công thức CT1, tỷ lệ hình thành mô sẹo chỉ đạt 28%, thời gian kéo dài đến 38 ngày và chất lượng mô sẹo kém (màu đen, khô ráp).
• So sánh nuôi cấy mô sẹo trực tiếp và gián tiếp:
  • Nuôi cấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng tự nhiên (10 bình): 1 bình nhiễm (10%), 4 bình chết không nhiễm (40%), 5 bình sống tạo mô sẹo (50%). Tỷ lệ tạo mô sẹo trên lát cắt giữa các bình biến động mạnh từ 33,13% đến 100%.
  • Nuôi cấy gián tiếp từ mẫu vô trùng đã nuôi cấy khởi động (15 bình): 3 bình nhiễm (20%), 3 bình chết (20%), 9 bình sống tạo mô sẹo/chồi (60%). Tỷ lệ tạo sẹo trên lát cắt ổn định hơn, nhiều bình đạt tỷ lệ 80% đến 100%. Mẫu nuôi cấy gián tiếp cho tốc độ tăng sinh khối mô sẹo đồng đều và sạch bệnh hơn.
• Kích thích bật chồi và tạo rễ bằng IBA: Khảo sát các dải nồng độ IBA từ 1,5 ml/l đến 3,5 ml/l cho thấy IBA kích thích tái sinh chồi từ khối mô sẹo và thúc đẩy mầm rễ bất định phát triển hoàn chỉnh sau 15-20 ngày nuôi cấy.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành việc khảo nghiệm thực nghiệm các thông số kỹ thuật then chốt trong quy trình vi nhân giống cây chuối tiêu Tiên Phước in vitro. Các kết quả định lượng cụ thể được tổng hợp tại bảng dưới đây:

Giai đoạn nuôi cấy	Công thức tối ưu	Tỷ lệ thành công (%)	Thời gian (ngày)	Đặc điểm sinh trưởng
Khử trùng mẫu cấy	Nước : Javen = 1:1 (ngâm 10-15 phút)	90% mẫu sạch, sống (10% nhiễm/chết)	14 ngày	Mẫu ít thâm, sáng trắng, khả năng tái sinh cao
Cấy khởi động tạo chồi	1/2 MS + 3,0 ml/l BA + 0,5 g/l than hoạt tính + 100 ml/l CW	92% tạo chồi (8% không tạo chồi/chết)	10 - 15 ngày	Chồi sinh trưởng mập khỏe, màu xanh tốt
Cảm ứng tạo mô sẹo	1/2 MS + 2,4-D + Kinetin (CT2) + 100 ml/l CW	83% tạo mô sẹo (17% không tạo sẹo/chết)	10 - 15 ngày	Mô sẹo xanh non, bề mặt căng phồng, chất lượng tối ưu (***)
Phương thức tạo mô sẹo	Nuôi cấy gián tiếp từ mẫu chồi vô trùng	60% bình cấy sống và tạo mô sẹo	15 - 20 ngày	Khối mô sẹo đồng nhất, giảm tỷ lệ mô chết so với nuôi cấy trực tiếp

Về mặt giải pháp và quy trình công nghệ, tác giả đề xuất hoàn thiện quy trình kỹ thuật đưa cây chuối in vitro thích nghi ngoài vườn ươm và đồng ruộng:

• Cây con đạt chiều cao 6-8 cm, có bộ rễ hoàn chỉnh và 2-4 lá được chuyển ra luống ươm (kích thước luống rộng 1 m, cao 15 cm) sử dụng giá thể tơi xốp gồm bụi dừa, mạt cưa, tro trấu và đất trộn phân hoai mục, cự ly cấy 10 x 10 cm, duy trì độ ẩm liên tục trong 30-40 ngày.
• Khi cây phát triển khỏe mạnh đạt chiều cao 30-40 cm, cây được đưa vào túi bầu đất 1 kg (đất trộn phân hoai mục tỷ lệ 5:1). Trước khi đóng bầu, rễ cây được nhúng xử lý trong dung dịch thuốc trừ nấm Zineb 1% kết hợp chất kích thích ra rễ NAA 50 mg/l trong thời gian 5 phút. Cây được thuần hóa trong bầu 30 ngày trước khi trồng chính thức ra ruộng sản xuất.

Về mặt đóng góp, đề tài là công trình thực nghiệm khoa học trực tiếp xác lập quy trình nhân giống in vitro đối với nguồn gen chuối tiêu bản địa Tiên Phước tại tỉnh Quảng Nam, chứng minh khả năng thay thế hóa chất đắt tiền bằng nước Javen gia dụng trong khâu khử trùng bề mặt, giúp tiết kiệm chi phí hóa chất mà vẫn đạt tỷ lệ sống vô trùng 90%.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận được thực hiện trong khoảng thời gian 5 tháng (từ tháng 11/2016 đến tháng 3/2017) nên tồn tại một số hạn chế nhất định dựa trên phạm vi nghiên cứu:

• Đề tài tập trung giải quyết các khâu kỹ thuật cơ bản trong phòng thí nghiệm (khử trùng mẫu, khởi động tạo chồi, cảm ứng tạo mô sẹo trực tiếp và gián tiếp, tái sinh chồi bằng chất kích thích sinh trưởng).
• Các giai đoạn ra rễ hoàn chỉnh, thuần hóa cây con ngoài vườn ươm và đánh giá sinh trưởng ngoài đồng ruộng chỉ mới được xây dựng dưới dạng quy trình kỹ thuật khuyến nghị kế thừa từ các công trình trước, chưa có số liệu thực nghiệm theo dõi chu kỳ sinh trưởng đầy đủ và năng suất buồng quả thực tế tại huyện Tiên Phước.
• Hiện tượng mẫu cấy tiết hợp chất phenolic gây thâm đen mô thực vật vẫn còn xảy ra ở các công thức khử trùng nồng độ cao và môi trường thiếu than hoạt tính.

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung:

• Thử nghiệm các tổ hợp chất chống oxy hóa (như axit ascorbic, axit citric hoặc PVP) để hạn chế triệt để hiện tượng hóa nâu mô cấy chuối tiêu trong giai đoạn khử trùng và nhân nhanh.
• Hoàn thiện nghiên cứu định lượng về tỷ lệ sống và tốc độ sinh trưởng của cây giống chuối tiêu Tiên Phước trên các loại giá thể vườn ươm khác nhau tại địa phương.
• Triển khai trồng khảo nghiệm trên diện tích thực địa ở huyện Tiên Phước nhằm đánh giá độ đồng đều, khả năng chống chịu sâu bệnh và phẩm chất quả của quần thể chuối nuôi cấy mô so với cây nhân giống truyền thống.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo học thuật và ứng dụng thực tiễn rõ ràng:

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên các ngành Sinh học, Sư phạm Sinh học - Kỹ thuật Nông nghiệp, Công nghệ sinh học; cán bộ kỹ thuật và kỹ thuật viên tại các trung tâm giống cây trồng, phòng thí nghiệm vi nhân giống thực vật cấp tỉnh và địa phương.
• Nội dung tham khảo giá trị: Cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về tỷ lệ pha chế nước Javen thương phẩm để khử trùng củ chuối thay thế các muối kim loại nặng độc hại (như HgCl₂); cung cấp nồng độ chất kích thích sinh trưởng BA (3,0 ml/l) và tổ hợp 2,4-D cùng Kinetin trên nền môi trường 1/2 MS thích ứng riêng cho nguồn gen chuối tiêu Tiên Phước.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả sử dụng nước Javen để khử trùng mẫu cấy thay vì các hóa chất chuyên dụng như Sublimat (HgCl₂)?

Nước Javen là hóa chất tẩy rửa gia dụng phổ biến, dễ tìm kiếm trên thị trường và có giá thành rẻ hơn nhiều so với các hóa chất khử trùng chuyên dụng trong phòng thí nghiệm. Việc sử dụng Javen pha loãng ở tỷ lệ Nước : Javen = 1:1 trong thời gian 10-15 phút đã được thực nghiệm chứng minh cho hiệu quả làm sạch đạt 90% mẫu sống vô trùng, đồng thời giảm thiểu độc hại cho người thực hiện và hạn chế ô nhiễm môi trường so với muối thủy ngân HgCl₂.

2. Nồng độ BA nào kích thích quá trình tạo chồi khởi động tốt nhất cho chuối tiêu Tiên Phước?

Nồng độ BA tối ưu được xác định qua thực nghiệm là 3,0 ml/l trên nền môi trường 1/2 MS. Ở nồng độ này, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt mức cao nhất là 92% (chỉ 8% mẫu chết hoặc không bật chồi), thời gian nảy chồi diễn ra nhanh nhất (10-15 ngày), chồi sinh trưởng mập khỏe, lá xanh tốt vượt trội so với các nồng độ 1,0; 2,0; 4,0 và 5,0 ml/l.

3. Phương thức tạo mô sẹo gián tiếp có ưu điểm gì so với tạo mô sẹo trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng?

Nuôi cấy mô sẹo gián tiếp từ các mẫu chuối vô trùng đã qua giai đoạn khởi động cho tỷ lệ bình cấy sống và tạo mô sẹo đạt 60% (với nhiều bình đạt tỷ lệ lát cắt thành sẹo từ 80% đến 100%), cao hơn so với tỷ lệ 50% ở phương thức nuôi cấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng tự nhiên. Phương thức gián tiếp giúp mô cấy sạch bệnh triệt để, giảm nguy cơ thâm đen hoại tử và tạo khối mô sẹo đồng đều hơn.

4. Quy trình xử lý rễ cây chuối cấy mô trước khi đưa vào bầu đất được thực hiện như thế nào?

Khi cây chuối in vitro đạt chiều cao 30-40 cm sau giai đoạn huấn luyện trên luống ươm, bộ rễ được xử lý bằng cách nhúng vào dung dịch phối hợp gồm thuốc trừ nấm Zineb 1% và chất kích thích sinh trưởng ra rễ NAA ở nồng độ 50 mg/l trong thời gian 5 phút. Thao tác này giúp phòng ngừa nấm bệnh xâm nhập qua vết thương rễ và gia tăng tỷ lệ sống khi cấy vào túi bầu đất hữu cơ.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đặng Hữu Trí đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để xây dựng các thông số kỹ thuật ban đầu cho quy trình nhân giống chuối tiêu Tiên Phước (Musa spp.). Các kết quả thực nghiệm xác lập được tỷ lệ khử trùng mẫu tối ưu bằng Javen 1:1 đạt 90% mẫu sống sạch bệnh, nồng độ BA 3,0 ml/l cho tỷ lệ tạo chồi khởi động 92%, và tổ hợp 2,4-D cùng Kinetin cảm ứng tạo mô sẹo đạt 83%. Nghiên cứu đóng góp cơ sở khoa học thiết thực cho công tác bảo tồn nguồn gen chuối bản địa quý của tỉnh Quảng Nam, mở ra triển vọng cung ứng giống chuối tiêu sạch bệnh và đồng nhất phục vụ sản xuất nông nghiệp địa phương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 1.

Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới. Cuối thế kỷ 19, nhà khoa học người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [5].

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau [3]. Năm 1941 Overbeck ở Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura).

Sau đó năm 1948 Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhận tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. 3 Trong thời gian từ 1954-1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào sống độc lập không dính với các tế bào khác, đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc.

Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo tế bào cà rốt khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định [7]. Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi. Ngày nay, bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả.Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới [6]. Vào đầu những năm 1960, Morel là người đầu tiên áp dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống Lan trong ống nghiệm.

Morel và Martin (1952) đã tạo được cây Thược dược sạch virut bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Năm 1960 Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) công bố có thể dùng men cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không có vỏ bọc, gọi là protoplast. Từ năm 1980-1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố. Nhờ có plasmid, phân tử AND vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép cấu trúc lại sao cho trong plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành công, hàng loạt công trình chuyển gen ngoại lai vào thực vật [11].

Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách của cây nho và cây khoai tây đem nuôi cấy và cấy truyền nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn không còn hạn chế ở cây 4 cảnh mà đã được thực hiện ở quy mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả, cây cảnh,…. Và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới. Hiện nay, rất nhiều loài hoa như: hoa Lan, Cúc, Đồng tiền.và các loài cây cảnh có giá trị khác cũng được nhân giống theo phương pháp nuôi cấy mô.

Hiện có khoảng 30 chi phong Lan được nhân giống phổ biến theo con đường nuôi cấy mô. Ở Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan,… việc nhân giống theo con đường này đã trở nên rất phổ biến trên các đối tượng là hoa nhằm mục đích thương mại, điển hình như: - Hà Lan là Quốc gia có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phát triển, nước này đã ứng dụng lĩnh vực này vào việc nhân và lai tạo các giống cây trồng mới đặc biệt là các loài hoa với đa dạng về chủng loại và màu sắc. - Thái Lan đã sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân, tạo các loại giống hoa Phong Lan rất thành công [11]. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam.

Việc nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam chỉ mới bắt đầu từ năm 1975. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành công nghệ sinh học trong chọn giống và nhân giống cây trồng, nhiều cơ quan làm công tác giống cây trồng bắt đầu ứng dụng công nghệ này. Trong những năm trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam cũng đã đạt được những thành tựu nhất định, có rất nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bước đầu đã nhân giống thành công một số loài hoa như: Cúc, Đồng tiền, Lan, Hồng,.

có hệ số nhân giống cao và cây con có chất lượng tốt. Năm 2008 ở nước ta công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới. Một số địa phương nhân giống hoa bằng phương pháp nuôi cấy mô để thương mại, ngoài ra còn khôi phục nhiều loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như các loài Lan rừng quý hiếm (Lan Hài hồng) tại phân viên sinh học Đà Lạt. 5 Đà Lạt là địa phương có lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào phát triển rất mạnh.

Việc lai tạo giống thông qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào được phổ biến khá rộng rãi. Tại đây các cơ sở nuôi cấy mô của nhà nước và tư nhân đều phát triển mạnh và nuôi cấy rất nhiều giống cây khác nhau, trong đó chủ yếu là các loại hoa, hầu như nông dân trồng hoa ở Lâm Đồng đều sử dụng cây con giống từ cây nuôi cấy mô và đã trồng hoa với các kỹ thuật mới nên đem lại lợi nhuận kinh tế rất cao. Tại những tỉnh thành khác của cả nước cũng đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm các giống cây bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào và bước đầu thu được một số kết quả đáng kể, cụ thể như: + Phòng nuôi cấy mô của Trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng tỉnh Phú Yên hằng năm có thể tạo ra hơn 100.000 cây chuối cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. + Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học và Công nghệ Lạng Sơn hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống bạch đàn nuôi cấy mô.

+ Trung tâm Ứng dung và chuyển giao tiến bộ khoa học công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công việc nhân giống cây Lô Hội bằng phương pháp nuôi cấy mô đây là một loại được liệu quý của địa phương. + Viện sinh học Nông nghiệp của Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong 50 cơ sở chuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật, bước đầu cơ sở này đạt được những kết quả tốt như nuôi cấy các loài Phong Lan, Dứa Cayen, khoai tây sạch bệnh, đặt biệt là các loài hoa có giá trị (Lan, Đồng tiền, Cúc,…). Hầu hết các phòng nuôi cấy mô đều có ưu thế là có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định. Hiện nay công nghệ sinh học tế bào ở Hà Nội đang có bước phát triển nhảy vọt để phục vụ cho nền Nông nghiệp.

+ Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ tỉnh Bình Định luôn đẩy mạnh việc triển khai ứng dụng các thành tựu công nghệ sinh học về nuôi cấy mô thực vật để nhân giống phục vụ công tác giống cây trồng tại địa phương. Trung tâm đã nghiên cứu và hoàn thiện được nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệp, cây 6 hoa cảnh có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, như: chuối, đu đủ; dứa, mía, bạch đàn, keo lai, … và một số loại phong lan (Dendrobium, hồ điệp, ngọc điểm), lay ơn, hoa cúc, hoa huệ, đồng tiền,… So với các nước phát triển trên thế giới, công nghệ sinh học của Việt Nam còn một khoảng cách khá xa. Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó, đang phát triển có những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn phát triển ngành Nông-Lâm nghiệp của nước nhà [7].

Sơ lược phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Quảng Nam. Chuối là cây ngắn ngày, nhiều công dụng, có khả năng thích nghi cao, ít tốn diện tích, dễ chăm sóc và có năng suất cao nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trong tỉnh.