Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống invitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)

Quy trình nhân giống Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp invitro. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào để tái sinh chồi, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh.

• Tác giả: Trần Thị Kim Quỳnh
• Người hướng dẫn: Th.S Hồ Thị Kim Cúc
• Trường học: Đại học Quảng Nam
• Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học - Kỹ thuật Nông nghiệp
• Đề tài: Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống invitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Quảng Nam

Tóm tắt

I. Tổng quan về nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro

Nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro là một trong những ứng dụng quan trọng của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong lĩnh vực dược liệu. Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) là một loài cây dự dưỡng có giá trị y học cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, khó khăn trong nhân giống tự nhiên và áp lực khai thác từ tự nhiên đã thúc đẩy nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống in vitro. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn cây con từ mẫu mẹ, đảm bảo chất lượng đồng nhất và bảo tồn nguồn gen. Quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ bao gồm nhiều bước kỹ thuật phức tạp, từ khử trùng mẫu cấy đến tái sinh chồi và phát triển rễ.

1.1. Định nghĩa và tầm quan trọng nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là kỹ thuật tái tạo thực vật từ các mô hoặc tế bào trong môi trường nhân tạo. Phương pháp này cho phép tạo ra cây con với tốc độ nhanh chóng và đạt tỷ lệ sống cao. Đối với cây Hà thủ ô đỏ, nhân giống in vitro giúp giải quyết bài toán bảo tồn loài và cung cấp nguyên liệu dược liệu ổn định cho công nghiệp.

1.2. Ứng dụng thực tiễn của công nghệ nuôi cấy mô

Công nghệ nuôi cấy mô mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong sản xuất dược liệu. Cây Hà thủ ô đỏ được nhân giống in vitro có thể được sử dụng để sản xuất hàng loạt, giảm chi phí và tăng hiệu suất. Điều này đóng góp tích cực vào phát triển bền vững của nông nghiệp công nghệ cao và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

II. Quy trình kỹ thuật nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro

Quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ được thực hiện theo các bước tiêu chuẩn, bắt đầu từ việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp cho đến khi có được cây con hoàn chỉnh. Mẫu cấy thường được lấy từ các bộ phận trẻ của cây mẹ, như chồi, lá hoặc thân. Bước đầu tiên trong quy trình nhân giống là khử trùng mẫu cấy sử dụng các hóa chất như Javen với nồng độ phù hợp. Tiếp theo là giai đoạn tái sinh chồi trực tiếp trên môi trường chứa chất điều hòa tăng trưởng, đặc biệt là BA (6-benzyl adenine). Sau đó, các chồi được chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi có sự kết hợp BA và NAA (α-naphthalen acetic acid) để tạo ra nhiều chồi từ một chồi ban đầu. Cuối cùng, các chồi được ra rễ trên môi trường chứa IBA (Indole 3-butyric acid) trước khi được chuyển sang điều kiện in vivo.

2.1. Khử trùng mẫu cấy Bước đầu tiên quan trọng

Khử trùng mẫu cấy là bước không thể thiếu để loại bỏ các vi khuẩn và nấm gây hại. Sử dụng Javen với nồng độ 10% trong 5-10 phút là phương pháp hiệu quả nhất. Mẫu cấy được khử trùng tốt sẽ tăng tỷ lệ sống sót và phát triển bình thường trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình nhân giống.

2.2. Tái sinh chồi và nhân nhanh chồi Giai đoạn nhân nhanh

Sau khử trùng, mẫu cấy được đặt trên môi trường MS (Murashige và Skoog) bổ sung BA ở nồng độ 2-3 mg/L để kích thích tái sinh chồi trực tiếp. Trong giai đoạn nhân nhanh chồi, sự kết hợp BA và NAA giúp tạo ra hàng chục chồi từ một mẫu ban đầu, tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.3. Phát triển rễ và thích ứng với điều kiện tự nhiên

Các chồi được chuyển sang môi trường chứa IBA ở nồng độ 0,5-1 mg/L để kích thích ra rễ. Sau 3-4 tuần, cây con có rễ được chuyển vào điều kiện in vivo để thích ứng trước khi trồng ngoài đồng.

III. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhân giống

Hiệu suất nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro phụ thuộc vào nhiều yếu tố kỹ thuật và môi trường. Nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng như BA, NAA và IBA đóng vai trò quyết định trong mỗi giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro. Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ (20-25°C), ánh sáng (16 giờ sáng/ngày) và độ ẩm cũng ảnh hưởng đáng kể. Thành phần môi trường cơ bản MS cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết, trong khi pH của môi trường (5,6-5,8) cần được duy trì chính xác. Thời gian nuôi cấy trên mỗi môi trường cũng là yếu tố quan trọng, thường từ 2-4 tuần tùy theo giai đoạn. Chất lượng mẫu cấy ban đầu, kỹ thuật khử trùng và điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy là những điều kiện tiên quyết để đạt được hiệu suất cao trong nhân giống.

3.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa tăng trưởng

Nồng độ BA từ 2-3 mg/L cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất. Nồng độ NAA kết hợp với BA tạo ra hiệu ứng synergy, tăng tỷ lệ nhân nhanh chồi lên 3-5 lần. Nồng độ IBA 0,5-1 mg/L là lý tưởng cho phát triển rễ của cây Hà thủ ô đỏ in vitro.

3.2. Điều kiện môi trường và quản lý nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy tối ưu bao gồm nhiệt độ 20-25°C, ánh sáng trắng 16 giờ/ngày với cường độ 1000-1500 lux. Môi trường MS được bổ sung hormone thích hợp và duy trì pH 5,6-5,8 để đạt hiệu suất cao trong quá trình nhân giống Hà thủ ô đỏ.

IV. Ứng dụng và triển vọng phát triển nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ

Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ mở ra những triển vọng lớn cho sản xuất dược liệu bền vững. Kỹ thuật này giải quyết bài toán cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho các công ty dược phẩm và các cơ sở sản xuất thực phẩm bổ sung. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô cho phép tạo ra cây con đồng nhất, có chất lượng cao và không bị suy giảm gen so với cây mẹ. Điều này đặc biệt quan trọng đối với loài Hà thủ ô đỏ, vì những con duông chứa các hoạt chất dược lý quý giá được tìm kiếm nhiều trên thị trường. Quy trình nhân giống in vitro cũng giúp bảo tồn nguồn gen của loài này trước áp lực khai thác quá mức từ tự nhiên. Ngoài ra, công nghệ nuôi cấy mô có thể được áp dụng cho các loài cây dược liệu khác, mở rộng ứng dụng trong nông nghiệp công nghệ cao và phát triển bền vững. Việc tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình nhân giống Hà thủ ô đỏ sẽ góp phần quan trọng vào phát triển ngành dược liệu Việt Nam.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất dược liệu công nghiệp

Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ cho phép sản xuất hàng loạt nguyên liệu với chi phí thấp hơn khai thác tự nhiên 30-50%. Các công ty dược phẩm có thể ứng dụng quy trình nhân giống này để cung cấp sản phẩm ổn định và đạt tiêu chuẩn chất lượng quốc tế. Điều này thúc đẩy phát triển ngành dược liệu hiện đại.

4.2. Bảo tồn nguồn gen và phát triển bền vững

Công nghệ nuôi cấy mô giúp bảo vệ Hà thủ ô đỏ khỏi nguy cơ tuy絕 chủng từ khai thác quá mức. Nhân giống in vitro cho phép tạo các ngân hàng gen và bảo tồn tính chất di truyền quý giá. Đây là giải pháp thực tế cho phát triển bền vững của nông nghiệp dược liệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- TRẦN THỊ KIM QUỲNH ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 05 năm 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Tên đề tài: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ KIM QUỲNH MSSV: 2114022731 CHUYÊN NGÀNH: SƢ PHẠM SINH HỌC - KTNN KHÓA 2014 – 2018 Cán bộ hƣớng dẫn Th.S Hồ Thị Kim Cúc MSCB: Quảng Nam, tháng 5 năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam, tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng nhƣ thực hành thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Hồ Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị làm việc tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam – nơi tôi thực hiện đề tài đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, động viên tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, luôn động viên và khích lệ tôi để tôi đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4-D 2,4 – Diclorophenoxy Acetic Acid BA 6-benzyl adenine cs Cộng sự CT Công thức IBA Indole 3-butyric acid MS Môi trƣờng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) NAA α-naphthalen acetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các công thức môi trƣờng khảo sát sự ảnh hƣởng của 20 Javen đối với mẫu khử 2.2 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả 21 năng tái sinh chồi trực tiếp 2.3 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA 21 đến khả năng nhân nhanh chồi 2.4 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả 22 năng ra rễ 3.1 Kết quả sử dụng Javen để khử trùng mẫu cấy 25 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả 27 năng tái sinh chồi trực tiếp 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA 29 đến khả năng nhân nhanh chồi 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả 32 năng ra rễ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Ảnh hƣởng của Javen đối với mẫu khử 26 3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi 28 trực tiếp 3.3 Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả 30 năng nhân nhanh chồi 3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.2 Cây Hà thủ ô đỏ 12 1.3 Củ Hà thủ ô đỏ 12 3.1 Mẫu cấy đã thích ứng với môi trƣờng 27 3.2 Tái sinh chồi sau 2 tuần 29 3.3 Tái sinh chồi sau 3 tuần 29 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng 31 nhân nhanh chồi 3.5 Rễ Hà thủ ô sau 1 tuần 33 3.6 Rễ Hà thủ ô sau 2 tuần 33 3.7 Rễ Hà thủ ô sau 3 tuần 34 3.8 Rễ Hà thủ ô sau 4 tuần 34 MỤC LỤC I.1 Lý do chọn đề tài. Mục tiêu của đề tài.

Đối tƣợng nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật.

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới. Sơ lƣợc lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam.

Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dƣợc liệu. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ. Tên khoa học. Nguồn gốc và phân bố.

Đặc điểm hình thái. Đặc điểm sinh thái. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ô đỏ. Giá trị dƣợc liệu của cây Hà thủ ô đỏ.

Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ. 14 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Nguyên liệu khởi đầu.

Điều kiện nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy. Quy trình nhân giống. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Phƣơng pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy. Phƣơng pháp chọn mẫu cấy. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ. Các chỉ tiêu quan sát. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Khảo sát nồng độ javen trong khử trùng mẫu cấy.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong môi trƣờng tái sinh chồi trực tiếp. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng nhân nhanh chồi. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA trong môi trƣờng ra rễ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa học công nghệ có triển vọng nhất hiện nay. Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp những kĩ thuật đƣợc sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng, môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng với những thành phần xác định. Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo ra lợi thế nhất định so với phƣơng pháp truyền thống nhƣ: tạo ra số lƣợng lớn cây giống từ bất kì bộ phận nào của cây, hạn chế tối đa khả năng phát tán sâu bệnh, bảo tồn các nguồn gen thực vật quý hiếm.[3] Thảo dƣợc là nguồn thực vật quý giá để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con ngƣời. Vì vậy, nhu cầu trồng trọt các giống dƣợc liệu quý hiếm ngày càng tăng lên.

Xuất phát từ nhu cầu đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cung cấp các giống dƣợc liệu cho nông dân đang trở thành xu hƣớng phát triển ở nhiều tỉnh thành trong cả nƣớc.[4] Hà Thủ Ô đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm. Theo Đông y, Hà Thủ Ô đỏ có tác dụng làm đen tóc, bổ máu, an thần, dƣỡng can, ích thận, nhuận tràng và kéo dài tuổi thọ. Y học hiện đại xác nhận rằng hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ huyết áp, chống xơ cứng động mạch, làm giảm lƣợng đƣờng trong máu, tăng cƣờng miễn dịch, máu, làm giãn mạch máu, tốt cho tim mạch, thúc đẩy chức năng tuyến thƣợng thận, và thúc đẩy nhu động đƣờng tiêu hóa, bảo vệ tim và mạch máu não, bảo vệ gan, tăng trƣởng tóc, chống lão hóa, và kháng khuẩn. Trong cây Hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng nhƣ: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… [4] Trƣớc đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nƣớc ta khá dồi dào nhƣng do bị khai thác quá mức và nạn phá rừng đã làm cho số lƣợng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút đáng kể, không cung cấp đủ cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa bệnh cho con ngƣời.

Do đó, việc nhân nhanh Hà thủ ô đỏ với số lƣợng lớn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào là việc làm hết sức cần thiết. 1 Xuất phát từ lí do trên, tôi thực hiện đề tài: “ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)”. Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen trong khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA đến tái sinh chồi trực tiếp Hà thủ ô đỏ.

- Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ BA và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ IBA thích hợp cho nuôi cấy tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ. Đối tƣợng nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.

Địa điểm nghiên cứu Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc nghiên cứu thừ tháng 11/2017 – 3/2018. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp thực nghiệm - Phƣơng pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: Dựa vào tính toàn năng của tế bào. Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.

Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật Nhân giống in vitro ở thực vật có ý nghĩa và vai trò to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời góp phần trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.