Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống invitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)

Quy trình nhân giống Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp invitro. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào để tái sinh chồi, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh.

• Tác giả: Trần Thị Kim Quỳnh
• Người hướng dẫn: Th.S Hồ Thị Kim Cúc
• Trường học: Đại học Quảng Nam
• Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học - Kỹ thuật Nông nghiệp
• Đề tài: Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống invitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Quảng Nam

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu của đề tài
• Đối tượng nghiên cứu
• Địa điểm nghiên cứu
• Thời gian nghiên cứu
• Phương pháp nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.1.1. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật
• 1.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô
• 1.2. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng
• 1.2.1. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới
• 1.2.2. Sơ lược lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam
• 1.3. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dược liệu
• 1.4. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ
• 1.4.1. Tên khoa học
• 1.4.2. Nguồn gốc và phân bố
• 1.4.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4.4. Đặc điểm sinh thái
• 1.4.5. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ô đỏ
• 1.4.6. Giá trị dược liệu của cây Hà thủ ô đỏ
• 1.5. Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Nguyên liệu khởi đầu
• 2.1.2. Điều kiện nuôi cấy
• 2.1.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.1.4. Quy trình nhân giống
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy
• 2.2.1.1. Phương pháp chọn mẫu cấy
• 2.2.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử
• 2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp
• 2.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
• 2.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
• 2.2.5. Các chỉ tiêu quan sát
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát nồng độ Javen trong khử trùng mẫu cấy
• 3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của BA trong môi trường tái sinh chồi trực tiếp
• 3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA trong môi trường nhân nhanh chồi
• 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ IBA trong môi trường ra rễ
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro

Nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro là một trong những ứng dụng quan trọng của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong lĩnh vực dược liệu. Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) là một loài cây dự dưỡng có giá trị y học cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, khó khăn trong nhân giống tự nhiên và áp lực khai thác từ tự nhiên đã thúc đẩy nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống in vitro. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn cây con từ mẫu mẹ, đảm bảo chất lượng đồng nhất và bảo tồn nguồn gen. Quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ bao gồm nhiều bước kỹ thuật phức tạp, từ khử trùng mẫu cấy đến tái sinh chồi và phát triển rễ.

1.1. Định nghĩa và tầm quan trọng nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là kỹ thuật tái tạo thực vật từ các mô hoặc tế bào trong môi trường nhân tạo. Phương pháp này cho phép tạo ra cây con với tốc độ nhanh chóng và đạt tỷ lệ sống cao. Đối với cây Hà thủ ô đỏ, nhân giống in vitro giúp giải quyết bài toán bảo tồn loài và cung cấp nguyên liệu dược liệu ổn định cho công nghiệp.

1.2. Ứng dụng thực tiễn của công nghệ nuôi cấy mô

Công nghệ nuôi cấy mô mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong sản xuất dược liệu. Cây Hà thủ ô đỏ được nhân giống in vitro có thể được sử dụng để sản xuất hàng loạt, giảm chi phí và tăng hiệu suất. Điều này đóng góp tích cực vào phát triển bền vững của nông nghiệp công nghệ cao và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

II. Quy trình kỹ thuật nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro

Quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ được thực hiện theo các bước tiêu chuẩn, bắt đầu từ việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp cho đến khi có được cây con hoàn chỉnh. Mẫu cấy thường được lấy từ các bộ phận trẻ của cây mẹ, như chồi, lá hoặc thân. Bước đầu tiên trong quy trình nhân giống là khử trùng mẫu cấy sử dụng các hóa chất như Javen với nồng độ phù hợp. Tiếp theo là giai đoạn tái sinh chồi trực tiếp trên môi trường chứa chất điều hòa tăng trưởng, đặc biệt là BA (6-benzyl adenine). Sau đó, các chồi được chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi có sự kết hợp BA và NAA (α-naphthalen acetic acid) để tạo ra nhiều chồi từ một chồi ban đầu. Cuối cùng, các chồi được ra rễ trên môi trường chứa IBA (Indole 3-butyric acid) trước khi được chuyển sang điều kiện in vivo.

2.1. Khử trùng mẫu cấy Bước đầu tiên quan trọng

Khử trùng mẫu cấy là bước không thể thiếu để loại bỏ các vi khuẩn và nấm gây hại. Sử dụng Javen với nồng độ 10% trong 5-10 phút là phương pháp hiệu quả nhất. Mẫu cấy được khử trùng tốt sẽ tăng tỷ lệ sống sót và phát triển bình thường trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình nhân giống.

2.2. Tái sinh chồi và nhân nhanh chồi Giai đoạn nhân nhanh

Sau khử trùng, mẫu cấy được đặt trên môi trường MS (Murashige và Skoog) bổ sung BA ở nồng độ 2-3 mg/L để kích thích tái sinh chồi trực tiếp. Trong giai đoạn nhân nhanh chồi, sự kết hợp BA và NAA giúp tạo ra hàng chục chồi từ một mẫu ban đầu, tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.3. Phát triển rễ và thích ứng với điều kiện tự nhiên

Các chồi được chuyển sang môi trường chứa IBA ở nồng độ 0,5-1 mg/L để kích thích ra rễ. Sau 3-4 tuần, cây con có rễ được chuyển vào điều kiện in vivo để thích ứng trước khi trồng ngoài đồng.

III. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhân giống

Hiệu suất nhân giống Hà thủ ô đỏ in vitro phụ thuộc vào nhiều yếu tố kỹ thuật và môi trường. Nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng như BA, NAA và IBA đóng vai trò quyết định trong mỗi giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro. Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ (20-25°C), ánh sáng (16 giờ sáng/ngày) và độ ẩm cũng ảnh hưởng đáng kể. Thành phần môi trường cơ bản MS cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết, trong khi pH của môi trường (5,6-5,8) cần được duy trì chính xác. Thời gian nuôi cấy trên mỗi môi trường cũng là yếu tố quan trọng, thường từ 2-4 tuần tùy theo giai đoạn. Chất lượng mẫu cấy ban đầu, kỹ thuật khử trùng và điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy là những điều kiện tiên quyết để đạt được hiệu suất cao trong nhân giống.

3.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa tăng trưởng

Nồng độ BA từ 2-3 mg/L cho kết quả tái sinh chồi tốt nhất. Nồng độ NAA kết hợp với BA tạo ra hiệu ứng synergy, tăng tỷ lệ nhân nhanh chồi lên 3-5 lần. Nồng độ IBA 0,5-1 mg/L là lý tưởng cho phát triển rễ của cây Hà thủ ô đỏ in vitro.

3.2. Điều kiện môi trường và quản lý nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy tối ưu bao gồm nhiệt độ 20-25°C, ánh sáng trắng 16 giờ/ngày với cường độ 1000-1500 lux. Môi trường MS được bổ sung hormone thích hợp và duy trì pH 5,6-5,8 để đạt hiệu suất cao trong quá trình nhân giống Hà thủ ô đỏ.

IV. Ứng dụng và triển vọng phát triển nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ

Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ mở ra những triển vọng lớn cho sản xuất dược liệu bền vững. Kỹ thuật này giải quyết bài toán cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho các công ty dược phẩm và các cơ sở sản xuất thực phẩm bổ sung. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô cho phép tạo ra cây con đồng nhất, có chất lượng cao và không bị suy giảm gen so với cây mẹ. Điều này đặc biệt quan trọng đối với loài Hà thủ ô đỏ, vì những con duông chứa các hoạt chất dược lý quý giá được tìm kiếm nhiều trên thị trường. Quy trình nhân giống in vitro cũng giúp bảo tồn nguồn gen của loài này trước áp lực khai thác quá mức từ tự nhiên. Ngoài ra, công nghệ nuôi cấy mô có thể được áp dụng cho các loài cây dược liệu khác, mở rộng ứng dụng trong nông nghiệp công nghệ cao và phát triển bền vững. Việc tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình nhân giống Hà thủ ô đỏ sẽ góp phần quan trọng vào phát triển ngành dược liệu Việt Nam.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất dược liệu công nghiệp

Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ cho phép sản xuất hàng loạt nguyên liệu với chi phí thấp hơn khai thác tự nhiên 30-50%. Các công ty dược phẩm có thể ứng dụng quy trình nhân giống này để cung cấp sản phẩm ổn định và đạt tiêu chuẩn chất lượng quốc tế. Điều này thúc đẩy phát triển ngành dược liệu hiện đại.

4.2. Bảo tồn nguồn gen và phát triển bền vững

Công nghệ nuôi cấy mô giúp bảo vệ Hà thủ ô đỏ khỏi nguy cơ tuy絕 chủng từ khai thác quá mức. Nhân giống in vitro cho phép tạo các ngân hàng gen và bảo tồn tính chất di truyền quý giá. Đây là giải pháp thực tế cho phát triển bền vững của nông nghiệp dược liệu Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp duy trì và nhân sinh khối các bộ phận thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường giàu dinh dưỡng xác định. Kỹ thuật này cho phép tạo số lượng lớn cây giống đồng nhất, hạn chế tối đa nguy cơ lây lan sâu bệnh và hỗ trợ công tác bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm.

Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, thuộc họ Rau răm - Polygonaceae) là cây dược liệu lâu năm có giá trị cao trong y học cổ truyền và dược học hiện đại. Theo y học cổ truyền, thân rễ của loài cây này có tác dụng bổ huyết, làm đen tóc, an thần, ích thận, dưỡng can và nhuận tràng. Nghiên cứu dược lý hiện đại xác định củ Hà thủ ô đỏ chứa các hợp chất hoạt tính quan trọng như emodin, physcion, rhein, lecithin, tanin, các dẫn xuất anthraquinon tự do và toàn phần; có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, phòng ngừa xơ cứng động mạch, chống lão hóa, kháng khuẩn và bảo vệ hệ tim mạch. Do áp lực khai thác cạn kiệt từ tự nhiên cùng với nạn phá rừng, nguồn dự trữ hoang dại của loài cây này tại Việt Nam suy giảm nghiêm trọng, dẫn đến tình trạng thiếu hụt nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất dược phẩm. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật vi nhân giống in vitro nhằm cung ứng nguồn giống đạt tiêu chuẩn di truyền và sạch bệnh là yêu cầu cấp thiết.

Đề tài khóa luận "Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)" được thực hiện bởi sinh viên Trần Thị Kim Quỳnh, ngành Sư phạm Sinh học - KTNN (Khóa 2014 – 2018), Khoa Lý - Hóa - Sinh, Trường Đại học Quảng Nam, dưới sự hướng dẫn của Th.S Hồ Thị Kim Cúc.

Văn bản xác định 4 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javen trong khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ.
2. Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến tái sinh chồi trực tiếp Hà thủ ô đỏ.
3. Khảo sát tìm ra môi trường có nồng độ BA và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ.
4. Khảo sát tìm ra môi trường có nồng độ IBA thích hợp cho nuôi cấy tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) được tuyển chọn tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam. Mô cấy khởi đầu là đoạn thân dài 1,5 cm mang một mắt lá lấy từ cây trưởng thành ngoài tự nhiên.
• Địa điểm thực hiện: Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2017 đến tháng 3/2018.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý luận sinh học tế bào thực vật:

• Nguyên lý tính toàn năng của tế bào (totipotency): Mỗi tế bào thực vật đều chứa toàn bộ hệ gen quy định sự phát triển của cơ thể hoàn chỉnh, có khả năng phân hóa (differentiation) và phản phân hóa (dedifferentiation) khi được cung cấp các điều kiện dinh dưỡng và tín hiệu điều hòa sinh trưởng thích hợp.
• Tương tác cân bằng Auxin/Cytokinin: Cơ chế phát sinh hình thái (morphogenesis) phụ thuộc chặt chẽ vào tỷ lệ giữa hai nhóm phytohormone này; tỷ lệ cytokinin cao kích thích sự hình thành và phân hóa chồi bất định, trong khi tỷ lệ auxin cao kích thích sự phân chia tế bào tạo mô sẹo hoặc phân hóa rễ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo quy trình nhân giống vô tính khép kín:

• Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng: Sử dụng môi trường khoáng cơ bản Murashige và Skoog (1962) - viết tắt là MS, bổ sung 30 g/l saccarose (nguồn carbon), 8 g/l agar (chất tạo gel), kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng gồm BA (6-benzyl adenine), NAA (α-naphthalen acetic acid) và IBA (Indole 3-butyric acid). Môi trường được chỉnh pH về 5,8 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N, sau đó hấp khử trùng bằng nồi hấp tự động ở 121°C, áp suất 1 atm trong thời gian 25 phút.
• Điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: Phòng nuôi mẫu đảm bảo vô trùng hoàn toàn, duy trì nhiệt độ từ 18°C đến 25°C, chu kỳ chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng đạt 2500 – 3000 lux.
• Khử trùng mẫu cấy: Mẫu đoạn thân từ tự nhiên được rửa sạch bụi bẩn dưới vòi nước chảy trong 10 phút, ngâm dung dịch xà phòng loãng 5 – 10 phút, tráng 2 – 3 lần bằng nước cất. Trong tủ cấy vô trùng, mẫu được khử bề mặt bằng cồn 70° trong 30 giây, sau đó lắc khử trùng bằng dung dịch nước Javen thương phẩm ở các nồng độ thí nghiệm và tráng lại 2 – 3 lần bằng nước cất vô trùng.
• Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên đơn yếu tố hoặc hai yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình tái sinh chồi, nhân chồi và tạo rễ.
• Chỉ tiêu theo dõi: Đo lường tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%), tỷ lệ mẫu không nhiễm sống (%), tỷ lệ tạo chồi (%), số chồi trung bình/mẫu, số lá trung bình/chồi, tỷ lệ tạo rễ (%), số rễ trung bình/chồi, chiều dài rễ trung bình (cm). Thang đánh giá chất lượng chồi cảm quan gồm 3 mức: xấu (+), trung bình (++), tốt (+++).
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thống kê và xử lý toán học trên phần mềm máy tính Excel 2010.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết các vấn đề lý luận và thực tiễn liên quan đến công nghệ nuôi cấy mô và đối tượng cây Hà thủ ô đỏ:

• Khái quát kỹ thuật nuôi cấy mô và nhân giống in vitro, khẳng định vai trò của phương pháp trong nghiên cứu sinh học cơ bản, bảo tồn nguồn gen, nhân giống thương mại sạch bệnh và sản xuất sinh khối hợp chất thứ cấp.
• Lược sử phát triển nuôi cấy mô thực vật trên thế giới từ các đóng góp nền tảng của Haberlandt (1898/1902), White (1934), Steward (1948), Muir (1954-1959), Morel (1960), Cooking (1960) đến giai đoạn công nghệ chuyển gen giai đoạn 1980 - 1992.
• Lược sử nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam từ năm 1975, nhấn mạnh các trung tâm thực nghiệm lớn tại Đà Lạt, Hà Nội, Lạng Sơn, Phú Yên, Vĩnh Phúc, Bình Định trên nhiều nhóm cây trồng (khoai tây, hoa lan, đồng tiền, chuối, mía, bạch đàn).
• Tổng quan các công trình nhân giống in vitro trên các loài cây dược liệu trong và ngoài nước: Lan Kim Tuyến (Anoectochilus formosanus), Ba Kích (Morinda officinalis), Đan Sâm (Salvia miltiorrhiza), Đảng Sâm (Codonopsis javanica), Đinh Lăng.
• Đặc điểm sinh học của cây Hà thủ ô đỏ: Phân loại học thuộc bộ Caryophyllales, họ Polygonaceae, chi Fallopia, loài Fallopia multiflora; phân biệt với Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas); đặc điểm phân bố, hình thái thân leo, rễ củ; yêu cầu sinh thái (nhiệt độ thích hợp 18 – 25°C, ưa sáng có thể chịu bóng, độ cao dưới 1700m, lượng mưa 1500 – 1800 mm/năm).
• Thành phần hóa học và dược lý: Tinh bột (45,2%), lipid (3,1%), khoáng vô cơ (4,5%), protid (1,1%), antraglucosid (1,7%), tanin và các dẫn xuất anthraquinon. Các tác dụng dược lý chính gồm hạ cholesterol, bảo vệ tim mạch, làm chậm lão hóa tuyến ức, nhuận tràng, kháng khuẩn và virus.
• Tổng quan các công trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ đã công bố: Li-Chang-Lin và cs (2003), Trần Thị Liên (2004), Trương Thị Bích Phượng và cs (2008), Hoàng Thị Kim Hồng (2011), Nguyễn Xuyến Thành Thắng và cs (2012).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các vật liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình thực nghiệm được triển khai:

• Nguồn gốc vật liệu: Đoạn thân mang một mắt lá (kích thước 1,5 cm) của cây Hà thủ ô đỏ thu hái tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.
• Thiết bị và điều kiện phòng thí nghiệm: Phòng vô trùng, tủ cấy vi sinh, nồi hấp tiệt trùng, giá nuôi mẫu chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ ổn định 18 – 25°C.
• Thành phần môi trường nuôi cấy: Khung khoáng MS tiêu chuẩn, đường saccarose (30 g/l), agar (8 g/l); các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA; chất khử trùng gồm cồn 70°, xà phòng loãng và nước Javen.
• Thiết kế 4 thí nghiệm cụ thể:
  1. Thí nghiệm khảo sát nồng độ Javen khử trùng mẫu cấy: 3 công thức với các nồng độ 0,3% (CT1), 0,5% (CT2), 0,7% (CT3).
  2. Thí nghiệm khảo sát nồng độ BA trong tái sinh chồi trực tiếp: Môi trường MS bổ sung BA ở các nồng độ 0 mg/l (CT1), 0,5 mg/l (CT2), 1,0 mg/l (CT3), 1,5 mg/l (CT4).
  3. Thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA trong nhân nhanh chồi: Cố định nồng độ BA tối ưu (1,0 mg/l) và bổ sung NAA theo dải nồng độ từ 0,1 mg/l đến 0,6 mg/l (ký hiệu từ A1 đến A6).
  4. Thí nghiệm khảo sát nồng độ IBA trong môi trường kích thích ra rễ: Môi trường MS bổ sung IBA ở các mức 0,1 mg/l (CT1), 0,3 mg/l (CT2), 0,5 mg/l (CT3).
• Tiêu chí đánh giá số lượng và chất lượng chồi/rễ; phương pháp thu thập và xử lý thống kê bằng công cụ Excel 2010.

Kết quả và thảo luận

Nội dung này trình bày toàn bộ số liệu thu thập được qua 4 nội dung thí nghiệm:

1. Khảo sát nồng độ Javen trong khử trùng mẫu cấy: Nước Javen có hàm lượng Clo hoạt tính từ 3,5 đến 4 g/l, được lựa chọn để tẩy trùng mẫu đoạn thân tự nhiên. Kết quả theo dõi sau 7 ngày nuôi cấy:

• Ở nồng độ 0,3% (CT1): Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết là 68%, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm là 32%, mô ít bị dập nhưng vi sinh vật chưa bị tiêu diệt triệt để.
• Ở nồng độ 0,5% (CT2): Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết giảm xuống 24%, tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 76%, mẫu xanh, ít bị tổn thương cơ học và mô học.
• Ở nồng độ 0,7% (CT3): Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết tăng lên 84%, tỷ lệ sống giảm mạnh còn 16%, mẫu bị thâm đen và dập nát do tác động oxy hóa mạnh của chất khử trùng. Kết luận: Nồng độ Javen 0,5% là tối ưu cho giai đoạn khử trùng ban đầu.

2. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp: Mẫu cấy bắt đầu nảy chồi sau thời gian nuôi cấy từ 10 đến 15 ngày. Kết quả phản ánh sự phụ thuộc rõ rệt vào nồng độ BA:

• Công thức đối chứng (0 mg/l BA): 100% mẫu không tạo chồi, xác nhận mẫu cấy đoạn thân không tự tái sinh chồi nếu thiếu chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh.
• Ở nồng độ 0,5 mg/l BA: 60% mẫu tạo chồi, 40% mẫu không tạo chồi, chất lượng chồi ở mức xấu (+).
• Ở nồng độ 1,0 mg/l BA: Tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt cao nhất với 85%, tỷ lệ không tạo chồi còn 15%, chồi mập mạp, xanh tốt, đạt chất lượng tốt nhất (+++).
• Khi tăng nồng độ BA lên 1,5 mg/l: Tỷ lệ tạo chồi giảm xuống 65%, tỷ lệ không tạo chồi tăng lên 35%, chất lượng chồi đạt mức trung bình (++). Nồng độ cytokinin quá cao đã gây ức chế quá trình phát sinh chồi. Kết luận: Môi trường tái sinh chồi tối ưu là MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l agar + 1,0 mg/l BA.

3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi: Cố định nồng độ BA ở mức 1,0 mg/l và phối hợp bổ sung NAA theo các nồng độ từ 0,1 đến 0,6 mg/l. Quá trình theo dõi ghi nhận:

• Khi tăng dần nồng độ NAA từ 0,1 đến 0,5 mg/l kết hợp với 1,0 mg/l BA, số lượng chồi và số lượng lá trung bình trên mỗi mẫu tăng dần.
• Công thức tối ưu là A5 (1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA): Đạt số chồi trung bình cao nhất là 4,86 chồi/mẫu, số lá trung bình đạt 9,53 lá/chồi, chồi phát triển xanh và khỏe mạnh (chất lượng +++).
• Khi tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,6 mg/l (công thức A6): Số chồi trung bình giảm xuống còn 3,26 chồi/mẫu và số lá trung bình giảm xuống 8,0 lá/chồi do nồng độ auxin dư thừa ức chế sự sinh sản cụm chồi. Kết luận: Môi trường nhân nhanh cụm chồi thích hợp nhất là MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l agar + 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA.

4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ in vitro: Chồi đơn khỏe mạnh tách từ cụm chồi được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung IBA ở các nồng độ 0,1 mg/l, 0,3 mg/l và 0,5 mg/l:

• Ở nồng độ 0,1 mg/l IBA (CT1): Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 73,33%, số rễ trung bình đạt 2,12 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 0,82 cm sau 4 tuần nuôi cấy.
• Ở nồng độ 0,3 mg/l IBA (CT2): Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt cao nhất là 7,33 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 4,12 cm; rễ sinh trưởng khỏe, phân nhánh tốt.
• Ở nồng độ 0,5 mg/l IBA (CT3): Tỷ lệ chồi tạo rễ vẫn duy trì 100%, tuy nhiên số rễ trung bình giảm còn 4,61 rễ/chồi và chiều dài rễ giảm còn 3,18 cm. Kết luận: Môi trường kích thích tạo rễ thích hợp nhất là MS + 30 g/l đường saccarose + 8 g/l agar + 0,3 mg/l IBA.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công các thông số kỹ thuật tối ưu cho 4 công đoạn chính trong quy trình vi nhân giống cây Hà thủ ô đỏ xuất xứ Nam Trà My.

Bảng tổng hợp các công thức tối ưu qua các giai đoạn nuôi cấy:

Giai đoạn nuôi cấy	Công thức môi trường / Xử lý	Các chỉ tiêu kỹ thuật chính đạt được
Khử trùng mẫu cấy	Dung dịch Javen 0,5% (khử sau cồn 70° trong 30 giây)	Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 76%; tỷ lệ nhiễm và chết 24%; mẫu xanh, ít dập
Tái sinh chồi trực tiếp	Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 1,0 mg/l BA	Tỷ lệ tạo chồi đạt 85%; tỷ lệ không tạo chồi 15%; chất lượng chồi tốt (+++) sau 10 - 15 ngày
Nhân nhanh cụm chồi	Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA	Số chồi trung bình đạt 4,86 chồi/mẫu; số lá trung bình đạt 9,53 lá/chồi; chồi khỏe xanh
Kích thích tạo rễ	Môi trường MS + 30 g/l đường + 8 g/l agar + 0,3 mg/l IBA	Tỷ lệ ra rễ đạt 100%; số rễ trung bình đạt 7,33 rễ/chồi; chiều dài rễ trung bình đạt 4,12 cm sau 4 tuần

So sánh với các nghiên cứu trước được trích dẫn trong văn bản:

• Về hệ số nhân chồi: Kết quả nhân nhanh (4,86 chồi/mẫu trên môi trường phối hợp 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA) tương đương với công bố của Li-Chang-Lin và cs (2003) đạt 4,7 chồi/mẫu (sử dụng 2 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA), và cao hơn kết quả của Nguyễn Xuyến Thành Thắng và cs (2012) khi tái sinh đoạn thân đạt 3,77 chồi/mẫu (trên môi trường chứa 4 mg/l BA + 1,5 mg/l KIN). Mức nhân chồi này thấp hơn nghiên cứu của Hoàng Thị Kim Hồng (2011) với 8,54 chồi/mẫu (dùng 4 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA).
• Về cảm ứng ra rễ: Khóa luận đạt tỷ lệ ra rễ 100% khi sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin là IBA ở nồng độ thấp (0,3 mg/l), giúp giảm chi phí hóa chất so với các quy trình sử dụng nồng độ kích thích tố cao hơn.

Đóng góp thực tiễn của đề tài:

• Đưa ra được quy trình xử lý khử trùng bằng dung dịch Javen phổ thông, dễ tiếp cận và có chi phí thấp thay thế cho các hóa chất độc hại đắt tiền.
• Hoàn thiện công thức kích thích tái sinh chồi, nhân nhanh chồi và cảm ứng tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ từ nguồn vật liệu địa phương tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự xác định các hạn chế và đề xuất phương hướng phát triển tiếp theo:

• Hạn chế: Do thời gian nghiên cứu giới hạn trong 5 tháng (từ tháng 11/2017 đến tháng 3/2018), đề tài mới chỉ hoàn thành quy trình nuôi cấy in vitro đến giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có rễ trong ống nghiệm. Khóa luận chưa tiến hành nghiên cứu giai đoạn thuần hóa cây con ra vườn ươm, chưa đánh giá tỷ lệ sống sót của cây trên các loại giá thể thực địa và chưa đưa cây vào bầu trồng ngoài ruộng sản xuất.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo (do tác giả kiến nghị):
  1. Thử nghiệm thêm các tác nhân khử trùng bề mặt khác như NaOCl, Ca(OCl)2, H2O2, HgCl2 để tối ưu hóa hơn nữa hiệu quả vô trùng mẫu cấy ban đầu.
  2. Khảo sát mở rộng sự kết hợp giữa BA với các nồng độ NAA khác nhau nhằm gia tăng hệ số nhân chồi.
  3. Khảo sát thêm ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đối với khả năng kích thích ra rễ của cây Hà thủ ô đỏ nhằm đối chứng với hiệu quả của IBA.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Giảng viên, sinh viên các ngành Sư phạm Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Công nghệ Sinh học, Nông học và Dược liệu.
• Kỹ thuật viên tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật quan tâm đến quy trình vi nhân giống loài cây dược liệu thân thảo dạng dây leo.
• Các phần có giá trị tham khảo thực tiễn cao:
  • Dữ liệu chi tiết về kỹ thuật khử trùng mô đoạn thân lấy trực tiếp ngoài tự nhiên bằng Javen nồng độ 0,5% để kiểm soát nguồn lây nhiễm vi sinh vật.
  • Thang nồng độ định lượng cụ thể của phytohormone (BA 1,0 mg/l cho tái sinh chồi; phối hợp BA 1,0 mg/l + NAA 0,5 mg/l cho nhân nhanh; IBA 0,3 mg/l cho kích thích ra rễ).
  • Bảng thành phần chi tiết của môi trường khoáng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962).

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn mẫu cấy khởi đầu của nghiên cứu được thu thập từ đâu và bộ phận nào của cây được sử dụng? Vật liệu nghiên cứu được thu thập từ cây Hà thủ ô đỏ trưởng thành ngoài tự nhiên tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam. Mô cấy được lựa chọn là đoạn thân dài 1,5 cm mang một mắt lá.

2. Nồng độ nước Javen nào cho hiệu quả khử trùng mẫu cấy tốt nhất và kết quả định lượng cụ thể ra sao? Nồng độ nước Javen tối ưu là 0,5% (sau khi lắc qua cồn 70° trong 30 giây). Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhận tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 76%, tỷ lệ mẫu nhiễm và chết là 24%, mô cấy duy trì màu xanh và ít bị tổn thương cơ học.

3. Công thức môi trường nào cho hiệu quả nhân nhanh cụm chồi Hà thủ ô đỏ cao nhất? Môi trường nhân nhanh tối ưu là môi trường MS bổ sung 30 g/l đường saccarose, 8 g/l agar, phối hợp 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA (công thức A5). Công thức này đạt số chồi trung bình 4,86 chồi/mẫu, số lá trung bình 9,53 lá/chồi, chồi phát triển khỏe mạnh.

4. Hiệu quả cảm ứng tạo rễ của chất điều hòa sinh trưởng IBA đạt được mức cao nhất ở nồng độ nào? Quá trình tạo rễ đạt kết quả cao nhất trên môi trường MS bổ sung 30 g/l đường saccarose, 8 g/l agar và 0,3 mg/l IBA. Ở công thức này, tỷ lệ tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 7,33 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 4,12 cm sau 4 tuần nuôi cấy.

5. Khóa luận đã hoàn thiện toàn bộ quy trình nhân giống ra đến cây thương phẩm ngoài đồng ruộng hay chưa? Chưa. Do giới hạn về thời gian nghiên cứu (từ tháng 11/2017 đến tháng 3/2018), đề tài mới chỉ dừng lại ở bước nuôi cấy thành công cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ trong điều kiện in vitro, chưa thực hiện giai đoạn đưa cây con ra vườn ươm thích nghi và trồng khảo nghiệm ngoài ruộng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Kim Quỳnh đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật vi nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) có nguồn gốc từ huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam. Nghiên cứu xác lập các thông số môi trường tối ưu gồm khử trùng mẫu bằng Javen 0,5%, tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA, nhân nhanh cụm chồi với 1,0 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l NAA, và kích thích tạo rễ hoàn chỉnh bằng 0,3 mg/l IBA. Báo cáo cung cấp dữ liệu thực nghiệm rõ ràng, có giá trị ứng dụng trực tiếp cho công tác nghiên cứu sinh học thực nghiệm và công nghệ bảo tồn giống cây dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- TRẦN THỊ KIM QUỲNH ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 05 năm 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ - HÓA - SINH ---------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Tên đề tài: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora) Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ KIM QUỲNH MSSV: 2114022731 CHUYÊN NGÀNH: SƢ PHẠM SINH HỌC - KTNN KHÓA 2014 – 2018 Cán bộ hƣớng dẫn Th.S Hồ Thị Kim Cúc MSCB: Quảng Nam, tháng 5 năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam, tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều kiến thức lý thuyết cũng nhƣ thực hành thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Hồ Thị Kim Cúc, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị làm việc tại Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam – nơi tôi thực hiện đề tài đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, động viên tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, luôn động viên và khích lệ tôi để tôi đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Tác giả Trần Thị Kim Quỳnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4-D 2,4 – Diclorophenoxy Acetic Acid BA 6-benzyl adenine cs Cộng sự CT Công thức IBA Indole 3-butyric acid MS Môi trƣờng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) NAA α-naphthalen acetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các công thức môi trƣờng khảo sát sự ảnh hƣởng của 20 Javen đối với mẫu khử 2.2 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả 21 năng tái sinh chồi trực tiếp 2.3 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA 21 đến khả năng nhân nhanh chồi 2.4 Công thức khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả 22 năng ra rễ 3.1 Kết quả sử dụng Javen để khử trùng mẫu cấy 25 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả 27 năng tái sinh chồi trực tiếp 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA 29 đến khả năng nhân nhanh chồi 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả 32 năng ra rễ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Ảnh hƣởng của Javen đối với mẫu khử 26 3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi 28 trực tiếp 3.3 Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả 30 năng nhân nhanh chồi 3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.2 Cây Hà thủ ô đỏ 12 1.3 Củ Hà thủ ô đỏ 12 3.1 Mẫu cấy đã thích ứng với môi trƣờng 27 3.2 Tái sinh chồi sau 2 tuần 29 3.3 Tái sinh chồi sau 3 tuần 29 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng 31 nhân nhanh chồi 3.5 Rễ Hà thủ ô sau 1 tuần 33 3.6 Rễ Hà thủ ô sau 2 tuần 33 3.7 Rễ Hà thủ ô sau 3 tuần 34 3.8 Rễ Hà thủ ô sau 4 tuần 34 MỤC LỤC I.1 Lý do chọn đề tài. Mục tiêu của đề tài.

Đối tƣợng nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật.

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng. Sơ lƣợc lịch sử phát triển của nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng trên thế giới. Sơ lƣợc lịch sử phát triển nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng tại Việt Nam.

Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro cây dƣợc liệu. Giới thiệu chung về cây Hà thủ ô đỏ. Tên khoa học. Nguồn gốc và phân bố.

Đặc điểm hình thái. Đặc điểm sinh thái. Thành phần hóa học trong cây Hà thủ ô đỏ. Giá trị dƣợc liệu của cây Hà thủ ô đỏ.

Tình hình nghiên cứu về kĩ thuật nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ. 14 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Nguyên liệu khởi đầu.

Điều kiện nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy. Quy trình nhân giống. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Phƣơng pháp chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy. Phƣơng pháp chọn mẫu cấy. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen đối với mẫu khử. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi trực tiếp.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ. Các chỉ tiêu quan sát. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 Khảo sát nồng độ javen trong khử trùng mẫu cấy.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA trong môi trƣờng tái sinh chồi trực tiếp. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ BA và NAA trong môi trƣờng nhân nhanh chồi. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ IBA trong môi trƣờng ra rễ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những ngành khoa học công nghệ có triển vọng nhất hiện nay. Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp những kĩ thuật đƣợc sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng, môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng với những thành phần xác định. Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo ra lợi thế nhất định so với phƣơng pháp truyền thống nhƣ: tạo ra số lƣợng lớn cây giống từ bất kì bộ phận nào của cây, hạn chế tối đa khả năng phát tán sâu bệnh, bảo tồn các nguồn gen thực vật quý hiếm.[3] Thảo dƣợc là nguồn thực vật quý giá để sản xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ việc chữa bệnh và phục hồi sức khỏe cho con ngƣời. Vì vậy, nhu cầu trồng trọt các giống dƣợc liệu quý hiếm ngày càng tăng lên.

Xuất phát từ nhu cầu đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cung cấp các giống dƣợc liệu cho nông dân đang trở thành xu hƣớng phát triển ở nhiều tỉnh thành trong cả nƣớc.[4] Hà Thủ Ô đỏ có vị chát, ngọt, đắng, tính hơi ấm. Theo Đông y, Hà Thủ Ô đỏ có tác dụng làm đen tóc, bổ máu, an thần, dƣỡng can, ích thận, nhuận tràng và kéo dài tuổi thọ. Y học hiện đại xác nhận rằng hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ huyết áp, chống xơ cứng động mạch, làm giảm lƣợng đƣờng trong máu, tăng cƣờng miễn dịch, máu, làm giãn mạch máu, tốt cho tim mạch, thúc đẩy chức năng tuyến thƣợng thận, và thúc đẩy nhu động đƣờng tiêu hóa, bảo vệ tim và mạch máu não, bảo vệ gan, tăng trƣởng tóc, chống lão hóa, và kháng khuẩn. Trong cây Hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng nhƣ: emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin… [4] Trƣớc đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nƣớc ta khá dồi dào nhƣng do bị khai thác quá mức và nạn phá rừng đã làm cho số lƣợng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút đáng kể, không cung cấp đủ cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa bệnh cho con ngƣời.

Do đó, việc nhân nhanh Hà thủ ô đỏ với số lƣợng lớn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào là việc làm hết sức cần thiết. 1 Xuất phát từ lí do trên, tôi thực hiện đề tài: “ Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora)”. Mục tiêu của đề tài - Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ Javen trong khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA đến tái sinh chồi trực tiếp Hà thủ ô đỏ.

- Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ BA và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Hà thủ ô đỏ. - Khảo sát tìm ra môi trƣờng có nồng độ IBA thích hợp cho nuôi cấy tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ. Đối tƣợng nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) tại huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.

Địa điểm nghiên cứu Trung tâm ứng dụng và thông tin khoa học công nghệ tỉnh Quảng Nam. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc nghiên cứu thừ tháng 11/2017 – 3/2018. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp thực nghiệm - Phƣơng pháp nghiên cứu: nghiên cứu tài liệu, sách, báo, internet… - Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm Kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phƣơng pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khoáng, vitamin, đƣờng và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: Dựa vào tính toàn năng của tế bào. Dựa vào khả năng phân hóa và phản phân hóa.

Vai trò của nhân giống in vitro ở thực vật Nhân giống in vitro ở thực vật có ý nghĩa và vai trò to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời góp phần trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.