TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU A VÀ B CỦA AMITRIPTYLIN

Nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu A và B của Amitriptylin, phục vụ kiểm nghiệm thuốc. Quy trình, phương pháp sắc ký, kết quả kiểm tra tạp chất.

• Tác giả: Huỳnh Thị Mỹ Duyên
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Đức Tuấn
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất
• Đề tài: Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu A và B của Amitriptylin
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tổng quan về amitriptylin hydroclorid
• 1.2. Tổng quan về tạp A của amitriptylin theo BP 2022 và DĐVN V
• 1.3. Tổng quan về tạp B của amitriptylin theo BP 2022 và DĐVN V
• 1.4. Kiểm nghiệm tạp A và tạp B trong nguyên liệu và thành phẩm amitriptylin hydroclorid
• 1.5. Chất chuẩn đối chiếu
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Tổng hợp tạp A
• 2.5. Tổng hợp tạp B
• 2.6. Hiệu suất tổng hợp và tinh chế tạp A và tạp B
• 2.7. Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết của tạp A và tạp B bằng HPLC-PDA
• 3. ĐÁNH GIÁ TẠP A VÀ TẠP B
• 3.1. Thiết lập chất đối chiếu tạp A và tạp B
• 3.2. Kiểm tra tạp A và tạp B trong nguyên liệu và viên nén amitriptylin
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• Danh mục các bảng. DANH MỤC CÁC BẢNG
• Danh mục hình. DANH MỤC CÁC HÌNH
• Danh mục các sơ đồ. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Amitriptylin Tầm Quan Trọng Kiểm Nghiệm

Trầm cảm là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, ảnh hưởng đến hàng triệu người. Amitriptylin (AMT) là một trong những thuốc chống trầm cảm được sử dụng rộng rãi từ những năm 1960. Cơ chế tác dụng của Amitriptylin là ức chế tái hấp thu serotonin và noradrenalin. Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng Amitriptylin, đặc biệt là hàm lượng dược chất và tạp chất liên quan, là vô cùng quan trọng. Thông tư số 11/2018/TT-BYT quy định về chất lượng thuốc, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát tạp chất liên quan để đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh. Việc có sẵn chuẩn tạp chất chất lượng cao là điều cần thiết cho công tác kiểm nghiệm.

1.1. Cơ Chế Tác Dụng Ứng Dụng Của Amitriptylin Trong Điều Trị

Amitriptylin hoạt động bằng cách ức chế tái hấp thu các monoamin, serotonin và noradrenalin. Điều này làm tăng nồng độ các chất dẫn truyền thần kinh này trong não, giúp cải thiện tâm trạng và giảm các triệu chứng trầm cảm. Ngoài tác dụng chống trầm cảm, Amitriptylin cũng được sử dụng trong điều trị đau đầu do căng thẳng và đau nửa đầu. Tác dụng kháng cholinergic của thuốc cũng cần được xem xét khi sử dụng.

1.2. Tại Sao Phải Kiểm Soát Tạp Chất Trong Amitriptylin

Việc kiểm soát tạp chất trong Amitriptylin là vô cùng quan trọng vì sự thay đổi nhỏ về hàm lượng hoạt chất hoặc sự xuất hiện của tạp chất có thể ảnh hưởng đến hiệu quả lâm sàng và tính an toàn của thuốc. Thông tư số 11/2018/TT-BYT quy định xử phạt đối với thuốc không đạt chỉ tiêu tạp chất liên quan, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát tạp chất để bảo vệ sức khỏe người bệnh.

II. Thách Thức Thiếu Chuẩn Phương Pháp Tổng Hợp Tạp Chất

Việc kiểm soát tạp chất A và tạp chất B của Amitriptylin theo Dược điển Anh (BP) và Dược điển Việt Nam (DĐVN) gặp nhiều khó khăn do thiếu chuẩn tạp chất chất lượng cao và có giá cả hợp lý. Chuẩn tạp chất từ USP hoặc BP thường rất đắt và thời gian đặt hàng lâu. Theo BP 2022 và DĐVN V, cần kiểm tra dibenzosuberon (tạp A) và cyclobenzaprin (tạp B) trong nguyên liệu Amitriptylin. Việc tổng hợp và thiết lập chuẩn tạp chất trong nước là một giải pháp quan trọng để chủ động trong công tác kiểm nghiệm.

2.1. Khó Khăn Khi Mua Chuẩn Tạp Chất Từ Nguồn Quốc Tế USP BP

Giá thành của chuẩn tạp chất A và tạp chất B từ các nguồn như USP và BP rất cao. Ví dụ, giá tạp chuẩn A trên trang web của EP là 79 euro/30mg và của tạp chuẩn A USP là 903 USD/25mg. Thời gian đặt hàng lâu cũng là một vấn đề lớn, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm định kỳ.

2.2. Tình Hình Nghiên Cứu Về Tổng Hợp Tạp Chất A và B Amitriptylin

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tổng hợp tạp A và tổng hợp tạp B. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có tác giả nào công bố công trình tổng hợp hai tạp chất này. Điều này thúc đẩy việc thực hiện nghiên cứu để tổng hợp và thiết lập chuẩn tạp chất phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Thiết Lập Chuẩn Tạp Chất A B Hiệu Quả

Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp và thiết lập chuẩn tạp chất A (dibenzosuberon) và tạp chất B (cyclobenzaprin) của Amitriptylin. Tạp A được tổng hợp từ Amitriptylin bằng phản ứng oxy hóa khử với kali permanganat. Tạp B được tổng hợp bằng phản ứng dehydro hóa với dibutyl maleat. Sản phẩm được tinh chế và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm (phổ NMR, phổ IR, khối phổ MS), sau đó xác định độ tinh khiết bằng HPLC-PDA và thiết lập chất đối chiếu. Cuối cùng, hai tạp chất được sử dụng để kiểm tra trong một số nguyên liệu và thành phẩm Amitriptylin.

3.1. Chi Tiết Quy Trình Tổng Hợp Tạp Chất A Oxy Hóa Khử với KMnO4

Tạp A được tổng hợp thông qua phản ứng oxy hóa khử Amitriptylin sử dụng kali permanganat trong môi trường acid sulfuric. Sau phản ứng, sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột. Việc kiểm soát các điều kiện phản ứng như tỷ lệ mol, nhiệt độ và thời gian phản ứng rất quan trọng để đạt hiệu suất cao.

3.2. Quy Trình Tổng Hợp Tạp Chất B Dehydro Hóa với Dibutyl Maleat

Tạp B được tổng hợp bằng phản ứng dehydro hóa Amitriptylin với dibutyl maleat trong môi trường natri hydroxyd và xúc tác Pd/C. Sản phẩm sau phản ứng được tinh chế bằng phương pháp kết tinh trong isopropanol và sắc ký cột. Lựa chọn xúc tác và điều kiện phản ứng tối ưu là yếu tố then chốt để đạt hiệu suất tổng hợp tốt.

3.3. Xác Định Cấu Trúc Bằng Phổ Nghiệm NMR IR MS HPLC

Để xác định cấu trúc của tạp chất A và tạp chất B, các phương pháp phổ nghiệm như NMR, IR và MS được sử dụng. Độ tinh khiết của các tạp chất được xác định bằng phương pháp HPLC-PDA. Các kết quả phổ nghiệm và HPLC cần đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng để đảm bảo tính chính xác của chuẩn tạp chất.

IV. Ứng Dụng Kiểm Nghiệm Amitriptylin Theo Dược Điển BP 2022

Sau khi tổng hợp và thiết lập chuẩn, tạp chất A và tạp chất B được sử dụng để kiểm tra tạp chất trong một số mẫu nguyên liệu và thành phẩm Amitriptylin theo Dược điển Anh 2022 (BP 2022). Kết quả cho thấy một mẫu thành phẩm không đạt giới hạn cho phép. Điều này chứng minh tầm quan trọng của việc sử dụng chuẩn tạp chất để đảm bảo chất lượng thuốc.

4.1. So Sánh Kết Quả Kiểm Nghiệm Với Tiêu Chuẩn Dược Điển

Kết quả kiểm nghiệm tạp chất A và tạp chất B trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm Amitriptylin được so sánh với các tiêu chuẩn quy định trong Dược điển Anh 2022 (BP 2022). Việc không đạt giới hạn cho phép của một mẫu thành phẩm cho thấy sự cần thiết của việc kiểm soát chặt chẽ tạp chất trong quá trình sản xuất.

4.2. Đánh Giá Độ Tin Cậy Của Chuẩn Tạp Chất Tự Tổng Hợp

Quá trình kiểm nghiệm sử dụng chuẩn tạp chất tự tổng hợp giúp đánh giá độ tin cậy của chuẩn. Kết quả kiểm nghiệm phải phù hợp với các tiêu chuẩn chất lượng để chứng minh rằng chuẩn tạp chất có thể được sử dụng một cách đáng tin cậy trong công tác kiểm nghiệm.

V. Kết Luận Thành Công Tổng Hợp Thiết Lập Chuẩn Tạp Chất A B

Nghiên cứu đã thành công trong việc tổng hợp và thiết lập chuẩn tạp chất A và tạp chất B của Amitriptylin. Các tạp chất này đạt yêu cầu sử dụng trong kiểm tra tạp chất của Amitriptylin. Kết quả này góp phần giải quyết vấn đề thiếu chuẩn tạp chất chất lượng cao và có giá cả hợp lý, đồng thời giúp các đơn vị kiểm nghiệm chủ động hơn trong công tác kiểm soát chất lượng thuốc.

5.1. Ý Nghĩa Khoa Học Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học trong việc phát triển phương pháp tổng hợp và thiết lập chuẩn tạp chất. Ý nghĩa thực tiễn là giúp các đơn vị kiểm nghiệm chủ động hơn trong công tác kiểm soát chất lượng Amitriptylin, giảm sự phụ thuộc vào các nguồn cung cấp chuẩn tạp chất quốc tế.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Quy Trình

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tổng hợp để tăng hiệu suất và giảm chi phí. Nghiên cứu cũng có thể mở rộng sang việc tổng hợp và thiết lập chuẩn các tạp chất khác của Amitriptylin để có một bộ chuẩn tạp chất đầy đủ phục vụ cho công tác kiểm nghiệm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trầm cảm là một trong những bệnh lý phổ biến toàn cầu với hơn 264 triệu người bị ảnh hưởng tính đến năm 2017, gây ra gánh nặng lớn về sức khỏe cộng đồng. Tại Mỹ, tỷ lệ người trưởng thành mắc trầm cảm nghiêm trọng chiếm khoảng 7,1%, tương đương 17,3 triệu người. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) dự báo trầm cảm sẽ trở thành nguyên nhân hàng đầu gây gánh nặng bệnh tật vào năm 2030. Amitriptylin (AMT) là thuốc chống trầm cảm được sử dụng rộng rãi từ những năm 1960, có cơ chế tác dụng chính là ức chế tái hấp thu serotonin và noradrenalin, góp phần cải thiện hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, do thời gian điều trị kéo dài từ 3 tuần đến 3 tháng, việc kiểm soát chất lượng thuốc, đặc biệt là hàm lượng tạp chất liên quan, là rất cần thiết để đảm bảo an toàn và hiệu quả lâm sàng.

Theo Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) và Dược điển Anh 2022 (BP 2022), hai tạp chất chính của amitriptylin cần kiểm tra là tạp A (dibenzosuberon) và tạp B (cyclobenzaprin). Hiện tại, danh mục chất chuẩn quốc gia chưa có chuẩn đối chiếu cho hai tạp chất này, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm trong nước. Giá thành của chuẩn tạp chất nhập khẩu rất cao, ví dụ chuẩn tạp A có giá khoảng 79 euro cho 30 mg tại châu Âu và lên đến 903 USD cho 25 mg tại Mỹ. Do đó, việc tổng hợp và thiết lập chuẩn đối chiếu tạp A và tạp B trong nước là cấp thiết nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm, giảm chi phí và nâng cao chất lượng thuốc amitriptylin.

Mục tiêu nghiên cứu là tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu cho tạp A và tạp B của amitriptylin, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tổng hợp, đồng thời áp dụng chuẩn đối chiếu để kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm amitriptylin theo tiêu chuẩn BP 2022. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm tại Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn 2020-2022, góp phần nâng cao năng lực kiểm nghiệm thuốc trong nước và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết tổng hợp hóa học hữu cơ: Áp dụng phản ứng oxy hóa khử và phản ứng dehydro hóa để tổng hợp tạp chất từ amitriptylin. Phản ứng oxy hóa khử với kali permanganat trong môi trường acid sulfuric tạo tạp A (dibenzosuberon), trong khi phản ứng dehydro hóa với dibutyl maleat và xúc tác Pd/C trong môi trường kiềm tạo tạp B (cyclobenzaprin).

• Mô hình kiểm nghiệm chất lượng thuốc: Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò Photodiode Array (PDA) để xác định độ tinh khiết và hàm lượng tạp chất, đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn của Dược điển Anh 2022.

• Khái niệm chất đối chiếu (Reference Standard): Chất đối chiếu sơ cấp (PCRS) được thiết lập dựa trên sản phẩm tổng hợp có độ tinh khiết cao (>98%), được xác định cấu trúc bằng phổ MS, NMR, IR và UV, dùng làm chuẩn để kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm.

• Các khái niệm chính: Tạp chất liên quan (Impurity), hiệu suất tổng hợp, độ tinh khiết sắc ký, giới hạn cho phép tạp chất theo Dược điển, quy trình tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng nguyên liệu amitriptylin hydroclorid có hàm lượng 99,7% do Vasudha Pharma Chem Limited cung cấp, cùng các hóa chất và dung môi đạt độ tinh khiết cao phục vụ tổng hợp và phân tích.

• Phương pháp tổng hợp:

  • Tạp A: Tổng hợp bằng phản ứng oxy hóa khử amitriptylin với kali permanganat trong môi trường acid sulfuric 2 M, khuấy từ liên tục 45 phút ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm thô được chiết xuất bằng n-hexan và tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (30:1).
  • Tạp B: Tổng hợp bằng phản ứng dehydro hóa amitriptylin với dibutyl maleat, Pd/C xúc tác trong dung dịch NaOH 20% ở nhiệt độ 200-240 °C trong 3-8 giờ. Sản phẩm được tinh chế bằng kết tinh trong isopropanol và sắc ký cột với pha động n-hexan - ethyl acetat - triethylamin.

• Phương pháp phân tích:

  • Xác định cấu trúc sản phẩm bằng phổ MS-ESI, phổ NMR (^1H và ^13C), phổ IR và UV.
  • Đánh giá độ tinh khiết bằng HPLC-PDA với điều kiện sắc ký phù hợp, đảm bảo độ tinh khiết trên 98%.
  • Kiểm tra tạp chất A và B trong nguyên liệu và thành phẩm amitriptylin theo tiêu chuẩn BP 2022 sử dụng chuẩn đối chiếu đã thiết lập.

• Timeline nghiên cứu:

  • Giai đoạn 1 (6 tháng): Tổng hợp và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp tạp A và tạp B.
  • Giai đoạn 2 (6 tháng): Tinh chế, xác định cấu trúc và đánh giá độ tinh khiết sản phẩm.
  • Giai đoạn 3 (6 tháng): Thiết lập chuẩn đối chiếu, kiểm nghiệm tạp chất trong mẫu nguyên liệu và thành phẩm.
  • Giai đoạn 4 (6 tháng): Tổng hợp báo cáo, hoàn thiện luận văn.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng mẫu nguyên liệu và thành phẩm amitriptylin trên thị trường Việt Nam, lựa chọn ngẫu nhiên để kiểm tra tạp chất nhằm đánh giá thực trạng chất lượng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu suất tổng hợp tạp A và tạp B:

   • Tạp A được tổng hợp với hiệu suất toàn quy trình đạt 62,84%, thu được 2,87 g sản phẩm tinh khiết.
   • Tạp B có hiệu suất tương tự, đạt 62,68%, thu được 2,79 g sản phẩm tinh khiết.
     Hai kết quả này cho thấy quy trình tổng hợp ổn định và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm.

2. Độ tinh khiết sản phẩm:

   • Sản phẩm tinh chế tạp A và tạp B đều có độ tinh khiết trên 98% theo kết quả phân tích HPLC-PDA, đáp ứng yêu cầu làm chuẩn đối chiếu sơ cấp.
   • Phổ MS, NMR và IR xác nhận cấu trúc hóa học chính xác của hai tạp chất, đảm bảo tính đặc hiệu của chuẩn đối chiếu.

3. Kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm:

   • Sử dụng chuẩn đối chiếu đã thiết lập, kiểm nghiệm trên một số mẫu nguyên liệu và viên nén amitriptylin cho thấy tạp A và tạp B đều nằm trong giới hạn cho phép theo BP 2022, ngoại trừ một mẫu thành phẩm có tạp B vượt quá giới hạn 0,2%.
   • Kết quả này phản ánh sự cần thiết của việc kiểm soát chặt chẽ tạp chất trong quá trình sản xuất và bảo quản thuốc.

4. So sánh với các nghiên cứu quốc tế:

   • Hiệu suất tổng hợp và độ tinh khiết sản phẩm tương đương hoặc cao hơn so với các nghiên cứu trước đây trên thế giới.
   • Việc thiết lập chuẩn đối chiếu trong nước giúp giảm chi phí và thời gian nhập khẩu, đồng thời nâng cao năng lực kiểm nghiệm nội địa.

Thảo luận kết quả

Quy trình tổng hợp tạp A bằng phản ứng oxy hóa khử với kali permanganat trong môi trường acid sulfuric cho hiệu suất cao nhờ kiểm soát tốt tỷ lệ mol và thời gian phản ứng. Tạp B được tổng hợp qua phản ứng dehydro hóa với xúc tác Pd/C và dibutyl maleat, phản ứng diễn ra hiệu quả ở nhiệt độ cao, phù hợp với đặc tính hóa học của amitriptylin. Việc tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh giúp loại bỏ tạp chất phụ, nâng cao độ tinh khiết sản phẩm.

Kết quả kiểm nghiệm tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm cho thấy sự hiện diện của tạp B vượt giới hạn trong một mẫu thành phẩm cảnh báo về nguy cơ ảnh hưởng đến hiệu quả và an toàn thuốc. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng chuẩn đối chiếu chuẩn xác và quy trình kiểm nghiệm nghiêm ngặt.

So với các nghiên cứu quốc tế, nghiên cứu đã thành công trong việc phát triển quy trình tổng hợp và thiết lập chuẩn đối chiếu phù hợp với điều kiện trong nước, góp phần giảm phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu đắt đỏ. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hiệu suất tổng hợp và bảng so sánh độ tinh khiết sản phẩm, cũng như biểu đồ phân bố hàm lượng tạp chất trong các mẫu kiểm nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình tổng hợp và chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thường quy: Các phòng kiểm nghiệm thuốc trong nước nên áp dụng quy trình tổng hợp và chuẩn đối chiếu tạp A và tạp B đã thiết lập để nâng cao độ chính xác và tiết kiệm chi phí kiểm nghiệm.

2. Tăng cường kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm: Các nhà sản xuất thuốc cần thực hiện kiểm tra nghiêm ngặt hàm lượng tạp chất theo tiêu chuẩn BP 2022, đặc biệt chú ý đến tạp B để đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị.

3. Đào tạo và nâng cao năng lực nhân sự: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật tổng hợp, tinh chế và phân tích tạp chất cho cán bộ kiểm nghiệm nhằm nâng cao chất lượng công tác kiểm tra.

4. Phát triển nghiên cứu mở rộng: Khuyến khích nghiên cứu tiếp tục mở rộng tổng hợp và thiết lập chuẩn đối chiếu cho các tạp chất khác của amitriptylin và các thuốc chống trầm cảm khác nhằm hoàn thiện hệ thống kiểm soát chất lượng thuốc trong nước.

5. Thời gian thực hiện: Các giải pháp trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tới, phối hợp giữa các cơ sở đào tạo, viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà sản xuất dược phẩm: Nghiên cứu cung cấp quy trình tổng hợp chuẩn đối chiếu tạp chất giúp giảm chi phí nhập khẩu và nâng cao chất lượng sản phẩm.

2. Phòng kiểm nghiệm thuốc: Cung cấp phương pháp kiểm tra tạp chất chính xác, tin cậy, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế và trong nước.

3. Giảng viên và sinh viên ngành Dược học, Kiểm nghiệm thuốc: Là tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật tổng hợp, phân tích và thiết lập chuẩn đối chiếu trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc.

4. Cơ quan quản lý nhà nước về dược phẩm: Hỗ trợ xây dựng chính sách kiểm soát chất lượng thuốc, phát triển chuẩn đối chiếu nội địa, giảm phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần tổng hợp chuẩn đối chiếu tạp chất amitriptylin trong nước?
   Việc tổng hợp chuẩn đối chiếu giúp giảm chi phí nhập khẩu, rút ngắn thời gian kiểm nghiệm và nâng cao năng lực kiểm nghiệm nội địa, đảm bảo chất lượng thuốc an toàn cho người dùng.

2. Phương pháp tổng hợp tạp A và tạp B có phức tạp không?
   Quy trình tổng hợp sử dụng các phản ứng oxy hóa khử và dehydro hóa với điều kiện kiểm soát tốt, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm, không quá phức tạp và có thể nhân rộng.

3. Độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp đạt bao nhiêu?
   Sản phẩm tinh chế tạp A và tạp B đều đạt độ tinh khiết trên 98% theo phân tích HPLC-PDA, đủ điều kiện làm chuẩn đối chiếu sơ cấp.

4. Chuẩn đối chiếu này có thể sử dụng cho các loại thuốc amitriptylin khác không?
   Có, chuẩn đối chiếu được thiết lập theo tiêu chuẩn quốc tế, có thể áp dụng kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm amitriptylin đa dạng trên thị trường.

5. Nghiên cứu có thể giúp gì cho công tác quản lý chất lượng thuốc?
   Nghiên cứu cung cấp công cụ kiểm nghiệm chính xác, giúp phát hiện và kiểm soát tạp chất, từ đó nâng cao chất lượng thuốc, bảo vệ sức khỏe người bệnh và tuân thủ quy định của Bộ Y tế.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tổng hợp tạp chất A (dibenzosuberon) và tạp chất B (cyclobenzaprin) của amitriptylin với hiệu suất trên 62% và độ tinh khiết trên 98%.
• Chuẩn đối chiếu sơ cấp cho hai tạp chất được thiết lập, xác định cấu trúc bằng phổ MS, NMR, IR và UV, đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm theo BP 2022.
• Áp dụng chuẩn đối chiếu trong kiểm tra tạp chất cho thấy một số mẫu thành phẩm có tạp chất vượt giới hạn, cảnh báo về chất lượng sản phẩm.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao năng lực kiểm nghiệm thuốc trong nước, giảm chi phí nhập khẩu chuẩn đối chiếu và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
• Đề xuất triển khai áp dụng quy trình tổng hợp và chuẩn đối chiếu trong các phòng kiểm nghiệm, đồng thời tăng cường kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm trong 1-2 năm tới.

Luận văn mở ra hướng phát triển bền vững cho công tác kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam, khuyến khích các nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện hệ thống chuẩn đối chiếu và nâng cao chất lượng thuốc nội địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trầm cảm là một căn bệnh phổ biến trên toàn thế giới, với hơn 264 triệu người bị ảnh hưởng tính đến năm 2017. Gánh nặng của bệnh trầm cảm và các tình trạng sức khỏe tâm thần khác đang gia tăng trên toàn cầu 1. Tại Mỹ, có khoảng 17,3 triệu người trưởng thành đã có ít nhất một giai đoạn trầm cảm nghiêm trọng (chiếm tỷ lệ 7,1%) 2. Trầm cảm đã được WHO xếp hạng là nguyên nhân thứ ba gây ra gánh nặng bệnh tật trên toàn thế giới vào năm 2008, tổ chức này đã dự đoán rằng căn bệnh này sẽ đứng đầu vào năm 2030 3.

Hiện nay, đã và đang có rất nhiều loại thuốc trị trầm cảm được sử dụng với nhiều cơ chế tác dụng khác nhau: các chất ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin (SSRIs), các chất điều hòa serotonin (thuốc chẹn 5-HT2), thuốc ức chế tái hấp thu serotonin-norepinephrin, thuốc ức chế tái hấp thu norepinephrin- dopamin, thuốc chống trầm cảm dị vòng, chất ức chế monoamin oxidase (MAOI) và thuốc chống trầm cảm melatonergic. Trong số đó, amitriptylin (AMT) là một trong những thuốc chống trầm cảm đầu tiên được phát triển và đã được sử dụng rộng rãi để điều trị trầm cảm từ đầu những năm 1960. Ngay từ năm 1964, Lance và Curran đã báo cáo rằng amitriptylin có hiệu quả trong đau đầu kiểu căng thẳng độc lập với tác dụng chống trầm cảm và tác dụng tích cực trong chứng đau nửa đầu đã được báo cáo vào năm 1973 4,5. Cơ chế tác dụng của amitriptylin là ức chế tái hấp thu các monoamin (amin đơn), serotonin và noradrenalin ở các nơron monoaminergic (tế bào thần kinh amin đơn).

Tác dụng ức chế tái hấp thu noradrenalin và serotonin được coi là có liên quan đến tác dụng chống trầm cảm của thuốc. Amitriptylin cũng có tác dụng kháng cholinergic ở cả thần kinh trung ương và ngoại vi 6. Trong đa số các trường hợp, thời gian dùng thuốc ở bệnh nhân thường kéo dài (3 tuần – 3 tháng), vì vậy thuốc cần được kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt về hàm lượng dược chất và tạp chất liên quan, vì chỉ cần một sự thay đổi nhỏ về hàm lượng hoạt chất hoặc có tạp chất phát sinh có thể sẽ thay đổi hiệu quả lâm sàng và tính an toàn của thuốc. 2 Thông tư số 11/2018/TT-BYT ngày 04 tháng 05 năm 2018 quy định về chất lượng thuốc, nguyên liệu làm thuốc của Bộ Y tế, trong đó có quy định xử phạt đối với các thuốc không đạt chỉ tiêu tạp chất liên quan vì ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và tiềm ẩn nguy cơ không an toàn cho người bệnh 7.

Vấn đề chuẩn tạp chất được đặt ra ở hầu hết các công ty sản xuất và cả những đơn vị kiểm nghiệm. Chuẩn tạp hiện nay đa số rất đắt tiền, thời gian đặt hàng lâu nếu mua các chuẩn USP, BP gây không ít khó khăn cho công tác kiểm nghiệm. Theo Dược điển Anh 2022 (BP 2022) 8 và Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) 9 có 2 tạp chất liên quan trong nguyên liệu amitriptylin hydroclorid cần được kiểm tra là dibenzosuberon (tạp A) và cyclobenzaprin (tạp B). Trong khi đó theo Dược điển Mỹ 43 (USP 43) 10, tạp cần kiểm tra trong nguyên liệu là tạp A (dibenzosuberon), tạp B (còn gọi là tạp D theo BP 2022 và DĐVN V), nortriptylin và cyclobenzaprin (còn gọi là tạp B theo BP 2022 và DĐVN V).

Trong thành phẩm, tạp cần kiểm tra theo BP 2022 là tạp A và tạp B, theo USP 43 là tạp A, tạp B và nortriptylin. Giá thành của tạp chuẩn A và tạp chuẩn B hiện nay được công bố trên trang web của EP lần lượt là 79 euro/30 mg 11 và 79 euro/20 mg 12 trong khi đó trên trang web của USP giá thành của tạp chuẩn A là 903 USD/25 mg 13. Trên thế giới, cho đến nay có hai công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A 14,15 và hai công trình nghiên cứu tổng hợp tạp B 16,17. Tại Việt Nam chưa có tác giả nào công bố công trình tổng hợp tạp A và tạp B của amitriptylin.

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu A (dibenzosuberon) và B (cyclobenzaprin) của amitriptylin” được thực hiện để phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm tạp chất liên quan của amitriptylin, góp phần đáp ứng nhu cầu sử dụng tạp chuẩn ngày càng nhiều trong nước với các mục tiêu: - Tổng hợp tạp chất liên quan A/B và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ở quy mô phòng thí nghiệm. - Thiết lập chất đối chiếu 2 tạp đã tổng hợp. 3 - Kiểm nghiệm tạp A và B trong nguyên liệu và thành phẩm chứa Amitriptylin theo BP 2022, sử dụng tạp chất đối chiếu đã được thiết lập. Tổng quan về amitriptylin hydroclorid Theo IUPAC: 3-(10,11-Dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-yliden)-N,N- dimethylpropan-1-amin hydroclorid.

Tên khác: Amitriptylin hydroclorid. Công thức phân tử: C20H24ClN. Số CAS: 549-18-8 Phân tử lượng: 313,9 g/mol. Công thức cấu tạo: H Cl N Amitriptylin hydrochlorid Hình 1.

Công thức cấu tạo của amitriptylin hydroclorid. Tổng hợp Amitriptylin hydroclorid là hợp chất ở dạng bột kết tinh màu trắng ngà, không mùi, nhạy cảm với ánh sáng, dễ tan trong nước (độ tan 0,00971 g/l ở 24 oC), tan trong ethanol, nhiệt độ nóng chảy 195 – 199 oC và pKa = 9,4 18. Phương pháp tổng hợp Amitriptylin được tổng hợp từ dibenzosuberon bằng phản ứng Grignard. Phản ứng với cyclopropyl magnesi bromid Dibenzosuberon phản ứng với cyclopropyl magnesi bromid tạo thành 5- cyclopropyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ol; sản phẩm này tiếp tục phản ứng với HBr trong acid acetic làm mở vòng cyclopropyl, tạo thành 5-(3-.

5 bromopropyliden)-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]-cyclohepten. Alkyl hóa chất này với dimethyl amin tạo thành amitriptylin 19,20 được thể hiện trong sơ đồ 1. MgBr HBr/ CH3COOH + O HO CH CH2 CH2 Br dibenzosuberon CH3 HN CH3 N amitriptylin Sơ đồ 1. Phản ứng tổng hợp amitriptylin (AMT) từ dibenzosuberon và cyclopropyl magnesi bromid 19.

Phản ứng với 3-dimethylamino propyl magnesi clorid Dibenzosuberon phản ứng với 3-dimethylamino propyl magnesi clorid tạo thành alcol bậc 3, sau đó khử nước bằng HCl để tạo thành AMT 21, được thể hiện trong sơ đồ 1. HCl + Mg N HO Cl O N N dibenzosuberon amitriptylin Sơ đồ 1. Phản ứng tổng hợp AMT từ dibenzosuberon và 3-dimethylamino propyl magnesi clorid 21. Phản ứng với với allyl magnesi bromid Amitriptylin hydroclorid được tổng hợp từ cơ chất ban đầu là hợp chất dibenzosuberon và allyl magnesi bromid, tạo thành allyl carbinol.

Bằng cách đun hồi lưu dung dịch allyl carbinol trong cyclohexan với acid p-toluen sulfonic, sẽ tạo ra chất không bền 5-allyliden-5H-dibenzo-10,11-dihydrocyclohepten. Phản ứng dehydrat sản phẩm thu được với (3–methylbutan–2–yl) boran và sau đó là oxy hóa. 6 theo phương pháp của Zweifel, Kagase và Brown để tạo thành sản phẩm chính là alcol bậc 1. Chất này rất dễ phản ứng để tạo thành amitriptylin hydroclorid bằng thuốc thử dimethylamin trong benzen ở 85 oC 22 được thể hiện trong sơ đồ 1.

H+ + CH4 CH CH2 MgBr H2C OH CH CH O CH CH2 dibenzosuberon CH2 Cl 2.(CH3)2NH H Cl CHCH2CH2OH N amitriptylin hydrochlorid Sơ đồ 1. Phản ứng tổng hợp amitriptylin hydroclorid từ dibenzosuberon và allyl magnesi bromid 22 1. Định tính amitriptylin hydroclorid Bảng 1.1 trình bày các phương pháp định tính amitriptylin hydroclorid trong nguyên liệu theo DĐVN V và Dược điển tham chiếu, các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của amitriptylin hydroclorid được trình bày trong bảng 1.2 thể hiện phổ IR của amitriptylin hydroclorid. Định tính amitriptylin hydroclorid trong nguyên liệu theo DĐVN V và Dược điển tham chiếu Phương pháp DĐVN V 9, BP 2022 8 USP 43 10 IR So sánh phổ IR của mẫu thử với phổ IR của amitriptylin hydroclorid chuẩn.

Hóa học Phải cho phản ứng định tính của ion clorid. HPLC Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử khi định lượng tương đương với thời gian lưu của amitriptylin. 7 hydroclorid trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của amitriptylin hydroclorid 23 Nhóm chức  (cm-1) C-H (nhân thơm) 3057 CH3 2949, 2825 CH2 2921, 2852 C – N amin (bậc 3) liên kết với HCl 2545 – 2428 4 dao động biến dạng C – H kề nhau 767, 757 Hình 1.

Phổ IR của amitriptylin hydroclorid 23 Trong DĐVN V và Dược điển tham chiếu, thành phẩm chứa amitriptylin hydroclorid chỉ có chuyên luận về dạng bào chế viên nén.3 trình bày các phương pháp định tính amitriptylin hydroclorid trong thành phẩm viên nén theo DĐVN V và Dược điển tham chiếu. Định tính amitriptylin hydroclorid trong thành phẩm viên nén theo DĐVN V và Dược điển tham chiếu DĐVN V 9, USP 43 10 BP 2022 8 - Phương pháp UV: lắc một lượng bột viên đã nghiền Phương pháp IR: lắc mịn tương ứng với khoảng 10 mg amitriptylin một lượng bột viên có hydroclorid với 100 mL methanol, lọc và pha loãng 10 chứa 20 mg amitriptylin mL dịch lọc thành 100 mL với methanol. Phổ UV của hydroclorid với 10 mL dung dịch thu được phải phù hợp với phổ UV của aceton, lọc và làm bay dung dịch amitriptylin hydroclorid chuẩn có nồng độ hơi đến khô. Phổ IR của tương đương trong cùng dung môi.

cắn khô phải phù hợp - Phương pháp HPLC: thời gian lưu của pic chính với phổ IR của trên sắc ký đồ của dung dịch thử khi định lượng amitriptylin hydroclorid tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc chuẩn. ký đồ của dung dịch chuẩn. Định lượng amitriptylin hydroclorid 1. Trong nguyên liệu a.

Theo DĐVN V và BP 2022 Phương pháp chuẩn độ điện thế: hòa tan 0,250 g chế phẩm trong 30 mL ethanol 96%. Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N. Xác định điểm tương đương bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế. 1 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N tương đương với 31,39 mg C20H24ClN.

Theo USP 43 Phương pháp sắc ký lỏng - Dung dịch đệm phosphat: dung dịch dinatri hydrophosphat trong nước có nồng độ 1,4 g/L được điều chỉnh pH đến 7,7 bằng acid phosphoric 1,5 M. - Pha động: methanol - dung dịch đệm phosphat (70:30). - Dung dịch gốc A: dung dịch tạp A chuẩn trong methanol có nồng độ 1 mg/mL. 9 - Dung dịch gốc B: dung dịch chuẩn được chuẩn bị trong pha động có nồng độ amitriptylin hydroclorid 0,4 mg/mL, tạp B, cyclobenzaprin hydroclorid và nortriptylin hydroclorid đều có cùng nồng độ 0,6 mg/mL.

- Dung dịch chuẩn: dung dịch amitriptylin hydroclorid trong pha động có nồng độ 0,2 mg/mL. - Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: là dung dịch được chuẩn bị từ dung dịch gốc A, dung dịch gốc B và pha động để có nồng độ tạp A 0,5 µg/mL, amitriptylin hydroclorid 1,0 µg/mL, tạp B, cyclobenzaprin hydroclorid và nortriptylin hydroclorid đều có cùng nồng độ 1,5 µg/mL. - Dung dịch thử: dung dịch có nồng độ amitriptylin trong pha động 0,2 mg/mL. - Điều kiện sắc ký: cột C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm), nhiệt độ cột 45 ºC, đầu dò UV đặt ở bước sóng 215 nm, tốc độ dòng 1,5 mL/phút, thể tích tiêm 20 L.