Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học với đề tài "Tổng hợp một số dẫn xuất của 3-aminocoumarin" được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Hồ Bảo Tuyên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Tiến Công tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (khóa 2009–2013, bảo vệ tháng 5 năm 2013).

Trong hóa học hữu cơ, các hợp chất dị vòng đóng vai trò quan trọng đối với y dược, nông nghiệp và kỹ thuật vật liệu. Coumarin (2H-chromen-2-one) là một loại dị vòng benzopyrone được phát hiện từ năm 1820 trong hạt của cây Dipteryx odorata Willd (tên địa phương là "coumarou"). Trong tự nhiên, coumarin tồn tại rộng rãi trong nhiều loài thực vật như Cỏ mực, Ba dẹt, Mần tưới, Bạch chỉ, Tiền hồ, Ammi visnaga, Sài đất, Mù u, Hoàng kỳ, Cúc La Mã, Quế. Các dẫn xuất của coumarin thể hiện nhiều hoạt tính sinh học giá trị như kháng khuẩn, chống đái tháo đường, hạ sốt, chống đông máu, chống xơ vữa động mạch và chống oxy hóa. Đặc biệt, các dẫn xuất N-thế của 3-aminocoumarin được ghi nhận có khả năng kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của côn trùng, chống dị ứng, tác động lên hệ thần kinh trung ương và kháng tế bào ung thư. Kháng sinh tự nhiên Novobiocin (phân lập từ các loài Streptomyces) chứa gốc 3-amino-4-hydroxycoumarin là chất ức chế enzyme DNA gyrase đã được cấp phép tại Hoa Kỳ để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus. Ngoài ra, khung 3-aminocoumarin N-thế còn có tính chất quang hóa, được sử dụng trong đánh dấu huỳnh quang cho amino acid và peptide. Xuất phát từ giá trị thực tiễn đó, tác giả lựa chọn nghiên cứu quy trình tổng hợp và khảo sát cấu trúc các dẫn xuất mới từ 3-aminocoumarin.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được tác giả xác định theo các nội dung cụ thể:

  1. Tổng hợp hợp chất trung gian then chốt 3-aminocoumarin từ các hóa chất ban đầu qua chuỗi phản ứng ngưng tụ và thủy phân.
  2. Tổng hợp 3 dẫn xuất N-thế của 3-aminocoumarin bao gồm:
    • Dẫn xuất thiourea: 1-(Coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea;
    • Dẫn xuất carbamate: Ethyl (coumarin-3-yl)carbamate;
    • Dẫn xuất amide: N-(Coumarin-3-yl)pivalamide.
  3. Khảo sát các tính chất vật lý của các chất tổng hợp được (trạng thái tồn tại, nhiệt độ nóng chảy, màu sắc, lựa chọn dung môi kết tinh lại).
  4. Nghiên cứu xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất tổng hợp bằng các phương pháp phổ học hiện đại (IR, $^{1}\text{H-NMR}$, HR-MS).
  5. Thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn xuất tổng hợp được trên 2 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Escherichia coli và Bacillus subtilis.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Khung dị vòng 3-aminocoumarin và ba dẫn xuất thế nhóm amino gồm 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea, ethyl (coumarin-3-yl)carbamate, N-(coumarin-3-yl)pivalamide, cùng hai tiền chất trung gian acetylglycine và 3-acetylaminocoumarin.
  • Phạm vi không gian và địa điểm thực hiện: Thực nghiệm tổng hợp, đo nhiệt độ nóng chảy và đo phổ hồng ngoại được tiến hành tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh; phổ $^{1}\text{H-NMR}$ được đo tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; phổ khối lượng phân giải cao HR-MS được đo tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh; thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài hoàn thành trong giai đoạn năm học 2012–2013 và nghiệm thu vào tháng 5 năm 2013.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phản ứng hóa học sử dụng

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về hóa học các hợp chất dị vòng chứa oxy và nitơ, trọng tâm là khung benzo-$\alpha$-pyrone (coumarin). Phân tích nhiễu xạ tia X cho thấy phân tử coumarin có cấu tạo phẳng. Trong phần tổng quan, tác giả hệ thống hóa các phản ứng kinh điển để xây dựng vòng coumarin:

  • Phản ứng Perkin: Ngưng tụ aldol giữa ortho-hydroxybenzaldehyde (salicylaldehyde) với anhydride acetic có mặt xúc tác natri acetate.
  • Phản ứng Knoevenagel (hoặc biến thể Doebbner sử dụng pyridine hoặc acid malonic): Ngưng tụ giữa aldehyde với hợp chất chứa methylene hoạt động có xúc tác base hoặc acid Lewis.
  • Phản ứng Wittig: Phản ứng giữa hợp chất carbonyl với phosphonium ylide tạo alkene trung gian trước khi đóng vòng nội phân tử.
  • Phản ứng Reformatsky: Ngưng tụ giữa aldehyde/ketone với $\alpha$-halo ester có mặt xúc tác kẽm để tạo $\beta$-hydroxy ester rồi đóng vòng.
  • Phản ứng Kostanecki - Robinson: Acyl hóa các ortho-hydroxyaryl ketone với anhydride acid béo kết hợp đóng vòng nội phân tử.
  • Phản ứng Pechmann (Pechmann - Duisberg): Ngưng tụ giữa phenol với $\beta$-ketoester trong môi trường acid.
  • Phản ứng Ponndorf: Phản ứng giữa phenol hoặc aryl halide với alkyne ở nhiệt độ phòng kết hợp đóng vòng nội phân tử.

Để tổng hợp dẫn xuất của 3-aminocoumarin, tác giả vận dụng các nghiên cứu chuyển hóa của Muhammed Abd Khadom (tạo base Schiff rồi ngưng tụ với 4-hydroxycoumarin) và M. El-Kady (phản ứng giữa 3-aminocoumarin với benzoyl isothiocyanate tạo dẫn xuất thiourea).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và trang thiết bị

  1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ: Tiến hành các phản ứng ngưng tụ nhiệt độ cao, đun hồi lưu, phản ứng cộng nucleophile vào nhóm carbonyl hoặc isothiocyanate trong dung môi khan hoặc hệ phân cực, tách chất kết tủa và kết tinh lại làm sạch sản phẩm.
  2. Phương pháp xác định nhiệt độ nóng chảy: Sử dụng máy đo điểm nóng chảy SMP3 tại phòng thực hành Hóa đại cương, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.
  3. Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR): Đo trên máy quang phổ Shimadzu FTIR-8400S bằng phương pháp ép viên với kali bromide (KBr) trong dải tần số $4000\text{--}400\text{ cm}^{-1}$.
  4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^{1}\text{H-NMR}$): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz, sử dụng dung môi dimethyl sulfoxide deuteri hóa ($\text{DMSO-}d_6$), xác định độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm), độ bội tín hiệu và hằng số tương tác spin-spin ($J$, Hz).
  5. Phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS): Đo trên thiết bị Bruker micrOTOF-Q 10187 bằng phương pháp ion hóa phun mù điện tử (HR-ESI-MS) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
  6. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học: Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường thạch MPA (thành phần gồm 5 g cao thịt, 5 g peptone, 5 g natri clorua khan, 20 g agar và 1000 ml nước cất, hấp tiệt trùng trong nồi áp suất). Hai chủng vi khuẩn thử nghiệm là vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis. Hóa chất khảo sát được thử ở các nồng độ 1% và 2% (thể tích tra giếng 0,1 ml), ủ lạnh 4–8 giờ rồi ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ, sau đó đo đường kính vòng kháng khuẩn $D - d$ (mm), trong đó $D$ là đường kính vòng vô khuẩn của dung dịch mẫu và $d$ là đường kính vô khuẩn của dung môi đối chứng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I gồm 4 nội dung lớn:

  1. Khái quát về coumarin: Trình bày lịch sử phát hiện coumarin từ hạt cây Dipteryx odorata Willd năm 1820, phân biệt benzo-$\alpha$-pyrone (coumarin) và benzo-$\gamma$-pyrone (chromone), cấu trúc không gian phẳng, độ dài liên kết phân tích qua tia X, tính chất vật lý (kết tinh không màu, dễ thăng hoa, có mùi thơm; dạng glycosid tan trong nước, dạng aglycon tan trong dung môi kém phân cực) và sự phân bố trong các loài thảo mộc.
  2. Một số phương pháp tổng hợp coumarin: Phân tích cơ chế và điều kiện của các phản ứng Perkin, Knoevenagel, Wittig, Reformatsky, Kostanecki - Robinson, Pechmann và Ponndorf.
  3. Ứng dụng của coumarin: Liệt kê các nhóm độc tố nấm aflatoxin ($B_1, B_2, G_1, G_2, M_1, M_2$ sinh ra từ Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus) chứa khung coumarin; nhóm kháng sinh novobiocin, coumermycin A1, clorobiocin ức chế DNA gyrase; các sắc tố urolithin-A, urolithin-B, alternariol. Tổng hợp bảng hoạt tính sinh học (chống đái tháo đường, hạ sốt, ức chế sinh tổng hợp leukotriene điều trị đau thắt ngực, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống dị ứng, đầu dò chẩn đoán tinh bột, giảm đau, kháng khuẩn, chống đông máu, chống lão hóa làm trắng da) và bảng ứng dụng quang học (sắc ký lỏng áp suất cao, đánh dấu mạch thần kinh bằng GABA, đánh dấu huỳnh quang amino acid và dipeptide).
  4. Một số phản ứng chuyển hóa của 3-aminocoumarin: Tổng thuật các công trình của Muhammed Abd Khadom về tổng hợp base Schiff và dẫn xuất với 4-hydroxycoumarin có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, nấm Aspergillus niger, Penicillium italicum, Fusarium oxysporum (đối chứng kháng sinh Amoxicillin và Mycostatin); công trình của M. El-Kady về phản ứng với benzoyl isothiocyanate tạo 3-(3'-coumarinyl)-N-benzoylthiourea và các dị vòng ngưng tụ.

Chương II: Thực nghiệm

Chương II mô tả chi tiết phương trình phản ứng, hóa chất và cách tiến hành tổng hợp từng hợp chất:

  • Tổng hợp acetylglycine (1): Phản ứng giữa 5,0 g (0,06 mol) glycine hòa tan trong 75 ml nước với 14,5 g (0,14 mol) anhydride acetic. Khuấy 20 phút ở nhiệt độ thường, để tủ lạnh 24 giờ. Lọc kết tủa, rửa nước lạnh, sấy khô thu chất rắn màu trắng, dùng trực tiếp cho bước sau mà không cần tinh chế thêm.
  • Tổng hợp 3-acetylaminocoumarin (2): Đun hồi lưu hỗn hợp 5,0 g (0,043 mol) acetylglycine, 12,2 g (0,1 mol) salicylaldehyde và 5,0 ml (0,049 mol) anhydride acetic cùng vài giọt piperidine ($d = 0,862\text{ g/cm}^3$) trong 6 giờ. Để nguội, thêm 10 ml nước, đun tiếp 30 phút. Lọc chất rắn, rửa bằng diethyl ether, để bay hơi rồi kết tinh lại trong ethanol. Thu được tinh thể hình kim màu cam, nhiệt độ nóng chảy $200\text{--}203^\circ\text{C}$, hiệu suất đạt 50,72%.
  • Tổng hợp 3-aminocoumarin (3): Hòa tan 5,0 g (0,024 mol) 3-acetylaminocoumarin trong 25 ml ethanol nóng, thêm 5,0 ml acid chlohydric đặc, đun hồi lưu 2 giờ. Để nguội, thêm nước, trung hòa bằng natri hydrocarbonat ($\text{NaHCO}_3$), làm lạnh, lọc lấy chất rắn và kết tinh lại trong ethanol. Thu được tinh thể hình kim màu trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy $127^\circ\text{C}$, hiệu suất đạt 55%.
  • Tổng hợp 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4): Hòa tan 1,16 g (0,01 mol) 3-aminocoumarin trong ethanol, thêm 1,35 g (0,01 mol) phenyl isothiocyanate, đun cách thủy 4 giờ. Để nguội, lọc chất rắn, kết tinh lại trong hệ dung môi dioxane : ethanol. Thu được tinh thể hình kim màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy $124,1\text{--}124,4^\circ\text{C}$, hiệu suất đạt 33,4%.
  • Tổng hợp ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a): Nhỏ từ từ dung dịch lạnh chứa 0,543 g (0,005 mol) ethyl carbonochloridate trong 5 ml dioxan vào dung dịch lạnh chứa 0,805 g (0,005 mol) 3-aminocoumarin và 0,41 g (0,005 mol) natri acetate khan trong 10 ml dioxan. Lắc 1 giờ ở nhiệt độ thường rồi đun ở $70\text{--}80^\circ\text{C}$ trong 1 giờ. Để nguội, đổ vào 100 ml nước đá vụn, lọc kết tủa, kết tinh lại trong hệ ethanol : nước. Thu được chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $156,4\text{--}157^\circ\text{C}$, hiệu suất đạt 74,5%.
  • Tổng hợp N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b): Nhỏ từ từ dung dịch lạnh chứa 0,603 g (0,005 mol) tác nhân acyl chloride (isobutyl chloride / pivaloyl chloride) trong 5,0 ml dioxan vào dung dịch lạnh chứa 0,805 g (0,005 mol) 3-aminocoumarin và 0,41 g (0,005 mol) natri acetate khan trong 10 ml dioxan. Lắc 1 giờ ở nhiệt độ thường, đun ở $70\text{--}80^\circ\text{C}$ trong 1 giờ, đổ vào 100 ml nước đá vụn, lọc kết tủa, kết tinh lại trong hệ ethanol : nước. Thu được chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $124,1\text{--}124,4^\circ\text{C}$, hiệu suất đạt 40,89%.
  • Quy trình thử nghiệm vi sinh và đo phổ cấu trúc: Trình bày thông số môi trường thạch MPA, thiết bị đo điểm chảy SMP3, máy FTIR Shimadzu, máy cộng hưởng từ Bruker Avance 500 MHz và máy khối phổ Bruker micrOTOF-Q 10187.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Tác giả giải thích chi tiết cơ chế phản ứng và biện luận phổ của từng hợp chất:

  • Cơ chế tạo acetylglycine (1): Tấn công nucleophile của nguyên tử nitơ trên phân tử glycine vào carbon carbonyl của anhydride acetic, sau đó tách loại phân tử $\text{CH}_3\text{COOH}$.
  • Cơ chế tạo 3-acetylaminocoumarin (2): Cặp electron tự do trên nguyên tử oxy phenol của salicylaldehyde tấn công nucleophile vào carbonyl của acetylglycine, tách loại một phân tử $\text{H}_2\text{O}$ tạo chất trung gian. Tiếp theo, xúc tác base piperidine tách proton từ nhóm methylene linh động tạo carbanion; carbanion tấn công nội phân tử vào carbon carbonyl để khép vòng coumarin rồi tách nước.
    • Phổ IR của (2): $3331\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{N-H}}$), $1709\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{C=O lacton}}$), $1682\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{C=O amide}}$).
    • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ của (2) (9 proton): $\delta = 2,17\text{ ppm}$ (s, 3H, $\text{H}^{10}$, $-\text{CH}_3$); $9,76\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^9$, $-\text{NH}-$); $8,61\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^4$); vùng thơm: $7,33\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^6$, $^3J_1 = ^3J_2 = 7,5\text{ Hz}$); $7,39\text{ ppm}$ (d, 1H, $\text{H}^8$, $^3J = 8,0\text{ Hz}$); $7,50\text{ ppm}$ (ddd, 1H, $\text{H}^7$, $^3J_1 = 7,5\text{ Hz}$, $^3J_2 = 8,0\text{ Hz}$, $^4J = 1,0\text{ Hz}$); $7,70\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^5$, $^3J = 7,5\text{ Hz}$, $^4J = 1,0\text{ Hz}$).
  • Cơ chế thủy phân tạo 3-aminocoumarin (3): Quá trình thủy phân liên kết amide trong môi trường acid xảy ra qua 5 giai đoạn: (1) proton hóa oxy carbonyl; (2) nước tấn công nucleophile vào carbon carbonyl; (3) chuyển vị proton giữa oxy và nitơ; (4) phân cắt liên kết $\text{C-N}$ giải phóng amine; (5) amine nhận proton tạo cation $\text{NH}_3^+$ bền vững, sau đó được trung hòa bằng base giải phóng nhóm amin tự do.
    • Phổ IR của (3): Xuất hiện hai pic hấp thụ ở $3428\text{ cm}^{-1}$ và $3329\text{ cm}^{-1}$ đặc trưng cho dao động hóa trị đối xứng và bất đối xứng của liên kết $\text{N-H}$ trong nhóm $-\text{NH}2$; pic hấp thụ ở $1709\text{ cm}^{-1}$ ($\nu{\text{C=O lacton}}$).
    • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ của (3) (7 proton): $\delta = 5,70\text{ ppm}$ (s, 2H, $\text{H}^9$, $-\text{NH}_2$); $6,71\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^4$); $7,21\text{ ppm}$ (m, 2H, $\text{H}^6, \text{H}^7$); $7,27\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^8$, $^3J = 8,5\text{ Hz}$, $^4J = 2,0\text{ Hz}$); $7,41\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^5$, $^3J = 7,0\text{ Hz}$, $^4J = 2,0\text{ Hz}$). Tín hiệu của proton $\text{H}^4$ dịch chuyển mạnh về phía trường cao ($\delta = 6,71\text{ ppm}$ so với $8,61\text{ ppm}$ ở chất 2) do hiệu ứng đẩy electron cộng hưởng ($+R$) mạnh của nhóm $-\text{NH}_2$ không còn bị phân tán sang nhóm acetyl carbonyl kế cận.
  • Phản ứng tạo 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4): Cơ chế cộng nucleophile của nhóm $-\text{NH}_2$ vào nguyên tử carbon mang điện tích dương của phenyl isothiocyanate, kèm theo sự chuyển vị proton.
    • Phổ IR của (4): $3335\text{ cm}^{-1}$ và $3308\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{N-H}}$); $1686\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{C=O lacton}}$); $1636\text{ cm}^{-1}$ và $1584\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{C=C thơm}}$); $3061\text{ cm}^{-1}$ ($\nu_{\text{C-H thơm}}$).
    • Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ của (4) (12 proton): $\delta = 10,60\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^9$); $9,60\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^{10}$); $9,14\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^4$); $7,20\text{ ppm}$ (t, 1H, $\text{H}^{13}$, $^3J = 7,5\text{ Hz}$); $7,39\text{ ppm}$ (m, 4H, $\text{H}^6, \text{H}^8, \text{H}^{11}, \text{H}^{15}$); $7,54\text{ ppm}$ (m, 3H, $\text{H}^7, \text{H}^{12}, \text{H}^{14}$); $7,72\text{ ppm}$ (d, 1H, $\text{H}^5$, $^3J = 8,0\text{ Hz}$).
  • Phản ứng tạo dẫn xuất carbonamide (5a, 5b): Cơ chế cộng nucleophile hai giai đoạn của nhóm amin vào dẫn xuất carbonyl chloride (giai đoạn chậm quyết định tốc độ) kèm theo sự tách ion chloride và proton.
    • Hợp chất 5a (ethyl carbamate): Phổ IR có $\nu_{\text{N-H}} > 3300\text{ cm}^{-1}$, hai pic $\text{C=O}$ dịch chuyển về tần số cao ở $1725\text{ cm}^{-1}$ và $1712\text{ cm}^{-1}$ do hiệu ứng hút electron của nhóm $-\text{OC}_2\text{H}5$, pic $\nu{\text{C(sp3)-H}}$ ở $2850\text{--}2950\text{ cm}^{-1}$. Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ (11 proton): $\delta = 1,25\text{ ppm}$ (t, 3H, $\text{H}^{11}$, $-\text{CH}3$, $^3J = 7,2\text{ Hz}$); $4,17\text{ ppm}$ (q, 2H, $\text{H}^{10}$, $-\text{CH}2-$, $^3J = 7,2\text{ Hz}$); $8,23\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^4$); $8,98\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^9$, $-\text{NH}-$); $7,33\text{ ppm}$ (ddd, 1H, $\text{H}^6$, $^3J_1 = 7,5\text{ Hz}$, $^3J_2 = 8,0\text{ Hz}$, $^4J = 1,2\text{ Hz}$); $7,38\text{ ppm}$ (d, 1H, $\text{H}^8$, $^3J = 8,0\text{ Hz}$); $7,49\text{ ppm}$ (ddd, 1H, $\text{H}^7$, $^3J_1 = ^3J_2 = 8,0\text{ Hz}$, $^4J = 1,5\text{ Hz}$); $7,69\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^5$, $^3J = 7,5\text{ Hz}$, $^4J = 1,5\text{ Hz}$). Phổ HR-MS của 5a ($\text{C}{12}\text{H}{11}\text{NO}_4$, $M = 233,0688$) cho pic ion phân tử $[\text{M}+\text{H}]^+$ ở $m/z = 234$ cùng các pic đồng vị tương ứng.
    • Hợp chất 5b (pivalamide): Phổ $^{1}\text{H-NMR}$ (15 proton): $\delta = 1,25\text{ ppm}$ (s, 9H, $\text{H}^{10}$, $-\text{C}(\text{CH}_3)_3$); $8,51\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^4$); $8,62\text{ ppm}$ (s, 1H, $\text{H}^9$, $-\text{NH}-$); $7,36\text{ ppm}$ (ddd, 1H, $\text{H}^6$, $^3J_1 = ^3J_2 = 7,5\text{ Hz}$, $^4J = 1,0\text{ Hz}$); $7,42\text{ ppm}$ (d, 1H, $\text{H}^8$, $^3J = 8,5\text{ Hz}$); $7,52\text{ ppm}$ (ddd, 1H, $\text{H}^7$, $^3J_1 = 7,5\text{ Hz}$, $^3J_2 = 8,0\text{ Hz}$, $^4J = 1,5\text{ Hz}$); $7,72\text{ ppm}$ (dd, 1H, $\text{H}^5$, $^3J = 8,0\text{ Hz}$, $^4J = 1,5\text{ Hz}$).

Bảng tổng hợp tính chất vật lý và phổ IR của các hợp chất

Hợp chất Màu sắc, trạng thái Nhiệt độ nóng chảy ($^\circ\text{C}$) Hiệu suất phản ứng (%) Các dải hấp thụ tiêu biểu trên phổ IR ($\text{cm}^{-1}$)
(2) 3-Acetylaminocoumarin Tinh thể hình kim màu cam 200–203 50,72 3331 ($\nu_{\text{N-H}}$); 1709 ($\nu_{\text{C=O lacton}}$); 1682 ($\nu_{\text{C=O amide}}$)
(3) 3-Aminocoumarin Tinh thể hình kim màu trắng ngà 127 55,00 3428, 3329 ($\nu_{\text{N-H}}$); 1709 ($\nu_{\text{C=O lacton}}$)
(4) 1-(Coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea Tinh thể hình kim màu vàng nhạt 124,1–124,4 33,40 3335, 3308 ($\nu_{\text{N-H}}$); 1686 ($\nu_{\text{C=O lacton}}$); 1636, 1584 ($\nu_{\text{C=C thơm}}$)
(5a) Ethyl (coumarin-3-yl)carbamate Chất rắn màu trắng 156,4–157,0 74,50 >3300 ($\nu_{\text{N-H}}$); 1725, 1712 ($\nu_{\text{C=O}}$); 2850–2950 ($\nu_{\text{C-H}}$)
(5b) N-(Coumarin-3-yl)pivalamide Chất rắn màu trắng 124,1–124,4 40,89 >3300 ($\nu_{\text{N-H}}$); 2850–2950 ($\nu_{\text{C-H}}$)

Bảng quy kết tín hiệu phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($\delta$, ppm; $J$, Hz; trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$)

Proton vị trí Hợp chất (2) Hợp chất (3) Hợp chất (4) Hợp chất (5a) Hợp chất (5b)
$\text{H}^4$ 8,61 (1H, s) 6,71 (1H, s) 9,14 (1H, s) 8,23 (1H, s) 8,51 (1H, s)
$\text{H}^5$ 7,70 (1H, dd, $J=7,5; 1,0$) 7,41 (1H, dd, $J=7,0; 2,0$) 7,72 (1H, d, $J=8,0$) 7,69 (1H, dd, $J=7,5; 1,5$) 7,72 (1H, dd, $J=8,0; 1,5$)
$\text{H}^6$ 7,33 (1H, dd, $J=7,5; 7,5$) 7,21 (2H, m, $\text{H}^6+\text{H}^7$) 7,39 (4H, m) 7,33 (1H, ddd, $J=7,5; 8,0; 1,2$) 7,36 (1H, ddd, $J=7,5; 7,5; 1,0$)
$\text{H}^7$ 7,50 (1H, ddd, $J=7,5; 8,0; 1,0$) 7,21 (2H, m, $\text{H}^6+\text{H}^7$) 7,54 (3H, m) 7,49 (1H, ddd, $J=8,0; 8,0; 1,5$) 7,52 (1H, ddd, $J=7,5; 8,0; 1,5$)
$\text{H}^8$ 7,39 (1H, d, $J=8,0$) 7,27 (1H, dd, $J=8,5; 2,0$) 7,39 (4H, m) 7,38 (1H, d, $J=8,0$) 7,42 (1H, d, $J=8,5$)
Nhóm $-\text{NH}-$ 9,76 (1H, s) 5,70 (2H, s, $-\text{NH}_2$) 10,60 (1H, s); 9,60 (1H, s) 8,98 (1H, s) 8,62 (1H, s)
Nhánh thế 2,17 (3H, s, $-\text{CH}_3$) — Vòng phenyl: 7,20; 7,39; 7,54 4,17 (2H, q); 1,25 (3H, t) 1,25 (9H, s, tert-butyl)

Chương IV: Kết luận và đề xuất

Tác giả tổng kết các kết quả đạt được về tổng hợp, độ tinh khiết và cấu trúc các chất; đồng thời đề xuất tiếp tục nghiên cứu cải tiến quy trình nhằm nâng cao hiệu suất, mở rộng khảo sát hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn đối với nhiều chủng vi sinh vật khác.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Đã xây dựng quy trình thực nghiệm và tổng hợp thành công hợp chất trung gian then chốt 3-aminocoumarin (3) từ glycine và salicylaldehyde qua trung gian acetylglycine (1) và 3-acetylaminocoumarin (2) với hiệu suất phản ứng tạo (2) đạt 50,72% ($t^\circ_{\text{nc}} = 200\text{--}203^\circ\text{C}$) và hiệu suất thủy phân tạo (3) đạt 55% ($t^\circ_{\text{nc}} = 127^\circ\text{C}$).
  2. Đã tổng hợp thành công 3 dẫn xuất chứa dị vòng coumarin thế tại nhóm amino:
    • Dẫn xuất thiourea 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) đạt hiệu suất 33,4% ($t^\circ_{\text{nc}} = 124,1\text{--}124,4^\circ\text{C}$).
    • Dẫn xuất carbamate ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) đạt hiệu suất 74,5% ($t^\circ_{\text{nc}} = 156,4\text{--}157^\circ\text{C}$).
    • Dẫn xuất carbonamide N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b) đạt hiệu suất 40,89% ($t^\circ_{\text{nc}} = 124,1\text{--}124,4^\circ\text{C}$).
  3. Đã xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của các sản phẩm thông qua phổ IR, phổ $^{1}\text{H-NMR}$ (500 MHz) với việc quy kết tường minh từng proton, phân tích hằng số tương tác $J$ và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS cho hợp chất đại diện (5a) với giá trị $m/z = 234$ tương ứng pic $[\text{M}+\text{H}]^+$ của công thức phân tử $\text{C}{12}\text{H}{11}\text{NO}_4$.
  4. Đã thiết lập quy trình khảo sát hoạt tính sinh học trên môi trường thạch MPA đối với hai chủng chỉ thị vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và Gram âm Escherichia coli.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Cải tiến quy trình tổng hợp, khảo sát tối ưu hóa các thông số kỹ thuật (thời gian, tỷ lệ mol tác nhân, xúc tác và dung môi phản ứng) để nâng cao hiệu suất tổng hợp của các dẫn xuất (4) và (5b).
  • Mở rộng tổng hợp thêm các dẫn xuất N-thế mới khác của 3-aminocoumarin.
  • Tiếp tục mở rộng thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các chủng vi khuẩn Gram âm, Gram dương khác và các chủng vi nấm gây bệnh.

Đóng góp của đề tài

Tác giả đã hoàn thiện một quy trình tổng hợp ổn định từ các tiền chất hữu cơ thông dụng để thu nhận 3-aminocoumarin và các dẫn xuất amide, carbamate, thiourea. Công trình cung cấp bộ dữ liệu phổ nghiệm đầy đủ, chi tiết (gồm nhiệt độ nóng chảy, các vân phổ IR, độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin-spin trên phổ $^{1}\text{H-NMR}$ 500 MHz, cùng khối phổ phân giải cao HR-MS), đóng góp số liệu tham chiếu cho các nghiên cứu hóa học dị vòng coumarin.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Hiệu suất tổng hợp ở một số phản ứng còn ở mức trung bình hoặc thấp: phản ứng tổng hợp dẫn xuất thiourea (4) chỉ đạt 33,4% và dẫn xuất pivalamide (5b) đạt 40,89%.
  • Dữ liệu phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) trong văn bản mới chỉ thực hiện trên một hợp chất đại diện là ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a), chưa tiến hành đồng bộ trên tất cả các dẫn xuất còn lại.
  • Trên phổ $^{1}\text{H-NMR}$, tín hiệu của một số proton thơm (như proton $\text{H}^8$ của các hợp chất 5a và 5b) trên thực tế chỉ ghi nhận được dạng doublet thay vì doublet-doublet như phân tích lý thuyết, được tác giả giải thích là do độ phân giải của thiết bị đo chưa đủ lớn để tách hoàn toàn các tương tác spin tầm xa.
  • Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ dừng lại ở bước khảo sát thăm dò định tính/bán định lượng (đo đường kính vòng ức chế $D - d$) trên 2 chủng vi khuẩn chuẩn ở hai mức nồng độ (1% và 2%), chưa xác định được giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và chưa đánh giá độc tính tế bào.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng acyl hóa và thiocarbamoyl hóa để nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm.
  • Bổ sung phân tích phổ khối lượng HR-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ($^{13}\text{C-NMR}$) cho toàn bộ các hợp chất đã tổng hợp.
  • Mở rộng phổ sàng lọc hoạt tính sinh học sang các chủng nấm bệnh (Candida albicans, Aspergillus niger), thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư trên các dòng tế bào ung thư invitro theo định hướng phát triển kháng sinh nhóm novobiocin.
  • Khảo sát các đặc tính quang hóa và huỳnh quang của các dẫn xuất 3-aminocoumarin tổng hợp được để đánh giá khả năng ứng dụng làm chất đánh dấu huỳnh quang.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này mang lại giá trị tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Sư phạm Hóa học: Tài liệu cung cấp quy trình thực hành chi tiết từ lượng cân hóa chất, thể tích dung môi, nhiệt độ phản ứng, thời gian hồi lưu đến kỹ thuật kết tinh lại các hợp chất dị vòng rắn.
  • Người làm nghiên cứu về dị vòng coumarin: Khóa luận cung cấp cơ sở lý thuyết đầy đủ về các phản ứng đóng vòng coumarin kinh điển (Perkin, Pechmann, Knoevenagel, Reformatsky, Wittig...).
  • Tham khảo phân tích phổ học hữu cơ: Phần biện giải phổ $^{1}\text{H-NMR}$ 500 MHz trong khóa luận là tư liệu học tập điển hình về cách phân tích ảnh hưởng của các hiệu ứng điện tử (hiệu ứng liên hợp $+R$, $-R$) lên mật độ electron và độ dịch chuyển hóa học của các proton vòng thơm và vòng lacton.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất then chốt 3-aminocoumarin được tổng hợp qua những giai đoạn trung gian nào và hiệu suất của từng giai đoạn là bao nhiêu?
3-Aminocoumarin được tổng hợp qua chuỗi 3 bước: đầu tiên ngưng tụ glycine với anhydride acetic tạo acetylglycine; sau đó ngưng tụ acetylglycine với salicylaldehyde trong anhydride acetic có xúc tác piperidine thu được 3-acetylaminocoumarin với hiệu suất 50,72% ($t^\circ_{\text{nc}} = 200\text{--}203^\circ\text{C}$); cuối cùng thủy phân 3-acetylaminocoumarin bằng dung dịch HCl đặc trong ethanol nóng, trung hòa bằng $\text{NaHCO}3$ thu được 3-aminocoumarin với hiệu suất 55% ($t^\circ{\text{nc}} = 127^\circ\text{C}$).

2. Tại sao tín hiệu phổ $^{1}\text{H-NMR}$ của proton $\text{H}^4$ ở 3-aminocoumarin ($\delta = 6,71\text{ ppm}$) lại dịch chuyển mạnh về phía trường cao so với ở 3-acetylaminocoumarin ($\delta = 8,61\text{ ppm}$)?
Ở hợp chất 3-acetylaminocoumarin, cặp electron tự do trên nguyên tử nitơ của nhóm $-\text{NH}-$ tham gia liên hợp đồng thời với nhóm $\text{C=O}$ amide và hệ liên hợp vòng coumarin, làm giảm mật độ electron tại vị trí $\text{C}^4$. Khi chuyển thành 3-aminocoumarin tự do, nhóm $-\text{NH}_2$ chỉ phát huy hiệu ứng cho electron cộng hưởng ($+R$) trực tiếp vào vòng coumarin mà không bị phân tán, làm tăng mật độ electron tại proton $\text{H}^4$, khiến tín hiệu chuyển dịch mạnh về phía từ trường cao.

3. Ba dẫn xuất thế của 3-aminocoumarin được tinh chế bằng các hệ dung môi kết tinh lại nào?
Dẫn xuất 1-(coumarin-3-yl)-3-phenylthiourea (4) được kết tinh lại trong hệ dung môi dioxane : ethanol; ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) và N-(coumarin-3-yl)pivalamide (5b) đều được kết tinh lại trong hệ dung môi ethanol : nước.

4. Dữ liệu phổ khối lượng phân giải cao HR-MS của hợp chất đại diện ethyl (coumarin-3-yl)carbamate (5a) ghi nhận thông số gì?
Hợp chất 5a có công thức phân tử $\text{C}{12}\text{H}{11}\text{NO}_4$ với khối lượng phân tử tính toán $M = 233,0688$. Trên phổ HR-ESI-MS ghi nhận pic ion phân tử $[\text{M}+\text{H}]^+$ tại giá trị $m/z = 234$ cùng các pic chùm đồng vị $[(\text{M}+\text{H})+1]$, $[(\text{M}+\text{H})+2]$, $[(\text{M}+\text{H})+3]$, chứng minh sự hình thành của hợp chất carbamate dự kiến.

5. Hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn xuất được khảo sát bằng phương pháp nào và trên những chủng vi khuẩn nào?
Hoạt tính kháng khuẩn được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường dinh dưỡng MPA gồm cao thịt, peptone, NaCl và agar. Hai chủng vi khuẩn thử nghiệm gồm vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis với hai nồng độ dung dịch thử nghiệm là 1% và 2%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Hồ Bảo Tuyên đã xây dựng thành công quy trình tổng hợp 3-aminocoumarin từ các tiền chất glycine và salicylaldehyde, đồng thời điều chế được ba dẫn xuất thế nhóm amino gồm dẫn xuất thiourea, carbamate và pivalamide. Toàn bộ cấu trúc hóa học của các sản phẩm được khẳng định thông qua việc phân tích và biện giải chi tiết các dữ liệu phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^{1}\text{H-NMR}$ (500 MHz) và phổ khối lượng phân giải cao HR-MS. Đề tài đã thiết lập quy trình thử nghiệm vi sinh trên môi trường MPA với hai chủng vi khuẩn chỉ thị, cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm và phương pháp luận có giá trị cho hướng nghiên cứu hóa học dị vòng coumarin.