HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ DIỆU HOA THỬ NGHIỆM VẮC-XIN NHƯỢC ĐỘC ĐÔNG KHÔ PHÒNG BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (INFECTIOUS BRONCHITIS – IB) SẢN XUẤT TẠI CÔNG TY TNHH MTV AVAC VIỆT NAM Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Vũ Diệu Hoa i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS. Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Vũ Diệu Hoa ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danhmụccácchữviếttắt.
v Danh mục bảng. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn. viii Thesis abstract.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Tổng quan tài liệu. Hiểu biết chung về bệnh IB.
Giới thiệu chung. Virus viêm phế quản truyền nhiễm. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà. Hiểu biết chung về vắc-xin.
Những đặc tính cơ bản của vắc-xin .3 Hiểu biết chung về miễn dịch. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Thẩm định giống.
Kiểm nghiệm vắc-xin. Thử nghiệm vắc-xin RTD IB H120. Đối tượng, nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.
Địa điểm nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Sản xuất vắc-xin theo quy trình của Công ty TNHH MTV AVAC Việt iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phương pháp tiêm truyền giống virus vào trứng có phôi sản xuất giống gốc.
Phương pháp thu hoạch virus từ phôi trứng đã gây nhiễm. Phương pháp làm IHA. Phương pháp xác định EID50. Phương pháp gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm.
Phương pháp tách huyết thanh. Phương pháp làm phản ứng ELISA để đánh giá lượng kháng thể của gà sau khi thử nghiệm vắc-xin IB. Phương pháp làm RT PCR. Phương pháp thử nghiệm vắc-xin.
Phương pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học. Kết quả và thảo luận. Kết quả thẩm định giống. Kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của giống gốc virus IB chủng RTD IB H120.
Kết quả giải mã gen đặc trưng của virus RTD IB H120. Kết quả kiểm nghiệm Vắc-XIN. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc-xin RTD IB H120. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin IB H120.
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120. Kết quả thử nghiệm Vắc-XIN RTD IB H120. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin IB H120. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120.
Kết quả đánh giá độ dài miễn dịch của gà sau khi tiêm vắc-xin bằng phương pháp kiểm tra HGKT. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của vắc-xin RTD IB H120 đông khô. Kết luận và đề nghị. Giống virus RTD IB H120 có các đặc điểm và chỉ số sau đây.
Vắc-xin RTD IB H120 đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực trong quá trình kiểm nghiệm. 49 Tài liệu tham khảo. 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BPL β probiolacton ĐC Đối chứng EID50 Embryo Infective Dosage 50 (Liều gây nhiễm 50% phôi) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HGKT Hiệu giá kháng thể GMP Good Manufacturing Practices (Thực hành sản xuất tốt) IB Infectious Bronchitis IBV Infectious Bronchitis Virus IHA Indirect Haemagglutination Assay (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp) MTV Một thành viên PBS Phosphate Buffered Saline RTD Rural Technology Development (Công nghệ phát triển nông thôn) RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) SPF Specific Pathogen-Free TNHH Trách nhiệm hữu hạn VX Vắc-xin WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Công thức Reed & Muench tính EID50.
Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật. Bố trí thí nghiệm tại trại gia công. Kết quả kiểm tra vô trùng giống gốc virus RTD IB H120. Kết quả xác định EID50 của virus RTD IB H120.
Kết quả xác định EID50 của giống gốc trung bình. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA. Kết quả kiểm tra vô trùng văc-xin RTD IB H120. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin nhược độc đông khô H120.
Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc-xin nhược độc đông khô H120. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc-xin RTD IB H120. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung bình IB trong huyết thanh của gà được sử dụng vắc-xin RTD IB H120 bằng phản ứng ELISA.
Kết quả xác định độ ổn định của vắc-xin RTD IB H120 đông khô bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC. 47 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 3. Sơ đồ sản xuất văc-xin RTD IB H120. Cách làm phản ứng IHA.
Phôi gà nhiễm virus RTD IB H120. Kết quả nhân gen S1 của chủng virus RTD IB H120 bằng phản ứng PCR. Cây phát sinh chủng loại gen S1 giữa chủng RTD IB H120 với các chủng tham chiếu khác. Biểu đồ thể hiện độ dài miễn dịch của vắc-xin.
45 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Diệu Hoa Tên luận văn: “Thử nghiệm vắc-xin nhược độc đông khô phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiềm (Infectious Bronchitis –IB) sản xuất tại Công ty Trách nhiệm hữu hạn một thành viên AVAC Việt Nam” Chuyên nghành: Thú y Mã học viên: 60 64 01 01 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích Đánh giá được các chỉ tiêu vô trùng, hiệu giá, an toàn, hiệu lực, độ dài miễn dịch, thời gian bảo quản của vắc-xin RTD IB H120. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng Sử dụng phương pháp thu thập số liệu kết hợp với bố trí thí nghiệm và phân tích trong phòng thí nghiệm. Áp dụng các phương pháp phân tích thống kê toán học, lấy mẫu, xử lý số liệu. Các kết quả chính Giống virus IB chủng H120 của công ty AVAC có các đặc điểm: Vô trùng, hiệu giá là 105.54EID50/0,1ml, có đặc tính gây miễn dịch, được giải mã gen đặc trưng (S1 độ dài bằng 1,611 bp) và kiểm tra giám định gen xác định là IBV.
Vắc-xin RTD IB H120 của công ty AVAC đã được kiểm nghiệm là đạt về các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực. Vắc-xin RTD IB H120 được thử nghiệm trên thực địa an toàn khi gà được chủng gấp 10 lần liều quy định, HGKT bảo hộ của vắc-xin từ 90%-100%. Mỗi liều vắc-xin chứa tối thiểu 103EID50. Gà được bảo hộ đến 42 ngày sau khi chủng vắc-xin RTD IB H120, thời gian bảo quản vắc-xin lên đến 18 tháng.
Kết luận Virus RTD IB H120 đạt tiêu chuẩn để làm giống gốc. Vắc-xin RTD IB H120 đủ các điều kiện vô trùng, an toàn, hiệu lực đã được thử nghiệm tại thực địa, có kích thích sinh miễn dịch, độ dài miễn dịch kéo dài đến khi gà được 49 ngày tuổi đối với gà chủng vắc-xin ở thời điểm 7 ngày tuổi, thời gian bảo quản vắc-xin được đảm bảo đến 18 tháng. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com THESIS ABSTRACT Author: Vu Dieu Hoa Thesis title: “Testing attenuated lyophilized vaccine preventing infectious bronchitis (Infectious Bronchitis –IB), produce at AVAC Vietnam Company Limited”. Major: Veterinary ID: 60 64 01 01 Training institution: Vietnam National University of Agriculture Objective Evaluate criteria including sterility, titer, safety, effectiveness, duration of immunity, and storage time of RTD IB H120 vaccine.
Method Collection of data combines with arranging experiments and analysis in the laboratory Applying mathematical and statistical analysis method, sampling and data processing. Key findings RTD IB H120 Virus of Company AVAC has characteristics: sterile, titer is 5.54 10 EID50/0,1ml, immunogenic features, specific genes are decoded (S1 length is 1,611 bp) and inspection assessment identified as IBV genes. RTD IB H120 vaccine from Company AVAC has been tested and satisfied criteria including sterility, safety, and effectiveness. RTD IB H120 Vaccine was tested in the field are safe when chicken use vaccine over 10 times compare to prescribed dose, the protection antibiotic titers of the vaccine from 90%-100%.
Each dose of vaccine contains at least 103 EID50. Chickens are protected within 42 days after using RTD IB H120 vaccine, while vaccines preservation period is up to 18 months. Conclusion RTD IB H120 virus satisfy standard to be original species. RTD IB H120 vaccine meets sterile conditions, safety and effectiveness has been tested in the field, have immune stimulants, immune duration extended until chicken reach 49 days for chicken strains vaccine at the time of 7 days old, while vaccines preservation period is up to 18 months.
ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tiền thân của Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam là Công ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn RTD. Do đó khi đăng ký lưu hành sản phẩm các văn bản tài liệu về vắc-xin IB H120 được nhắc tới trong bài báo cáo sẽ có tên theo tên công ty RTD.