Luận văn thạc sĩ hus thiết kế vector baculor virus mang gen ha của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus like particle

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus thiết kế vector baculor virus mang gen ha của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Đào Thị Như Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ Virus Like Particle
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sỹ Khoa Học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về virus cúm
• 1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
• 1.3. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
• 1.4. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
• 1.5. Tình hình dịch bệnh H5N1
• 1.6. Vaccine phòng chống cúm
• 1.6.1. Đại cương về vaccine
• 1.6.2. Vaccine truyền thống
• 1.6.3. Vaccine thế hệ mới
• 1.6.3.1. Hạt giả virus - VLPs
• 1.6.3.2. Phương pháp tạo VLPs
• 1.6.3.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs
• 1.6.3.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vector tách dòng
• 2.3. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.5.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế
• 2.5.3. Thiết kế hộp gen HA của virus cúm A/H5N1
• 2.5.4. Thiết kế các vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 2.5.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E
• 2.5.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E
• 2.5.7. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
• 2.5.8. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.5.9. Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA
• 2.5.10. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyển nạp
• 2.5.11. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp
• 2.5.12. Kiểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen HA
• 3.2. Thiết kế hộp gen HA
• 3.3. Tách dòng hộp gen HA vào vector PCR 2
• 3.4. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 3.5. Nuôi cấy và bảo quản tế bào côn trùng Spodoptera/rugiperda (Sf9)
• 3.6. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen H5
• 3.7. Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế vector virus baculovirus mang gen HA

Thiết kế vector virus baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 là một trong những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực phát triển vaccine mới. Virus cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều đợt dịch bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu, và việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của virus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất vaccine an toàn và hiệu quả.

1.1. Đặc điểm của virus cúm A H5N1 và gen HA

Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, có cấu trúc gen RNA sợi đơn âm. Gen HA (hemagglutinin) là một trong những kháng nguyên chính của virus, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập vào tế bào vật chủ. Việc hiểu rõ về gen HA giúp thiết kế các vector virus baculovirus mang gen này, từ đó phát triển vaccine hiệu quả hơn.

1.2. Tình hình dịch bệnh cúm A H5N1 hiện nay

Dịch cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều ca mắc và tử vong trên toàn thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), từ năm 2003 đến 2012, có 610 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 360 trường hợp tử vong. Sự biến đổi liên tục của virus làm tăng nguy cơ lây nhiễm sang người, đòi hỏi cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong phát triển vaccine cúm A H5N1

Phát triển vaccine cúm A/H5N1 gặp nhiều thách thức, bao gồm sự biến đổi gen của virus, thời gian sản xuất vaccine lâu và chi phí cao. Các vaccine truyền thống thường sản xuất trên trứng gà có phôi, điều này không đáp ứng kịp thời trong trường hợp đại dịch. Do đó, cần tìm kiếm các phương pháp mới để sản xuất vaccine hiệu quả hơn.

2.1. Sự biến đổi của virus cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới. Điều này làm cho các vaccine hiện có không còn hiệu quả, đòi hỏi phải phát triển các vaccine mới có khả năng thích ứng với các biến thể của virus.

2.2. Hạn chế của vaccine truyền thống

Vaccine truyền thống sản xuất trên trứng gà có phôi có nhiều hạn chế như thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp và chi phí cao. Trong trường hợp đại dịch, việc sản xuất vaccine truyền thống không thể đáp ứng kịp thời nhu cầu, do đó cần có các công nghệ mới để phát triển vaccine.

III. Phương pháp thiết kế vector baculovirus mang gen HA

Phương pháp thiết kế vector baculovirus mang gen HA bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc tách chiết gen HA đến việc tạo ra các vector trung gian. Công nghệ virus-like particles (VLPs) đang được áp dụng để phát triển vaccine thế hệ mới, giúp tạo ra các hạt vaccine an toàn và hiệu quả.

3.1. Tách chiết và thiết kế gen HA

Quá trình tách chiết gen HA từ virus cúm A/H5N1 là bước đầu tiên trong việc thiết kế vector baculovirus. Gen HA được tách chiết và kiểm tra bằng các phương pháp sinh học phân tử để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc sản xuất vaccine.

3.2. Tạo vector baculovirus mang gen HA

Sau khi tách chiết gen HA, bước tiếp theo là tạo ra vector baculovirus mang gen này. Các vector trung gian được sử dụng để chuyển gen HA vào tế bào côn trùng, từ đó sản xuất ra các hạt virus-like particles (VLPs) chứa gen HA, giúp kích thích hệ miễn dịch.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vaccine mới từ vector baculovirus

Vaccine mới phát triển từ vector baculovirus mang gen HA có tiềm năng lớn trong việc phòng ngừa cúm A/H5N1. Các nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn so với vaccine truyền thống. Điều này mở ra hy vọng cho việc kiểm soát dịch cúm hiệu quả hơn.

4.1. Hiệu quả của vaccine VLPs trong nghiên cứu

Nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, giúp bảo vệ cơ thể khỏi virus cúm A/H5N1. Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tính an toàn và hiệu quả của vaccine này trong việc phòng ngừa bệnh.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong phòng chống dịch bệnh

Vaccine mới từ vector baculovirus có tiềm năng lớn trong việc phòng chống dịch cúm A/H5N1. Với khả năng sản xuất nhanh chóng và hiệu quả, vaccine này có thể đáp ứng kịp thời trong các tình huống khẩn cấp, giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của vaccine cúm A H5N1

Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 mở ra hướng đi mới trong phát triển vaccine. Với những ưu điểm vượt trội, vaccine VLPs có thể trở thành giải pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa dịch cúm. Tương lai của vaccine này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy thiết kế vector baculovirus mang gen HA là một phương pháp hứa hẹn trong phát triển vaccine mới. Vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và an toàn, mở ra hy vọng cho việc kiểm soát dịch cúm A/H5N1.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các vaccine mới từ vector baculovirus, đồng thời mở rộng ứng dụng của công nghệ này trong việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm khác. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế sẽ là yếu tố quyết định cho thành công của các nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về virus cúm 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm c và nhóm Thogotovirus.

Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hem agglutinin, ở virus cúm c là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là G lycoprotein [4, 6]. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 - 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8-1,1% RNA; 70-75% protein; 20-24% lipid và 5-8% carbonhydrate[23]. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đon âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M I và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2[6].

Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn a đổi xứng, dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polym erase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bàng các cầu nổi peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ lOkb - 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn a bên trong vỏ virus[6]. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein m àng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus.

Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm. Virus 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4-5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA).

Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M l (matrix) [6], Influenza virus RNP (■) sense ssRNA 3 polymerase subunits NP H ình 1.1: Virus cúm r A /H IN I chụp băng kính __ hiên vi> (A) và hình ảnh mô phỏng câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet). Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt m ang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1. Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn định và có tính bảo thủ cao.

Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [1,6]. > Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2.

4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa P B 1. PA ha NP X NA 3 M1 I M2 I NS2 41 NS1 Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A /H 5N 1. > Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B 1. P B 1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus.

Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein P B 1 - F2 được m ã hóa bởi m ột khung đọc mở khác của phân đoạn 2. > Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA. PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.

> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề m ặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA I và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Vùng nổi giữa HA I và HA2 là m ột số am ino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide.

Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus. > Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP). Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận > văn thạc • s ĩ sinh học • Đào Thị N hư Hoa RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững. > Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus.

Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm. > Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M I và M2 được dịch m ã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng m ột phân đoạn RNA. Protein M I là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus.

Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là 11 kDa. Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ. > Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc. Phân đoạn này có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus.

Protein NS1 có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin. Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở. NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 1.

Hem agglutinin (HA) HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân.

Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị H A I và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm.

Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần H A I và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HP AI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (Hình 1. Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ [3,4].3: Mô hình cấu trúc phân tử HA Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3). Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau.

Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.