Luận văn thạc sĩ hus thiết kế vector baculor virus mang gen ha của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus like particle

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus thiết kế vector baculor virus mang gen ha của virus cúm a h5n1 phục vụ cho việc phát triển, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Đào Thị Như Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
• Đề tài: Thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 phục vụ cho việc phát triển vaccine thế hệ mới bằng công nghệ Virus Like Particle
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sỹ Khoa Học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về virus cúm
• 1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
• 1.3. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
• 1.4. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
• 1.5. Tình hình dịch bệnh H5N1
• 1.6. Vaccine phòng chống cúm
• 1.6.1. Đại cương về vaccine
• 1.6.2. Vaccine truyền thống
• 1.6.3. Vaccine thế hệ mới
• 1.6.3.1. Hạt giả virus - VLPs
• 1.6.3.2. Phương pháp tạo VLPs
• 1.6.3.3. Các hệ thống biểu hiện tạo VLPs
• 1.6.3.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLPs
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vector tách dòng
• 2.3. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
• 2.4. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.5.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế
• 2.5.3. Thiết kế hộp gen HA của virus cúm A/H5N1
• 2.5.4. Thiết kế các vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 2.5.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E
• 2.5.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E
• 2.5.7. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
• 2.5.8. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 2.5.9. Chọn lọc các dòng plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen HA
• 2.5.10. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyển nạp
• 2.5.11. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp
• 2.5.12. Kiểm tra sự có mặt gen HA trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế DNA bộ khung của baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen HA
• 3.2. Thiết kế hộp gen HA
• 3.3. Tách dòng hộp gen HA vào vector PCR 2
• 3.4. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA
• 3.5. Nuôi cấy và bảo quản tế bào côn trùng Spodoptera/rugiperda (Sf9)
• 3.6. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen H5
• 3.7. Kiểm tra sự có mặt của gen HA trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế vector virus baculovirus mang gen HA

Thiết kế vector virus baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 là một trong những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực phát triển vaccine mới. Virus cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều đợt dịch bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu, và việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của virus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất vaccine an toàn và hiệu quả.

1.1. Đặc điểm của virus cúm A H5N1 và gen HA

Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, có cấu trúc gen RNA sợi đơn âm. Gen HA (hemagglutinin) là một trong những kháng nguyên chính của virus, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập vào tế bào vật chủ. Việc hiểu rõ về gen HA giúp thiết kế các vector virus baculovirus mang gen này, từ đó phát triển vaccine hiệu quả hơn.

1.2. Tình hình dịch bệnh cúm A H5N1 hiện nay

Dịch cúm A/H5N1 đã gây ra nhiều ca mắc và tử vong trên toàn thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), từ năm 2003 đến 2012, có 610 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 360 trường hợp tử vong. Sự biến đổi liên tục của virus làm tăng nguy cơ lây nhiễm sang người, đòi hỏi cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong phát triển vaccine cúm A H5N1

Phát triển vaccine cúm A/H5N1 gặp nhiều thách thức, bao gồm sự biến đổi gen của virus, thời gian sản xuất vaccine lâu và chi phí cao. Các vaccine truyền thống thường sản xuất trên trứng gà có phôi, điều này không đáp ứng kịp thời trong trường hợp đại dịch. Do đó, cần tìm kiếm các phương pháp mới để sản xuất vaccine hiệu quả hơn.

2.1. Sự biến đổi của virus cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới. Điều này làm cho các vaccine hiện có không còn hiệu quả, đòi hỏi phải phát triển các vaccine mới có khả năng thích ứng với các biến thể của virus.

2.2. Hạn chế của vaccine truyền thống

Vaccine truyền thống sản xuất trên trứng gà có phôi có nhiều hạn chế như thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp và chi phí cao. Trong trường hợp đại dịch, việc sản xuất vaccine truyền thống không thể đáp ứng kịp thời nhu cầu, do đó cần có các công nghệ mới để phát triển vaccine.

III. Phương pháp thiết kế vector baculovirus mang gen HA

Phương pháp thiết kế vector baculovirus mang gen HA bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc tách chiết gen HA đến việc tạo ra các vector trung gian. Công nghệ virus-like particles (VLPs) đang được áp dụng để phát triển vaccine thế hệ mới, giúp tạo ra các hạt vaccine an toàn và hiệu quả.

3.1. Tách chiết và thiết kế gen HA

Quá trình tách chiết gen HA từ virus cúm A/H5N1 là bước đầu tiên trong việc thiết kế vector baculovirus. Gen HA được tách chiết và kiểm tra bằng các phương pháp sinh học phân tử để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc sản xuất vaccine.

3.2. Tạo vector baculovirus mang gen HA

Sau khi tách chiết gen HA, bước tiếp theo là tạo ra vector baculovirus mang gen này. Các vector trung gian được sử dụng để chuyển gen HA vào tế bào côn trùng, từ đó sản xuất ra các hạt virus-like particles (VLPs) chứa gen HA, giúp kích thích hệ miễn dịch.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vaccine mới từ vector baculovirus

Vaccine mới phát triển từ vector baculovirus mang gen HA có tiềm năng lớn trong việc phòng ngừa cúm A/H5N1. Các nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn so với vaccine truyền thống. Điều này mở ra hy vọng cho việc kiểm soát dịch cúm hiệu quả hơn.

4.1. Hiệu quả của vaccine VLPs trong nghiên cứu

Nghiên cứu cho thấy vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, giúp bảo vệ cơ thể khỏi virus cúm A/H5N1. Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tính an toàn và hiệu quả của vaccine này trong việc phòng ngừa bệnh.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong phòng chống dịch bệnh

Vaccine mới từ vector baculovirus có tiềm năng lớn trong việc phòng chống dịch cúm A/H5N1. Với khả năng sản xuất nhanh chóng và hiệu quả, vaccine này có thể đáp ứng kịp thời trong các tình huống khẩn cấp, giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và tương lai của vaccine cúm A H5N1

Nghiên cứu thiết kế vector baculovirus mang gen HA của virus cúm A/H5N1 mở ra hướng đi mới trong phát triển vaccine. Với những ưu điểm vượt trội, vaccine VLPs có thể trở thành giải pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa dịch cúm. Tương lai của vaccine này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy thiết kế vector baculovirus mang gen HA là một phương pháp hứa hẹn trong phát triển vaccine mới. Vaccine VLPs có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và an toàn, mở ra hy vọng cho việc kiểm soát dịch cúm A/H5N1.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các vaccine mới từ vector baculovirus, đồng thời mở rộng ứng dụng của công nghệ này trong việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm khác. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế sẽ là yếu tố quyết định cho thành công của các nghiên cứu này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 là mối hiểm họa dịch tễ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng trên quy mô toàn cầu. Theo số liệu thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trong giai đoạn từ năm 2003 đến năm 2012, thế giới đã ghi nhận 610 trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 ở người với 360 ca tử vong, tương ứng tỷ lệ tử vong lên tới gần 59%. Tại Việt Nam, đợt bùng phát dịch đã lan rộng trên nhiều địa phương, làm chết và buộc phải tiêu hủy hơn 14.000 gia cầm chỉ trong các tháng đầu năm 2010.

Phương pháp phòng chống chủ động và bền vững nhất hiện nay là tiêm chủng vaccine. Tuy nhiên, các dòng vaccine truyền thống sản xuất trên trứng gà có phôi thường bộc lộ những hạn chế lớn: quy trình nuôi cấy kéo dài từ 6 đến 9 tháng, hiệu suất sinh khối thấp, chi phí vận hành đắt đỏ và không thể đáp ứng kịp thời nhu cầu đột biến khi xảy ra đại dịch bùng phát diện rộng.

Nhằm giải quyết triệt để bài toán này, đề tài tập trung vào mục tiêu thiết kế thành công vector baculovirus tái tổ hợp mang gen Hemagglutinin (HA) của chủng virus cúm A/H5N1 (phân lập từ mẫu A/chicken/hatay/2004), tạo tiền đề vững chắc cho việc sản xuất hạt giả virus (Virus-Like Particles - VLPs) trên tế bào côn trùng. Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học trong giai đoạn 2011-2012. Ý nghĩa cốt lõi của công trình là mở ra hướng đi sản xuất vaccine thế hệ mới an toàn 100% do hạt VLP không chứa vật chất di truyền, đồng thời nâng cao hiệu giá kháng thể bảo hộ miễn dịch gấp 10 lần so với các kháng nguyên protein đơn phân tái tổ hợp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử virus học và miễn dịch học hiện đại, tích hợp ba mô hình lý thuyết then chốt:

Thứ nhất, lý thuyết cấu trúc hệ gen của virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae. Hệ gen virus gồm 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm (-)ssRNA mã hóa cho 11 protein chức năng. Trong đó, glycoprotein Hemagglutinin (HA) có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa đóng vai trò quyết định khả năng xâm nhiễm thông qua liên kết với thụ thể acid sialic trên bề mặt tế bào vật chủ. Phân tử HA dạng trimer là đích tác động chính để hệ miễn dịch sản sinh kháng thể trung hòa đặc hiệu.

Thứ hai, mô hình công nghệ hạt giả virus (VLPs). VLPs là các cấu trúc nano sinh học đa phân tử có kích thước đồng nhất từ 80 đến 120 nm, mô phỏng chính xác hình thái không gian của vỏ virus tự nhiên nhưng rỗng ruột do thiếu hụt hoàn toàn hệ gen acid nucleic. Do đó, VLPs hoàn toàn không có khả năng tự nhân lên hay gây nhiễm, đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối.

Thứ ba, cơ chế kích hoạt miễn dịch tế bào và thể dịch. Do mang cấu trúc epitop lặp lại dày đặc, VLPs có khả năng liên kết chéo với thụ thể tế bào B (BCR) ở nồng độ cực thấp, kích thích tế bào B tiết IgG bền vững và hình thành tế bào nhớ dài hạn. Đồng thời, cấu trúc kích thước khoảng 40 đến 120 nm của VLP giúp các tế bào đuôi gai (Dendritic cells - DCs) tiếp nhận hiệu quả, xử lý và trình diện kháng nguyên thông qua cả hai con đường phức hợp hòa hợp mô MHC lớp I (hoạt hóa tế bào T CD8+) và MHC lớp II (hoạt hóa tế bào T CD4+).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và mẫu sinh học phục vụ nghiên cứu là chủng virus cúm A/H5N1 bất hoạt trong dung dịch Trizol, được lưu trữ chuẩn mực ở điều kiện nhiệt độ -70°C.

Về phương pháp chọn mẫu, nghiên cứu áp dụng kỹ thuật chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc biến nạp (clones) trên môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml và hệ cơ chất chỉ thị màu X-gal/IPTG. Cỡ mẫu khảo sát gồm 6 khuẩn lạc tái tổ hợp màu trắng và 1 khuẩn lạc đối chứng màu xanh trên mỗi đĩa thạch biến nạp để tiến hành tách chiết plasmid kiểm tra.

Phương pháp phân tích phân tử bao gồm: tách chiết RNA tổng số bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với hỗn hợp Chloroform/Isopropanol; tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược RT-PCR với mồi Oligo dT; khuếch đại gen đích qua 35 chu kỳ nhiệt trên máy PCR chuyên dụng; phân cắt kiểm tra bằng cặp enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII; phân tích kích thước đoạn DNA bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ 1%; và kiểm chứng độ chính xác trình tự nucleotide bằng hệ thống giải trình tự tự động ABI PRISM 3100. Lý do lựa chọn hệ thống biểu hiện Baculovirus/tế bào côn trùng Sf9 (Spodoptera frugiperda) là nhằm đảm bảo protein HA tái tổ hợp được gấp cuộn cấu trúc không gian 3D chính xác và thực hiện các biến đổi glycosyl hóa sau dịch mã tương đồng tối đa với virus tự nhiên.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã mang lại những kết quả phân tử quan trọng:

Thứ nhất, thiết kế và nhân dòng thành công hộp gen HA hoàn chỉnh. Bằng cặp mồi thiết kế chuyên biệt HApBac-F và HApBac-R, phản ứng PCR đã khuếch đại đặc hiệu một băng DNA duy nhất có kích thước chính xác 1664 bp (tương đương khoảng 1.6 kb), tích hợp đầy đủ trình tự nhận biết enzyme giới hạn BamHI, tín hiệu Kozak tối ưu dịch mã, mã mở đầu ATG ở đầu 5’ cùng với mã kết thúc và vị trí nhận biết HindIII ở đầu 3’.

Thứ hai, tạo dòng thành công vector tách dòng trung gian pCRHA. Sau khi gắn đoạn PCR tinh sạch vào vector pCR2.1 (kích thước 3.9 kb), phân tích cắt giới hạn với 6 dòng plasmid chọn lọc cho thấy có 5/6 dòng xuất hiện đoạn chèn đúng kích thước, đạt tỷ lệ tạo dòng tái tổ hợp thành công lên tới 83.3%. Kết quả giải trình tự khẳng định độ tương đồng nucleotide của gen HA trong dòng plasmid chọn lọc đạt mức chính xác 100%.

Thứ ba, thiết kế thành công vector chuyển nhượng biểu hiện pBluBacHA. Sự gắn nối đoạn gen HA kích thước 1.6 kb vào bộ khung vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO kích thước 5.0 kb đã tạo ra plasmid tái tổ hợp có kích thước tổng cộng khoảng 6.6 kb. Phản ứng PCR kiểm tra định hướng với cặp mồi lai PFSP-F và HApBac-R cho thấy băng sản phẩm đặc hiệu duy nhất có kích thước đúng 1800 bp.

Thứ tư, đồng chuyển nạp thành công tạo baculovirus tái tổ hợp trong tế bào Sf9. Tế bào côn trùng được nuôi cấy phục hồi từ nitơ lỏng đạt mật độ che phủ 80-90% diện tích bề mặt chai nuôi cấy ở nhiệt độ 28°C. Sau 72 giờ thực hiện đồng chuyển nạp với 0.5 µg Bac-N-Blue DNA và vector pBluBacHA, các tế bào xuất hiện hiệu ứng bệnh tế bào (Cytopathic Effect - CPE) rõ nét đạt tỷ lệ 60-70%, xác nhận sự nhân lên mạnh mẽ của virus tái tổ hợp mang gen HA.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm khẳng định quy trình thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang gen HA đã vận hành với độ chính xác và tính lặp lại rất cao. Việc bổ sung trình tự Kozak trước mã khởi đầu ATG đã đóng vai trò bản lề giúp bộ máy ribosome của tế bào côn trùng nhận diện và khởi động dịch mã với hiệu suất tối ưu.

Để trực quan hóa dữ liệu nghiên cứu, toàn bộ kết quả phân cắt plasmid và sản phẩm PCR kiểm tra có thể được chuẩn hóa thành một bảng ma trận đối sánh kích thước phân tử lý thuyết so với thực tế, cũng như biểu đồ phân bố kích thước hạt nano sinh học sau khi ly tâm phân đoạn. So sánh với các hệ thống biểu hiện vi khuẩn E. coli truyền thống thường tạo ra các thể vùi không cuộn gấp hoặc nấm men Pichia pastoris dễ bị hiện tượng quá glycosyl hóa gốc mannose, hệ thống Baculovirus/Sf9 mang lại lợi thế vượt trội về việc biểu hiện kháng nguyên bề mặt dạng nguyên bản. Kết quả này hoàn toàn tương thích với các báo cáo quốc tế về tính ổn định của vaccine VLPs, giúp duy trì hàm lượng kháng thể trung hòa trong huyết thanh kéo dài trên 4 năm sau tiêm chủng.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất vaccine cúm thế hệ mới quy mô công nghiệp từ kết quả thiết kế vector, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp hành động cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình thu hồi và tinh sạch hạt giả virus. Nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học phân tử cần triển khai ứng dụng kỹ thuật sắc ký rây phân tử (Size-Exclusion Chromatography) kết hợp ly tâm siêu tốc trên thang nồng độ đường sucrose, nhằm nâng cao độ tinh khiết của kháng nguyên VLP lên trên mức 95% trong thời gian 6 tháng tới.

Thứ hai, đánh giá đáp ứng sinh miễn dịch in vivo trên mô hình động vật. Cơ quan nghiên cứu cần phối hợp với các trung tâm kiểm nghiệm thú y để tiến hành thử nghiệm tiêm phòng hạt VLP trên gà con 1 ngày tuổi và chuột nhắt trắng. Mục tiêu hướng tới là đạt hiệu giá kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) trên mức 1:40 trong khung thời gian 12 tháng.

Thứ ba, phát triển vector đa gen biểu hiện đồng thời kháng nguyên NA và M1. Để tăng cường khả năng tự lắp ráp cấu trúc hạt giả virus đa thành phần, các nhà khoa học cần tích hợp thêm gen Neuraminidase (NA) và Matrix protein (M1) vào cùng một hệ thống vector biểu hiện trong lộ trình 24 tháng tới, giúp mở rộng phổ bảo hộ miễn dịch chéo.

Thứ tư, đầu tư hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù quy mô pilot. Bộ Khoa học và Công nghệ cùng các doanh nghiệp dược phẩm cần tài trợ xây dựng hệ thống bioreactor nuôi cấy tế bào côn trùng quy mô 10 đến 50 lít nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ bán công nghiệp trước năm 2028.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn to lớn cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và di truyền học phân tử: Khai thác quy trình kỹ thuật chuẩn xác về thiết kế hộp gen nhân thực, xử lý enzyme giới hạn kép, gắn nối vector tái tổ hợp và kỹ thuật đồng chuyển nạp homologous recombination trên hệ thống tế bào nhân chuẩn.
2. Các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế và vaccine: Sử dụng các thông số kỹ thuật làm tài liệu tham khảo để chuyển đổi công nghệ từ nuôi cấy trên phôi trứng gà sang dây chuyền sản xuất vaccine hạt giả virus (VLPs) quy mô lớn, an toàn và hiệu suất cao.
3. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Sinh học - Y Dược: Làm tài liệu học tập, nghiên cứu chuyên sâu về vi sinh vật học phân tử, công nghệ DNA tái tổ hợp và phương pháp nuôi cấy bảo quản tế bào côn trùng Sf9 trong môi trường vô trùng.
4. Cán bộ quản lý dịch tễ thú y và y tế dự phòng: Tham khảo cơ sở khoa học của các thế hệ vaccine mới nhằm xây dựng chiến lược tiêm chủng phòng chống các đợt bùng phát cúm gia cầm độc lực cao tại các vùng chăn nuôi trọng điểm.

Câu hỏi thường gặp

1. Công nghệ hạt giả virus (VLPs) có ưu điểm gì vượt trội so với vaccine bất hoạt truyền thống? Vaccine VLPs có cấu tạo không gian đa phân tử tương đồng 100% với virus tự nhiên, giúp kích thích đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể mạnh hơn gấp 10 lần. Do không chứa vật chất di truyền RNA, VLPs loại bỏ hoàn toàn nguy cơ lây nhiễm hoặc tái tổ hợp tạo chủng virus độc lực mới.

2. Tại sao hệ thống Baculovirus/tế bào Sf9 lại được ưu tiên lựa chọn để biểu hiện gen HA? Hệ thống Baculovirus/Sf9 sở hữu promoter polyhedrin cực mạnh giúp biểu hiện protein tái tổ hợp với hiệu suất rất cao. Hơn nữa, tế bào côn trùng Sf9 có đầy đủ bộ máy biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa và gấp cuộn 3D chuẩn xác hơn 90% so với vi khuẩn, đảm bảo hoạt tính sinh học của kháng nguyên.

3. Vai trò của trình tự Kozak được chèn vào hộp gen HA là gì? Trình tự Kozak được thiết kế nằm ngay phía trước mã khởi đầu ATG, đóng vai trò như một tín hiệu nhận diện đặc hiệu cho ribosome của tế bào nhân thực. Yếu tố này giúp tăng cường hiệu suất dịch mã của mRNA lên hơn 80%, tối ưu hóa lượng protein kháng nguyên HA được tổng hợp.

4. Bằng cách nào nghiên cứu xác định chắc chắn vector pBluBacHA đã mang gen đích? Nghiên cứu kết hợp 3 phương pháp kiểm chứng độc lập: phân cắt bằng enzyme giới hạn BamHI/HindIII tạo ra 2 băng DNA chuẩn (5000 bp và 1600 bp); phản ứng PCR mồi lai PFSP-F/HApBac-R tạo băng đặc hiệu 1800 bp; và giải trình tự nucleotide tự động khẳng định độ chính xác đạt 100%.

5. Ý nghĩa của sự xuất hiện hiệu ứng bệnh tế bào (CPE) sau 72 giờ chuyển nạp là gì? Sự xuất hiện của các biểu hiện CPE với tỷ lệ 60-70% trên bề mặt nuôi cấy là bằng chứng khẳng định quá trình tái tổ hợp tương đồng đã diễn ra thành công, tạo ra các hạt virus baculovirus sống mang gen HA có khả năng nhân lên mạnh mẽ trong tế bào côn trùng.

Kết luận

• Đã thiết kế hoàn chỉnh hộp gen HA của virus cúm A/H5N1 với kích thước 1664 bp, tích hợp đầy đủ các yếu tố phiên mã, dịch mã và vị trí cắt giới hạn đặc hiệu.
• Tạo dòng thành công vector tách dòng pCRHA với tỷ lệ chọn lọc dương tính đạt 83.3% và trình tự nucleotide tương đồng 100% với gen gốc.
• Kiến tạo thành công vector biểu hiện baculovirus trung gian pBluBacHA kích thước ~6.6 kb phục vụ biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân chuẩn.
• Nuôi cấy, phục hồi và bảo quản thành công tế bào côn trùng Sf9 với mật độ sinh trưởng đạt 80-90% diện tích đĩa nuôi cấy.
• Đồng chuyển nạp thành công tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen HA, ghi nhận hiệu ứng biến đổi tế bào CPE đạt 60-70% sau 72 giờ.

Công trình là đóng góp nền tảng có giá trị học thuật và ứng dụng cao cho chiến lược phát triển vaccine cúm gia cầm thế hệ mới tại Việt Nam trong giai đoạn tới. Các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm đến công nghệ sản xuất vaccine VLP hãy kết nối để đẩy mạnh hợp tác thử nghiệm và chuyển giao quy mô bán công nghiệp!

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về virus cúm 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do virus dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm c và nhóm Thogotovirus.

Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hem agglutinin, ở virus cúm c là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là G lycoprotein [4, 6]. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 - 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8-1,1% RNA; 70-75% protein; 20-24% lipid và 5-8% carbonhydrate[23]. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đon âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M I và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2[6].

Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn a đổi xứng, dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polym erase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bàng các cầu nổi peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ lOkb - 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn a bên trong vỏ virus[6]. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein m àng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus.

Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm. Virus 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4-5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA).

Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M l (matrix) [6], Influenza virus RNP (■) sense ssRNA 3 polymerase subunits NP H ình 1.1: Virus cúm r A /H IN I chụp băng kính __ hiên vi> (A) và hình ảnh mô phỏng câu trúc ribonucleoprotein (B) (nguôn internet). Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm cỏ hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt m ang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1. Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn định và có tính bảo thủ cao.

Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [1,6]. > Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đom vị thành phần trong phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2.

4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa P B 1. PA ha NP X NA 3 M1 I M2 I NS2 41 NS1 Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A /H 5N 1. > Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B 1. P B 1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đon vị xúc tác của phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus.

Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein P B 1 - F2 được m ã hóa bởi m ột khung đọc mở khác của phân đoạn 2. > Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA. PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.

> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề m ặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA I và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Vùng nổi giữa HA I và HA2 là m ột số am ino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide.

Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus. > Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP). Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận > văn thạc • s ĩ sinh học • Đào Thị N hư Hoa RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đổi xứng xoắn bền vững. > Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus.

Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm. > Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M I và M2 được dịch m ã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng m ột phân đoạn RNA. Protein M I là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus.

Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là 11 kDa. Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ. > Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc. Phân đoạn này có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus.

Protein NS1 có khối lượng phân tử khoảng 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tể bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin. Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho sự sinh sản virus không bị cản trở. NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 1.

Hem agglutinin (HA) HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa trung hòa. Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Có tới 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus. Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng 130 A°, cấu tạo gồm ba đom phân.

Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị H A I và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide. Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus. Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị H A I. Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm.

Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần H A I và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ. Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HP AI), vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể (Hình 1. Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ [3,4].3: Mô hình cấu trúc phân tử HA Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H l, H2 và H3). Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau.

Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.