Luận văn thạc sĩ về thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus thiết kế vector baculovirus chứa gen m1 của virus h1n1 bước đầu tạo vaccine thế hệ mới, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp

• Tác giả: Vũ Thị Thanh Nhàn
• Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về virus cúm
• 1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm
• 1.3. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus
• 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ
• 1.5. Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm
• 1.5.1. Hemagglutinin (HA)
• 1.5.2. Neurominidase (NA)
• 1.6. Matrix protein (M1) của virus cúm
• 1.7. Tình hình dịch bệnh H1N1
• 1.8. Vaccine phòng chống cúm
• 1.8.1. Đại cƣơng về vaccine. Tổng quan về VLPs
• 1.8.2. Hệ thống biểu hiện Baculovirus
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
• 2.1.1. Vector tách dòng
• 2.1.2. Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng
• 2.2. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.3. Trang thiết bị
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.4.2. Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế
• 2.4.3. Tổng hợp cDNA
• 2.4.4. Nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR
• 2.4.5. Điện di trên gel agarose
• 2.4.6. Tách dòng gen
• 2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
• 2.4.8. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
• 2.4.9. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn
• 2.4.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
• 3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1
• 3.3. Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2
• 3.4. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2
• 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
• 3.6. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
• 3.7. Chọn lọc vector tái tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn
• 3.8. Tinh sạch các plasmid tái tổ hợp
• 3.9. Kết quả xác định trình tự
• 3.10. Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1
• 3.10.1. Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4
• 3.10.2. Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế vector baculovirus chứa gen M1

Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1 là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển vaccine mới. Baculovirus là một loại virus có khả năng lây nhiễm vào tế bào côn trùng, được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất protein tái tổ hợp. Gen M1 của virus H1N1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra phản ứng miễn dịch hiệu quả. Việc thiết kế vector baculovirus chứa gen này không chỉ giúp tăng cường khả năng sản xuất protein mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển vaccine thế hệ mới.

1.1. Baculovirus và vai trò trong công nghệ vaccine

Baculovirus là một loại virus có khả năng lây nhiễm vào tế bào côn trùng, đặc biệt là tế bào của loài côn trùng Spodoptera frugiperda. Nhờ vào khả năng sản xuất protein tái tổ hợp, baculovirus đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu và phát triển vaccine. Việc sử dụng baculovirus giúp tăng cường hiệu quả sản xuất protein, đồng thời giảm thiểu rủi ro về an toàn sinh học so với các phương pháp truyền thống.

1.2. Gen M1 và tầm quan trọng trong virus H1N1

Gen M1 của virus H1N1 mã hóa cho protein M1, một thành phần quan trọng trong cấu trúc của virus. Protein M1 không chỉ đóng vai trò trong việc bảo vệ RNA của virus mà còn tham gia vào quá trình lây nhiễm và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ. Việc đưa gen M1 vào vector baculovirus có thể tạo ra các hạt virus giống như virus (VLPs), giúp kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn.

II. Thách thức trong phát triển vaccine mới từ baculovirus

Mặc dù thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình phát triển vaccine mới. Một trong những thách thức lớn nhất là khả năng kháng thuốc của virus H1N1, điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục cập nhật và điều chỉnh vaccine để đảm bảo hiệu quả. Ngoài ra, chi phí sản xuất vaccine từ baculovirus cũng cần được xem xét để đảm bảo tính khả thi trong việc triển khai rộng rãi.

2.1. Khả năng kháng thuốc của virus H1N1

Virus H1N1 có khả năng đột biến cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới có thể kháng lại vaccine hiện có. Điều này đặt ra thách thức lớn cho việc phát triển vaccine hiệu quả và bền vững. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc theo dõi sự biến đổi của virus để điều chỉnh vaccine kịp thời.

2.2. Chi phí sản xuất vaccine từ baculovirus

Chi phí sản xuất vaccine từ baculovirus có thể cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và giảm thiểu chi phí là cần thiết để đảm bảo vaccine có thể được cung cấp rộng rãi cho cộng đồng. Các nghiên cứu cần tìm ra các phương pháp hiệu quả hơn trong việc sản xuất và tinh chế protein từ baculovirus.

III. Phương pháp thiết kế vector baculovirus chứa gen M1

Quá trình thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc tách chiết gen M1 cho đến việc lắp ghép vào vector baculovirus. Các phương pháp hiện đại như PCR và điện di gel agarose được sử dụng để đảm bảo độ chính xác trong việc tách chiết và xác định trình tự gen. Sau khi hoàn thành, vector baculovirus sẽ được đưa vào tế bào côn trùng để sản xuất protein M1.

3.1. Tách chiết và xác định gen M1

Quá trình tách chiết gen M1 từ virus H1N1 được thực hiện bằng phương pháp PCR, cho phép nhân bản gen một cách nhanh chóng và hiệu quả. Sau đó, sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng điện di gel agarose để xác định kích thước và độ tinh khiết của gen M1 trước khi lắp ghép vào vector baculovirus.

3.2. Lắp ghép gen M1 vào vector baculovirus

Sau khi xác định được gen M1, bước tiếp theo là lắp ghép gen này vào vector baculovirus. Việc sử dụng các enzym giới hạn giúp cắt và nối gen M1 vào vector một cách chính xác. Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được biến nạp vào tế bào côn trùng để sản xuất protein M1, từ đó tạo ra vaccine.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vaccine từ baculovirus

Vaccine được phát triển từ baculovirus chứa gen M1 có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe cộng đồng. Việc sử dụng vaccine này không chỉ giúp ngăn ngừa bệnh cúm H1N1 mà còn có thể áp dụng cho các loại virus cúm khác. Hơn nữa, công nghệ sản xuất vaccine từ baculovirus có thể được mở rộng để phát triển các loại vaccine khác, tạo ra một hướng đi mới trong lĩnh vực y tế.

4.1. Ngăn ngừa bệnh cúm H1N1

Vaccine từ baculovirus chứa gen M1 có khả năng kích thích hệ miễn dịch, giúp cơ thể nhận diện và tiêu diệt virus H1N1 khi tiếp xúc. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh mà còn hạn chế sự lây lan của virus trong cộng đồng.

4.2. Mở rộng ứng dụng cho các loại virus khác

Công nghệ baculovirus có thể được áp dụng để phát triển vaccine cho nhiều loại virus khác nhau, không chỉ riêng virus H1N1. Việc này mở ra cơ hội cho việc sản xuất vaccine nhanh chóng và hiệu quả hơn trong các tình huống khẩn cấp, như đại dịch.

V. Kết luận và tương lai của vaccine baculovirus

Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1 là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển vaccine mới. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự phát triển của công nghệ sinh học, khả năng sản xuất vaccine từ baculovirus hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe cộng đồng. Tương lai của vaccine baculovirus có thể mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phòng chống dịch bệnh.

5.1. Tiềm năng phát triển vaccine mới

Vaccine từ baculovirus có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại vaccine mới, giúp đáp ứng nhanh chóng với các dịch bệnh mới nổi. Công nghệ này có thể được cải tiến để tăng cường hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu vaccine

Nghiên cứu về vaccine baculovirus sẽ tiếp tục được mở rộng, không chỉ trong lĩnh vực cúm mà còn cho nhiều loại virus khác. Việc này sẽ giúp nâng cao khả năng phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch cúm A/H1N1 bùng phát trên toàn cầu năm 2009 đã nhanh chóng lây lan tới 214 quốc gia và vùng lãnh thổ, cướp đi sinh mạng của hơn 18.449 người theo báo cáo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tại Việt Nam, chỉ trong 3 tháng đầu sau khi ghi nhận ca nhiễm đầu tiên, dịch bệnh đã bùng phát mạnh mẽ với 7.156 trường hợp mắc bệnh và 9 ca tử vong do các biến chứng suy hô hấp cấp tính. Phương pháp sản xuất vaccine truyền thống dựa trên phôi trứng gà bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: thời gian sản xuất kéo dài từ 5 đến 6 tháng, nguy cơ gây dị ứng và rủi ro tái tổ hợp biến chủng nguy hiểm. Trước thực tế đó, phát triển vaccine thế hệ mới dạng hạt giả virus (Virus-Like Particles - VLPs) bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào côn trùng nổi lên như một hướng đi đột phá, giúp rút ngắn chu kỳ sản xuất xuống chỉ còn 2 đến 8 tuần.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là thiết kế thành công vector tái tổ hợp Baculovirus mang gen mã hóa protein nền M1 của virus cúm A/H1N1 phân lập tại Việt Nam, đặt nền móng kỹ thuật vững chắc cho việc tạo hạt VLPs. Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong giai đoạn 2009 - 2011. Đóng góp nổi bật của đề tài là làm chủ quy trình nhân bản, tinh sạch và định dòng đoạn gen M1 kích thước 775 bp đạt độ tương đồng 99,5% đến 100% so với ngân hàng gen quốc tế, mở ra tiềm năng tự chủ công nghệ sản xuất vaccine cúm an toàn với chi phí thấp trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết cấu trúc và sinh học phân tử của virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae. Hạt virus cúm A có dạng hình cầu đường kính từ 80 đến 120 nm, chứa hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm mã hóa cho 11 loại protein. Trong đó, phân đoạn số 7 có kích thước 1027 bp mã hóa cho hai protein quan trọng là M1 và M2. Protein nền M1 có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa gồm 252 acid amin, đóng vai trò bộ khung trung tâm liên kết phức hợp ribonucleoprotein (RNP) với màng lipid kép, đồng thời điều hòa quá trình nảy chồi và định hình cấu trúc hạt virus.

Song song với đó, nghiên cứu vận dụng mô hình công nghệ hạt giả virus (VLPs) và hệ thống biểu hiện Baculovirus Expression Vector System (BEVS). Hạt VLPs mô phỏng hình thái tự nhiên của virus với đầy đủ lớp vỏ protein nhưng không chứa lõi vật liệu di truyền RNA/DNA, mang lại độ an toàn sinh học tuyệt đối. Hệ thống Baculovirus trên dòng tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) được ứng dụng nhờ khả năng thực hiện chính xác các biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa, hình thành cầu nối disulfide và biểu hiện protein ngoại lai ở mức độ cao dưới sự kiểm soát của promoter polyhedrin mạnh.

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chủng virus cúm A/H1N1 bất hoạt trong dung dịch Trizol, được lưu trữ tại Viện Công nghệ sinh học. Cỡ mẫu nghiên cứu được thực hiện lặp lại qua 3 đợt thí nghiệm độc lập để bảo đảm tính ổn định và độ tin cậy của quy trình tách chiết sinh học phân tử. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào chủng virus đại diện phân lập trực tiếp từ các ổ dịch lâm sàng tại Việt Nam nhằm phản ánh chính xác đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng đang lưu hành.

Lý do lựa chọn các phương pháp phân tích gồm:

• Phương pháp tách chiết RNA bằng Trizol kết hợp đo quang phổ kế UV ở bước sóng 260 nm và 280 nm giúp đánh giá chính xác độ tinh sạch và nồng độ RNA nguyên vẹn trước khi chuyển sang pha tổng hợp cDNA.
• Kỹ thuật phiên mã ngược (RT-PCR) sử dụng enzyme SuperScript II kết hợp cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F và M1pBac-R có gắn vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI, HindIII và trình tự Kozak nhằm tối ưu hóa khả năng dịch mã trong tế bào nhân chuẩn.
• Phản ứng PCR thực hiện qua 30 chu kỳ nhiệt chuẩn hóa, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại.
• Quy trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5alpha bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 độ C trong thời gian 90 giây, chọn lọc dòng khuẩn lạc trắng - xanh trên môi trường thạch LB bổ sung Ampicillin nồng độ 100 microgam/ml và chất chỉ thị màu X-gal.
• Phương pháp giải trình tự gen tự động ABI PRISM 3100 kết hợp thuật toán BLAST nhằm đối soát chính xác từng nucleotide của dòng gen tách được.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được 4 kết quả cốt lõi có giá trị khoa học cao:

• Đã tách chiết thành công RNA tổng số từ mẫu virus cúm A/H1N1 với tỷ số hấp thụ quang học A260/A280 đạt 1,87, nồng độ RNA đạt 104 microgam/ml, đảm bảo độ tinh sạch cao và không bị phân hủy bởi RNase.
• Đã khuếch đại đặc hiệu hộp gen M1 bằng kỹ thuật RT-PCR với một băng DNA đơn nhất có kích thước khoảng 780 bp (chính xác là 775 bp), tích hợp đầy đủ mã mở đầu, mã kết thúc, vị trí nhận biết của BamHI, HindIII và trình tự Kozak.
• Đã tách dòng thành công sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 (kích thước 3,9 kb) tạo plasmid tái tổ hợp pCRM1; tỷ lệ khuẩn lạc trắng mang gen tái tổ hợp đạt trên 85%; phản ứng cắt kiểm tra bằng enzym BamHI và HindIII ở 37 độ C trong 4 giờ đã giải phóng chính xác đoạn chèn 780 bp.
• Kết quả giải trình tự DNA khẳng định đoạn gen M1 phân lập tại Việt Nam gồm 775 nucleotide, có độ tương đồng từ 99,5% đến 100% so với các chủng chuẩn quốc tế công bố trên GenBank; dịch mã suy diễn cho chuỗi 252 acid amin có khối lượng phân tử 27.947 Da với 7 vùng quyết định kháng nguyên (epitopes) đặc hiệu tại các vị trí acid amin từ 4 đến 239.
• Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang gen M1 (ký hiệu pBluBacM1) với kích thước vector mở vòng 5,0 kb và đoạn chèn tinh sạch 775 bp.

Thảo luận kết quả

Mức độ tương đồng trình tự nucleotide và acid amin đạt từ 99,5% đến 100% của gen M1 so với các chủng quốc tế chứng minh tính bảo tồn cấu trúc rất cao của phân đoạn gen số 7 ở virus cúm A. Trong khi các glycoprotein bề mặt như HA và NA biến đổi liên tục qua cơ chế trôi dạt di truyền (antigenic drift) và chuyển dịch di truyền (antigenic shift), protein nền M1 duy trì tính ổn định qua nhiều thập kỷ, khiến nó trở thành ứng viên lý tưởng để tạo khung lõi cho vaccine đa giá.

Dữ liệu thực nghiệm được minh chứng thuyết phục qua hình ảnh bản điện di gel agarose 1%, trong đó vạch sản phẩm PCR xuất hiện rõ nét tương đương mức 780 bp so với thang DNA chuẩn 1 kb. Bảng phân tích 7 vùng epitope kháng nguyên cho thấy sự phân bố tập trung ở cả hai miền cấu trúc cầu nối N-tận (vị trí 1-164) và C-tận (vị trí 165-252). Điều này giải thích tại sao protein M1 tái tổ hợp giữ vững được hoạt tính sinh học, khả năng gắn kết vRNP và tương tác màng lipid khi chuyển gen vào hệ thống vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO. So với công nghệ phôi trứng truyền thống có chi phí sản xuất lớn và chu kỳ nuôi cấy 6 tháng, hệ thống BEVS tái tổ hợp giúp chủ động tạo kháng nguyên chuẩn chỉ trong 2 đến 4 tuần tại quy mô phòng thí nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát triển hoàn thiện nền tảng vaccine VLPs phòng chống cúm A/H1N1 từ kết quả của luận văn, 4 giải pháp trọng tâm cần được thực hiện:

• Đồng biểu hiện hệ gen vỏ và nền: Tiến hành đồng chuyển nhiễm (co-transfection) vector tái tổ hợp pBluBacM1 cùng hai vector biểu hiện mang gen HA và NA vào dòng tế bào côn trùng Sf9; đặt mục tiêu đạt hiệu suất lắp ráp hạt VLPs hoàn chỉnh trên 80% trong vòng 12 tháng tới do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.
• Tối ưu hóa quy trình tinh sạch hạt giả virus: Ứng dụng kỹ thuật siêu ly tâm gradient nồng độ sucrose 20% - 60% kết hợp sắc ký lọc gel nhằm nâng độ tinh khiết của chế phẩm VLPs lên trên 95% và kiểm soát hàm lượng nội độc tố dưới 0,5 EU/ml trong lộ trình 6 đến 9 tháng do các phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học phối hợp triển khai.
• Đánh giá đáp ứng miễn dịch tiền lâm sàng: Thực hiện thử nghiệm gây miễn dịch trên mô hình chuột nhắt trắng với liều lượng kháng nguyên thử nghiệm từ 5 đến 15 microgam/liều; đo lường hiệu giá kháng thể trung hòa IgG và đáp ứng tế bào T trong thời gian 18 tháng dưới sự giám sát của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Mở rộng quy mô nuôi cấy bioreactor: Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9 không dùng huyết thanh trong hệ thống bioreactor dung tích từ 10 lít đến 100 lít, duy trì mật độ tế bào đạt từ 5 x 10^6 đến 1 x 10^7 tế bào/ml trong vòng 24 tháng theo chương trình nghiên cứu cấp quốc gia của Bộ Khoa học và Công nghệ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học: Nắm bắt phương pháp luận thiết kế vector chuyển gen, quy trình cloning chuẩn hóa và kỹ thuật phân tích tin sinh học để phục vụ các đề tài nghiên cứu phân tử.
• Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên tại viện nghiên cứu y sinh: Vận dụng hệ thống biểu hiện Baculovirus/Sf9 và quy trình tối ưu hóa promoter polyhedrin để biểu hiện các protein tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên chẩn đoán.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Y Dược và Khoa học Tự nhiên: Sử dụng tài liệu như một ca lâm sàng thực nghiệm điển hình về cơ chế nhân lên của virus cúm A, cấu trúc 7 vùng epitope và công nghệ sinh phẩm thế hệ mới.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm sinh học và đơn vị chuyển giao công nghệ: Đánh giá cơ sở khoa học và hiệu quả kinh tế của nền tảng VLPs nhằm đầu tư dây chuyền sản xuất vaccine cúm rút ngắn 60% thời gian so với công nghệ nuôi cấy trứng truyền thống.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao gen M1 lại được lựa chọn làm nền tảng phát triển vaccine hạt giả virus (VLPs)? Protein M1 gồm 252 acid amin đóng vai trò khung giàn trung tâm định hình vỏ capsid và thúc đẩy quá trình nảy chồi của hạt virus. Khác với HA và NA thường xuyên đột biến, M1 có độ bảo tồn trình tự đạt 99,5% đến 100%, giúp tạo hạt VLPs ổn định và kích thích đáp ứng miễn dịch chéo bền vững.

Hệ thống biểu hiện Baculovirus có ưu điểm gì vượt trội so với nuôi cấy truyền thống trên phôi trứng? Hệ thống Baculovirus trên tế bào côn trùng Sf9 thực hiện đầy đủ các biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa và tạo cầu nối disulfide chính xác. Thời gian sản xuất kháng nguyên chỉ mất từ 2 đến 8 tuần, nhanh hơn nhiều so với chu kỳ 6 tháng của phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi.

Ý nghĩa của việc gắn thêm trình tự Kozak vào đầu 5' của hộp gen M1 là gì? Trình tự Kozak được chèn ngay trước mã khởi đầu ATG ở đầu 5' của mồi xuôi giúp hệ thống ribosome của tế bào côn trùng nhân chuẩn nhận diện chính xác vị trí khởi đầu dịch mã. Điều này tối ưu hóa tối đa hiệu suất tổng hợp protein M1 có khối lượng phân tử 28 kDa.

Làm thế nào để xác định vector tái tổ hợp pCRM1 mang chính xác đoạn gen mục tiêu? Nghiên cứu kết hợp chọn lọc khuẩn lạc trắng qua cơ chế bất hoạt gen LacZ trên môi trường X-gal/Ampicillin (100 microgam/ml), sau đó cắt kiểm tra bằng cặp enzym giới hạn BamHI và HindIII cho băng sáng 780 bp trên gel agarose 1%, đồng thời giải trình tự tự động ABI PRISM 3100.

Độ tinh sạch của RNA tổng số ảnh hưởng như thế nào đến phản ứng tổng hợp cDNA? Mẫu RNA đạt độ tinh sạch cao với tỷ số quang phổ A260/A280 bằng 1,87 và nồng độ 104 microgam/ml giúp loại bỏ hoàn toàn protein, muối đệm và chất ức chế. Điều này đảm bảo enzyme phiên mã ngược SuperScript II hoạt động với hiệu suất tối đa trong phản ứng tổng hợp chuỗi đơn cDNA.

Kết luận

• Đã tách chiết thành công RNA tổng số của virus cúm A/H1N1 đạt độ tinh sạch cao với tỷ số A260/A280 = 1,87 và nồng độ 104 microgam/ml.
• Đã nhân bản và tạo hộp gen M1 kích thước 775 bp có gắn trình tự Kozak và hai điểm cắt giới hạn BamHI, HindIII phục vụ biểu hiện gen.
• Đã tách dòng thành công vào vector pCR2.1 (3,9 kb) trên Escherichia coli DH5alpha, xác định độ tương đồng trình tự nucleotide đạt 99,5% đến 100% so với dữ liệu quốc tế.
• Đã dịch mã suy diễn chuỗi 252 acid amin của protein M1 (khối lượng 27,95 kDa) và nhận diện chính xác 7 vùng epitope kháng nguyên đặc hiệu.
• Đã thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang gen M1 (pBluBacM1) với kích thước 5,0 kb, sẵn sàng cho bước tạo virus tái tổ hợp.

Công trình đã giải quyết trọn vẹn khâu kỹ thuật cốt lõi trong phòng thí nghiệm, mở ra lộ trình 24 tháng nhằm hoàn thiện vaccine hạt giả virus (VLPs) thế hệ mới tại Việt Nam. Quý độc giả, giảng viên và các nhà nghiên cứu quan tâm vui lòng tham khảo chi tiết toàn văn luận văn để ứng dụng hiệu quả quy trình thiết kế vector trong các dự án công nghệ sinh học y dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Những thập niên về trƣớc, thế giới đã có một thời gian sống khá yên ổn với các bệnh do các loại virus gây ra nhờ thành quả của các vaccine, thuốc kháng sinh. Nhƣng từ những năm 1970 đã có các nghiên cứu cảnh báo sự xuất hiện của các vi và siêu vi trùng có thể gây đại dịch do khả năng kháng vaccine và thuốc. Sau đó, từ các năm LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn 1980 đến nay thì cộng đồng y tế thế giới đã phải đƣơng đầu với nhiều dịch bệnh xảy ra nhƣ dịch AIDS và tiếp theo là các dịch bệnh khác kể cả SARS, cúm gà H5N1, cúm lợn H1N1, dịch bò điên, Ebola v. Theo dự đoán các bệnh dịch sẽ còn tiếp tục phát triển do hậu quả từ việc thay đổi khí hậu và môi trƣờng trên thế giới.

Bệnh cúm A/ H1N1 là bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính do virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, và một số quốc gia khác. Ban đầu chỉ thấy nhiễm trên lợn nhƣng sau đó phát hiện loại virus này còn nhiễm trên nhiều đối tƣợng động vật khác. Virus đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 17 loại kháng nguyên HA (từ H1 đến H17) và 9 loại kháng nguyên NA (từ N1 đến N9) [25].

Sự tái tổ hợp giữa hai loại kháng nguyên này sẽ tạo ra nhiều phân type cúm khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến trong gen/ hệ gen (đặc biệt ở gen mã hóa NA và HA) hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau trong quá trình xâm nhiễm, tồn tại và lây truyền giữa các loài vật chủ để tạo biến thể mới [30]. Các vaccine truyền thống tuy đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngăn ngừa và chống dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt động biến đổi của virus A/H1N1 trong tế bào vật chủ đã gây ra những hạn chế về tính hiệu quả của vaccine. Ngoài ra chi phí cho sản xuất vaccine khá cao và thời gian tƣơng đối dài.

Do vậy vấn đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chóng tạo ra vaccine thế hệ mới nhằm đối phó với những hiểm họa cho cộng đồng trong tƣơng lai. VLPs (Virus like particles) vaccine là một trong những hƣớng đi mới trong công nghệ sản xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ƣu việt so với vaccine thế hệ trƣớc đây. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Từ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về virus cúm 1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Họ Orthomyxoviridae đã đƣợc phát hiện, bao gồm 4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C và nhóm Thogotovirus.

Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid: ở virus cúm A và B là Hemagglutinin, ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là Glycoprotein. Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đƣờng kính 80 – 120 nm, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 – 75% protein; 20 – 24% lipid và 5 – 8% carbonhydrate [25]. Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2 [7].

Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đƣờng kính 9 – 10 nm, đƣợc bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1. Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α bên trong vỏ virus [25]. Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đƣợc gắn protein màng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn virus.

Bề mặt ngoài của vỏ đƣợc bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc. Mỗi glycoprotein có kích thƣớc dài khoảng 10 – 14 nm, đƣờng kính 4 – 6 nm. Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4 – 5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA) [25].

Ngoài ra trên bề mặt vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động nhƣ kênh vận chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix).1: Virus cúm A/H1N1 chụp bằng kính hiển vi (A) và hình ảnh mô phỏng cấu trúc ribonucleoprotein (B). Virus cúm A/H1N1 tƣơng đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí và hóa học. Nguyên nhân vì lớp vỏ ngoài có bản chất là lớp lipid kép nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng.

Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100 o C và ở 60 oC trong 30 phút, bị bất hoạt ở 0 oC trong 30 ngày, chỉ tồn tại trong cơ thể ngƣời trong 7 – 8 ngày. Đặc điểm các phân đoạn gen của virus Virus cúm có hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 – 8 theo thứ tự giảm dần của kích thƣớc phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1. Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tƣơng đối ổn 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn định và có tính bảo thủ cao.

Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trƣng theo từng chủng virus [7].2: Mô hình cấu trúc virus cúm A/H1N1.  Phân đoạn 1 có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PB2. Enzym này có khối lƣợng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2.

 Phân đoạn 2 có kích thƣớc 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym PB1. PB1 có khối lƣợng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus [5]. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein PB1 - F2 đƣợc mã hóa bởi một khung đọc mở khác của phân đoạn 2 [24].  Phân đoạn 3 có kích thƣớc 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA.

PA có khối lƣợng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao.  Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm. Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 có độ dài thay đổi tuỳ 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp.

Protein HA có khối lƣợng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu. Vùng nối giữa HA1 và HA2 là một số amino axít mang tính kiềm đƣợc mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide. Vùng này chứa vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực của virus [11].  Phân đoạn 5 có kích thƣớc khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP).

Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tƣơng tế bào chủ, có khối lƣợng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đối xứng xoắn bền vững.  Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus. Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 – 1410 bp). Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm [31].

 Phân đoạn 7 có kích thƣớc khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M1 và M2 đƣợc dịch mã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus [25]. Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lƣợng phân tử là 11 kDa.