LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của luận án
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
1.3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
1.4. Những đóng góp mới của luận án
1.5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
1.6. Bố cục của luận án
1. CHƢƠNG 1: Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis
1.1. Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira
1.1.1. Phân loại học
1.1.2. Cấu trúc hình thái
1.1.3. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira
1.1.4. Sức đề kháng của mầm bệnh
1.1.5. Tính sinh miễn dịch
1.2. Đặc điểm dịch tễ học
1.3. Đường xâm nhập của mầm bệnh
1.4. Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira
1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis
1.5.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới
1.5.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt Nam
1.6. Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira
1.6.1. Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira
1.6.2. Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira
1.6.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira
1.7. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
1.7.1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên thế giới
1.7.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam
2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
2.1.1. Trang thiết bị
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope
2.2.2. Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira
2.2.3. Tách chiết DNA tổng số
2.2.4. Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số
2.2.5. Thiết kế cặp mồi của gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB
2.2.6. Kỹ thuật PCR
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR
2.2.8. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger
2.2.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và định danh chính xác 5 chủng Leptospira về mặt phân tử
2.2.10. Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định kháng nguyên
2.2.11. Phản ứng gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng
2.2.12. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt
2.2.13. Tách chiết và định lượng DNA plasmid
2.2.14. Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
2.2.15. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn
2.2.16. Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu hiện
2.2.17. Biểu hiện gen đích trong chủng E. Điện di DNA trên gel agarose
2.2.18. Điện di protein trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS-PAGE)
2.2.19. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào
2.2.20. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký protein qua cột ái lực His-bind
2.2.21. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21
2.2.22. Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch
2.2.23. Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21
2.2.24. Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể
2.2.25. Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT)
2.2.26. Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21
2.2.27. Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21
2.2.28. Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác nhau
2.2.29. Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21
2.2.30. Định liều tiêm vắc xin
2.2.31. Quy trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 3
2.2.32. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch
2.2.33. Chế tạo thử nghiệm 600 liều vacxin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis
2.2.34. Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu
2.2.35. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại
3.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số
3.1.3. Nhân gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu
3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
3.1.5. Giải trình tự gen 5 chủng xoắn khuẩn
3.1.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
3.2. Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitop của gen
3.2.1. Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên
3.2.2. Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn
3.3. Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21
3.3.1. Trình tự nucleotit
3.3.2. So sánh trình tự axit amin
3.3.3. Xác định vùng giàu epitop
3.4. Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên và biểu hiện protein LipL21
3.4.1. Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector pJET1.2 trong hệ biểu hiện E.
3.4.2. Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a
3.4.3. Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp LipL21
3.5. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp rLipL21
3.6. Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh Leptospirosis
3.6.1. Xác định chất bổ trợ phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp
3.6.2. Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động vật thí nghiệm
3.7. Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21
3.7.1. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng
3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu an toàn
3.7.3. Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực
3.8. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch trên động vật thí nghiệm
3.9. Sản xuất vắc xin và các đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp rLipL21
3.9.1. Sản xuất 600 liều vắc xin
3.9.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của vacxin theo tiêu chuẩn ngành
3.9.3. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm các loại vi khuẩn và nấm mốc
3.9.4. Kết quả kiểm tra an toàn
3.9.5. Kết quả kiểm tra hiệu lực
4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kiến nghị
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
