Tổng quan luận án

Bệnh Leptospirosis (bệnh xoắn khuẩn) là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây truyền giữa động vật và người, do xoắn khuẩn Gram âm Leptospira interrogans gây ra. Tổ chức Sức khỏe Động vật Thế giới (OIE) xếp bệnh này vào nhóm thứ hai của danh mục các bệnh nguy hiểm, và tại Việt Nam bệnh được đưa vào danh mục bệnh nghề nghiệp. Mầm bệnh lây truyền qua niêm mạc, da trầy xước khi tiếp xúc với nguồn nước hoặc đất bị ô nhiễm bởi nước tiểu của động vật mang khuẩn. Tại Việt Nam, tình hình chăn nuôi nông nghiệp cùng điều kiện vệ sinh môi trường, úng ngập tạo môi trường cho mầm bệnh phát triển. Xoắn khuẩn Leptospira có tính đa dạng kháng nguyên cao với nhiều serogroup và serovar khác nhau; động vật sau khi khỏi bệnh chỉ có miễn dịch đối với đúng chủng huyết thanh đã nhiễm mà không có khả năng bảo hộ chéo hoàn toàn với các chủng khác.

Các loại vắc xin truyền thống gồm vắc xin vô hoạt (bacterin) và vắc xin nhược độc đang được sử dụng bộc lộ nhiều điểm hạn chế: thời gian miễn dịch ngắn (khoảng 6 tháng), hiệu lực bảo hộ chéo giữa các serovar thấp, tiềm ẩn nguy cơ phản ứng phụ hoặc không bảo đảm độ an toàn sinh học. Trước thời điểm nghiên cứu, tại Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis, trong khi dịch tễ thú y ghi nhận ít nhất 5 serovar khác nhau gây bệnh phổ biến trên đàn gia súc. Do đó, khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là xác định gen kháng nguyên bảo tồn xuất hiện chung trên các chủng phân lập tại thực địa và ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để chế tạo vắc xin protein tái tổ hợp đa giá, an toàn, có hiệu lực bảo hộ cao.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:

  1. Xác định một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng trong chế tạo vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis tại Việt Nam.
  2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng và chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 05 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương lưu giữ và cung cấp; hệ thống vector nhân dòng pJET1.2, vector biểu hiện pET32a; các chủng vi khuẩn chỉ thị và biểu hiện gồm Escherichia coli DH10b, E. coli BL21; các động vật thí nghiệm gồm thỏ giống Việt Nam (trọng lượng 2,0 - 2,5 kg), chuột lang (180 - 200 g, 4 - 6 tuần tuổi), chuột nhắt trắng (18 - 20 g, 6 - 8 tuần tuổi) và đàn gia súc tại thực địa.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hệ gen học vi sinh thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO. Luận án được hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu dịch tễ và vi sinh vật học về xoắn khuẩn Leptospira trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Lịch sử nghiên cứu quốc tế: Adolph Weil (1886) lần đầu mô tả triệu chứng lâm sàng thể vàng da cấp tính (Weil’s disease). Do và Inada (1916) phát hiện căn nguyên xoắn khuẩn gây bệnh trên người tại Nhật Bản. Hideyo Noguchi (1917, 1918) phân lập serovar trên chuột hoang tại Mỹ và định danh Leptospira icterohaemorrhagiae.
  • Nghiên cứu dịch tễ học tại Việt Nam: Ragiot và Souchard (1931) ghi nhận ca bệnh xoắn khuẩn đầu tiên trên người. Vaucel (1937) phát hiện các ổ dịch tại Hà Nội, Hải Phòng, Phú Thọ, Tuyên Quang. Viện Pasteur Sài Gòn (1953) phát hiện 30/30 mẫu huyết thanh trâu dương tính (L. Mitis, L. Pomona, L. Canicola) và 29/39 mẫu huyết thanh chó dương tính (L. Bataviae). Đào Trọng Đạt và cs. (1965) xác định tỷ lệ nhiễm trên chó miền Bắc là 25%. Hoàng Mạnh Lâm (2002) khảo sát tại Tây Nguyên (Đắk Lắk) phát hiện serovar mới trên chuột (L. Cellendoni, L. Panama, L. Sejroe, L. Semaranga), trên chó (L. Pyrogenes, L. Mini, L. Javanica) và trên người (L. Sejroe, L. Tarassovi). Wagenaar và cs. ghi nhận 35% người khỏe mạnh và 40% người bị sốt tại Bình Thuận có kháng thể IgM kháng Leptospira. Lý Thị Liên Khai (2012) khảo sát đàn bò sữa, chó, chuột tại Cần Thơ với 6 serogroup phổ biến (L. Bataviae, L. Ballum, L. Pyrogenes, L. Icterohaemorrhagiae...). Hoàng Kim Loan và cs. (2013) ghi nhận tỷ lệ dương tính 4,4% ở người và 7,14% ở gặm nhấm tại miền Nam. Lê Thị Phương Mai (2021) phân lập 17 serovar trên các loài động vật tại Thái Bình, Hà Tĩnh, Cần Thơ; ghi nhận tỷ lệ nhiễm ở trâu tại Thái Bình lên tới 60%, bò 24,9%, lợn 10,2%.
  • Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt và vắc xin tái tổ hợp: Haake và cs. xác định đặc tính porin xuyên màng của OmpL1 (320 axit amin). Dong-jiao Luo và cs. chứng minh protein tái tổ hợp rLipL21 tạo nồng độ kháng thể ở thỏ cao gấp 4 lần so với DNA nguyên bản. Kumari A và cs. (2018) chứng minh kháng nguyên rLipL21 và dạng cắt ngắn rI-LipL21 giúp bảo hộ chuột thí nghiệm đạt tỷ lệ sống 66% và 83% sau công cường độc chủng N2, đồng thời gia tăng các cytokine TNF-α, IFN-γ và IL-10.
  • Tình hình phát triển vắc xin: Trên thế giới đã phát triển vắc xin bất hoạt như vax-SPIRAL (Cuba, đạt hiệu quả 78% sau 11 năm), SPIROLEPT (Sanofi-Pasteur), cùng các vắc xin phối hợp cho chó (Nobivac Lepto, Vanguard Plus 5/L, Duramune Max 5/4L...). Tại Việt Nam có vắc xin vô hoạt 6 chủng của VETVACO (vô hoạt bằng methiolat, thời gian bảo hộ 6 tháng) và vắc xin phối hợp PALATO.VACL của Nanovet.

Vị trí của luận án: Luận án tập trung giải quyết khoảng trống công nghệ tại Việt Nam bằng việc chuyển từ vắc xin tế bào vô hoạt thời gian bảo hộ ngắn sang công nghệ vắc xin protein tái tổ hợp, chọn lọc kháng nguyên LipL21 có tính bảo tồn cao giữa các serovar đang lưu hành trong nước để tạo chế phẩm có khả năng sinh miễn dịch và bảo hộ chéo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Nghiên cứu dựa trên cơ sở sinh học phân tử vi khuẩn học và miễn dịch học:

  1. Phân loại phân tử dựa trên gen chỉ thị 16S rRNA nhằm xác định vị trí phân loại của các chủng vi khuẩn.
  2. Cấu trúc vỏ ngoài của xoắn khuẩn Leptospira: màng ngoài chứa phospholipid, lipopolysaccharide (LPS) và các protein màng ngoài (OMP, lipoprotein bề mặt như LipL21, LipL32, LipL41, OmpL1, LigA, LigB). Protein LipL21 là lipoprotein màng ngoài dồi dào, đóng vai trò ức chế myeloperoxidase, biểu hiện mạnh trong quá trình nhiễm trùng và có các epitope kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể lẫn miễn dịch qua trung gian tế bào (Th1 chiếm ưu thế thông qua IFN-γ, IL-2 và sản sinh IgG2a).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án áp dụng kết hợp các phương pháp sinh học phân tử, tin sinh học, công nghệ protein tái tổ hợp và đánh giá miễn dịch học in vivo:

                      [PCR sàng lọc 6 gen kháng nguyên OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB]
                      [Lựa chọn gen LipL21: Phân tích BioEdit, MEGA6, I-TASSER]
                      [Tối ưu biểu hiện IPTG & Tinh sạch cột ái lực Ni-NTA His-bind]
                      [Kiểm tra miễn dịch: Western blot, Thỏ thử nghiệm, Phản ứng MAT]
                      [Kiểm nghiệm Tiêu chuẩn ngành: Vô trùng, An toàn, Công cường độc in vivo]
                      [Sản xuất Pilot 600 liều & Thử nghiệm thực địa đàn gia súc]
  • Nuôi cấy vi sinh vật: Nuôi cấy 05 chủng Leptospira trong môi trường EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris gồm môi trường cơ sở Difco 2,3 g/900 ml và 10% huyết thanh thỏ), ủ ở 28°C từ 7 - 10 ngày, bổ sung chất ức chế 5-fluorouracil để chống tạp nhiễm. Mật độ vi khuẩn đạt 2×10⁸ tế bào/ml.
  • Tách chiết và phân tích DNA: Sử dụng GeneJET Genomic DNA Purification Kit; kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ Nanodrop và điện di gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide (EtBr).
  • Kỹ thuật PCR: Thực hiện trên máy PCR System 9700. Danh mục các cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm Primer3Plus dựa trên cơ sở dữ liệu NCBI:
TT Gen mục tiêu Trình tự mồi (5' - 3') Kích thước sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp (Tm)
1 16S rRNA F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT		 550 50°C
2 OmpL1 F: TCCGGAGGTGTTACAAAAGC
R: AGTCGTGACTGGATCGGTTC		 273 55°C
3 LipL32 F: TTACCGCTCGAGGTGCTTTCGGTGGTCTGC
R: TGTTAACCCGGGTTACTTAGTCGCGTCAGA		 782 50°C
4 LipL21 F: ATGATCAATAGACTTATAGCTC
R: TTATTGTTTGGAAACCTCTTGA		 560 50°C
5 LipL41 F: TCCCCAAGACTGACCTTTTG
R: ATGGGCAACTGGTAAAGACG		 423 50°C
6 LigA F: CGGTCGACTATCGTTACTCCAGCA
R: CGGCGGCCGCAATATCCGTATTAGA		 991 55°C
7 LigB F: TCAGCAATCGTAAGCGTGTC
R: GCGGAAGTGATGTCCTTGTT		 248 50°C
  • Giải trình tự và Tin sinh học: Giải trình tự Sanger trên máy ABI 3500. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 6. Phân tích độ tương đồng nucleotit, axit amin và xác định vùng giàu epitope bằng phần mềm BioEdit. Dự đoán cấu trúc không gian 3D bằng công cụ I-TASSER và đánh giá độ tương đồng qua chỉ số TM-score.
  • Tạo dòng và biểu hiện gen: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng GeneJET PCR Purification Kit; gắn đoạn gen LipL21 vào vector chọn lọc pJET1.2 (2974 bp), biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt CaCl₂. Tách plasmid bằng phương pháp kiềm SDS (Solution I, II, III). Cắt plasmid tái tổ hợp bằng hai enzyme cắt giới hạn XhoI và EcoRV, tinh sạch đoạn gen qua gel extraction kit và nối vào vector biểu hiện pET32a (5900 bp) bằng T4 DNA ligase. Biến nạp vector pET32a-LipL21 vào tế bào chủ E. coli BL21.
  • Sản xuất và tinh sạch protein: Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG; khảo sát các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG và thời gian cảm ứng. Điện di protein SDS-PAGE nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250. Tinh sạch protein dung hợp rLipL21 qua cột sắc ký ái lực His-bind (Ni-NTA agarose). Định lượng nồng độ protein bằng phương pháp Bradford.
  • Đánh giá miễn dịch học:
    • Gây miễn dịch trên thỏ với các mức liều 100 µg, 250 µg, 500 µg protein rLipL21 phối trộn tá dược Freund hoàn toàn và không hoàn toàn (Freund’s Complete / Incomplete Adjuvant).
    • Kiểm tra tính đặc hiệu bằng phản ứng Western blot trên màng lai PVDF (Hybond-P), sử dụng kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột/thỏ.
    • Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết và phản ứng vi ngưng kết MAT (Microscopic Agglutination Test) với các chủng Leptospira sống.
    • Bào chế vắc xin nhũ dầu bằng máy tạo nhũ L4RT (Silverson - Anh Quốc).
    • Kiểm nghiệm tiêu chuẩn ngành: vô trùng (kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, nấm mốc, Mycoplasma, Salmonella); kiểm tra an toàn trên chuột lang và chuột nhắt trắng; kiểm tra hiệu lực bảo hộ thông qua thử thách công cường độc bằng liều gây chết (LD50) của xoắn khuẩn sống trên mô hình chuột; giải phẫu bệnh lý vi thể đánh giá tổn thương mô học gan và thận.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

Chương 1 tổng thuật chi tiết về đặc điểm sinh học của chi Leptospira: vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, kích thước chiều rộng 0,1 - 0,2 µm, chiều dài 6 - 20 µm, bước xoắn 0,5 µm, di động uyển chuyển quanh trục. Vi khuẩn nhạy cảm với điều kiện khô hạn nhưng có thể tồn tại từ vài tuần đến 180 ngày trong đất ẩm và nước mặt có pH trung tính hoặc hơi kiềm (7,2 - 7,5). Về mặt dịch tễ học, chuột và các loài gặm nhấm hoang dã là vật chủ lưu trữ chính, đào thải xoắn khuẩn liên tục qua nước tiểu; gia súc (trâu, bò, lợn, chó) là vật chủ trung gian gây nhiễm cho người qua tiếp xúc nghề nghiệp hoặc nguồn nước nhiễm khuẩn.

Hệ gen của L. interrogans gồm hai nhiễm sắc thể vòng với tổng kích thước khoảng 4,6 Mb, chứa 35 - 41% G+C. Chương 1 phân tích cơ chế miễn dịch dịch thể (IgM xuất hiện sau 7 ngày, IgG xuất hiện sau 2 - 3 tuần) và vai trò của các protein màng ngoài (OMPs) cùng lipoprotein (LipL21, LipL32, LipL41, LigA, LigB, OmpL1) trong việc bám dính, xâm lấn và tương tác với thụ thể TLR2/TLR4 của hệ miễn dịch vật chủ. Phân tích thực trạng vắc xin cho thấy các vắc xin vi khuẩn vô hoạt thông thường chỉ duy trì bảo hộ khoảng 6 tháng, hạn chế bảo vệ chéo giữa các serovar, khẳng định cơ sở khoa học của việc phát triển vắc xin tái tổ hợp mang kháng nguyên màng ngoài bảo tồn.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm, từ khâu thu thập 05 chủng vi khuẩn L. interrogans tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đến các phương pháp sinh học phân tử, tạo dòng, biểu hiện và kiểm nghiệm vắc xin. Tác giả mô tả chi tiết:

  • Thành phần môi trường EMJH, cách xử lý huyết thanh thỏ tươi vô trùng bằng phương pháp cách thủy 56°C ba lần.
  • Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng cột silica, thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 10 µl chứa 1 µl buffer, 0,2 µl DNA khuôn 100 ng/µl, 0,2 µl mỗi mồi, 0,2 µl Taq polymerase, 0,2 µl dNTPs và 8 µl H₂O).
  • Quy trình tạo dòng với vector pJET1.2 chứa gen enzyme gây chết Eco47IR để loại trừ các dòng không mang đoạn chèn tái tổ hợp.
  • Quy trình cắt chuyển gen LipL21 bằng cặp enzyme XhoI / EcoRV sang vector biểu hiện pET32a mang promoter T7 và đuôi His-tag.
  • Quy trình nuôi cấy cảm ứng E. coli BL21 bằng IPTG, phá tế bào bằng siêu âm, ly tâm tách phân đoạn hòa tan và thể vùi, tinh sạch qua cột ái lực Ni-NTA His-bind.
  • Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin nhũ dầu: phối trộn kháng nguyên rLipL21 với chất bổ trợ dầu khoáng qua máy khuấy nhũ hóa Silverson L4RT, quy trình tiêm thử nghiệm mẫn cảm trên thỏ, phương pháp đọc ngưng kết MAT dưới kính hiển vi nền đen và mô hình công cường độc trên chuột nhắt trắng để tính tỷ lệ sống sót.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Định danh phân tử và cây phát sinh chủng loại

Sản phẩm PCR gen 16S rRNA từ 05 chủng Leptospira nghiên cứu cho một băng điện di đặc hiệu kích thước 550 bp. Kết quả giải trình tự Sanger và so sánh BLAST khẳng định cả 5 chủng đều thuộc loài Leptospira interrogans. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên phần mềm MEGA 6 cho thấy 5 chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhánh tiến hóa với các chủng gây bệnh chuẩn quốc tế.

2. Sàng lọc gen kháng nguyên và phân tích tin sinh học gen LipL21

Khuếch đại 6 gen kháng nguyên (OmpL1, LigA, LigB, LipL21, LipL32, LipL41) trên 5 chủng vi khuẩn. Kết quả xác định gen LipL21 (kích thước 560 bp) xuất hiện ổn định và đồng nhất trên toàn bộ 5 chủng L. interrogans.

  • Phân tích trình tự nucleotit và chuỗi axit amin tương ứng trên phần mềm BioEdit cho thấy mức độ tương đồng trình tự giữa 5 chủng đạt trên 98%.
  • Dự đoán epitope xác định các vùng trình tự peptide giàu tính kháng nguyên, tiếp xúc bề mặt cao.
  • Phân tích cấu trúc không gian 3D bằng công cụ I-TASSER cho thấy mô hình cấu trúc bậc ba của protein LipL21 từ 5 chủng có sự tương đồng hình học với chỉ số TM-score cao, chứng minh tính bảo tồn cấu trúc của kháng nguyên này.

3. Dòng hóa, biểu hiện và tinh sạch protein rLipL21

  • Tạo dòng thành công cấu trúc plasmid tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 trong E. coli DH10b, kết quả giải trình tự xác nhận đoạn chèn 560 bp khớp 100% với trình tự gen đích.
  • Chuyển thành công gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a trong tế bào chủ E. coli BL21.
  • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Khảo sát ở các mức nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng (25°C, 30°C, 37°C), nồng độ chất cảm ứng IPTG (0,2 mM; 0,5 mM; 1,0 mM) và thời gian cảm ứng (2h, 4h, 6h, qua đêm). Điều kiện biểu hiện tối ưu thu được lượng protein rLipL21 hòa tan cao là ở 30°C với 0,5 mM IPTG sau 4 - 6 giờ nuôi cấy.
  • Tinh sạch protein tái tổ hợp rLipL21 qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA agarose; kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy một băng protein đơn nhất ở kích thước dự kiến (bao gồm protein LipL21 dung hợp với đoạn peptide mang đuôi Trx/His-tag của vector pET32a). Nồng độ protein tinh sạch đo bằng phương pháp Bradford đạt tiêu chuẩn phối trộn vắc xin.

4. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên rLipL21

  • Kháng nguyên rLipL21 được tiêm thử nghiệm trên thỏ ở các mức hàm lượng 100 µg, 250 µg và 500 µg. Huyết thanh miễn dịch thu được phản ứng ngưng kết mạnh với kháng nguyên đặc hiệu và cho phản ứng vi ngưng kết MAT dương tính với các chủng Leptospira sống.
  • Phân tích Western blot với kháng thể đặc hiệu xác nhận tính bắt cặp kháng nguyên - kháng thể của băng protein rLipL21.

5. Bào chế, kiểm nghiệm vắc xin và sản xuất quy mô pilot

  • Kháng nguyên rLipL21 được phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu khoáng bằng máy tạo nhũ Silverson L4RT tạo vắc xin tái tổ hợp đồng nhất, ổn định ở liều tiêm 1 ml và 2 ml.
  • Kiểm nghiệm chất lượng theo tiêu chuẩn ngành:
    • Vô trùng: Kiểm tra không có tạp nhiễm vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí, nấm mốc, Mycoplasma và Salmonella.
    • An toàn: Tiêm trên động vật thí nghiệm (chuột lang, chuột nhắt trắng) không gây ra triệu chứng bất thường, không làm chết động vật thí nghiệm.
    • Hiệu lực bảo hộ: Thử nghiệm công cường độc trên chuột nhắt trắng bằng chủng Leptospira độc lực sống liều LD50: nhóm tiêm vắc xin rLipL21 có tỷ lệ sống sót cao vượt trội so với nhóm đối chứng chết 100%. Kết quả mô bệnh học khẳng định cấu trúc vi thể của gan và thận ở nhóm chuột được tiêm vắc xin không bị tổn thương, hoại tử hay xuất huyết nghiêm trọng.
  • Sản xuất pilot: Sản xuất thử nghiệm thành công 600 liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu. Vắc xin đạt toàn bộ các chỉ tiêu kiểm nghiệm vô trùng, an toàn, hiệu lực và bước đầu được tiêm thử nghiệm trên đàn gia súc tại một số địa phương, ghi nhận độ an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch tốt.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Chương 4 đúc kết các phát hiện chính của công trình và đề xuất các định hướng ứng dụng thực tế tiếp theo.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Xây dựng bộ dữ liệu phân tử chi tiết về đặc tính gen và mức độ bảo tồn của 6 gen quyết định kháng nguyên bề mặt (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB) trên các chủng Leptospira interrogans gây bệnh phân lập tại Việt Nam.
  2. Xác định gen LipL21 là kháng nguyên bảo tồn, phân tích trình tự phân tử, dự đoán các vùng giàu epitope có tính sinh miễn dịch cao và mô phỏng cấu trúc không gian 3D của protein LipL21.
  3. Tạo dòng và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rLipL21 dạng hòa tan trong hệ thống biểu hiện E. coli BL21 sử dụng vector pET32a, chứng minh khả năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu có hoạt tính ngưng kết và bảo hộ chống lại mầm bệnh sống.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Hoàn thiện quy trình công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis nhũ dầu từ khâu biểu hiện gen, tinh sạch kháng nguyên đến phối trộn tá dược đạt các chỉ tiêu kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn ngành của Việt Nam.
  2. Lần đầu tiên chế tạo thử nghiệm thành công 600 liều vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh Leptospirosis ở quy mô pilot.
  3. Chế phẩm vắc xin pilot đạt các tiêu chuẩn kiểm nghiệm về độ vô trùng, an toàn và hiệu lực bảo hộ trên mô hình động vật thí nghiệm và đàn gia súc thực địa.

Kiến nghị

  • Hoàn thiện thủ tục chuyển giao quy trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 cho Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO để triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp, phục vụ công tác phòng chống dịch bệnh cho đàn vật nuôi tại Việt Nam.
  • Tiếp tục theo dõi, đánh giá thời gian duy trì miễn dịch bảo hộ kéo dài của vắc xin rLipL21 trên đàn gia súc thực địa ở diện rộng.
  • Nghiên cứu phát triển vắc xin tái tổ hợp đa giá phối hợp kháng nguyên LipL21 với các kháng nguyên màng ngoài tiềm năng khác (như OmpL1, LigA, LipL32) nhằm tăng cường hiệu giá kháng thể và mở rộng phổ bảo hộ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Luận án tập trung sàng lọc và phân tích trên 05 chủng Leptospira interrogans được lưu giữ tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương; chưa bao phủ toàn bộ 17 serovar từng được ghi nhận rải rác ngoài thực địa tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.
    • Thử nghiệm thực địa của lô pilot 600 liều mới thực hiện ở quy mô đàn động vật tại một số địa phương trong thời gian theo dõi của đề tài, chưa có số liệu đánh giá động thái kháng thể trong nhiều năm liên tục.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng thử nghiệm vắc xin trên nhiều loài gia súc khác nhau (trâu, bò sữa, lợn, chó) tại nhiều vùng dịch tễ trọng điểm.
    • Tối ưu hóa quy trình lên men quy mô công nghiệp lớn để nâng cao hiệu suất thu hồi protein hòa tan và hạ giá thành sản xuất.
    • Nghiên cứu tạo chế phẩm vắc xin cộng hợp đa kháng nguyên (chimera) hoặc vắc xin đa giá kết hợp nhiều protein màng ngoài.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo trong các lĩnh vực:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Miễn dịch học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn về thiết kế mồi, phân tích tin sinh học epitope kháng nguyên, tạo dòng plasmid chọn lọc pJET1.2, tối ưu hóa biểu hiện protein ngoại lai khó tan trong vector pET32a, kỹ thuật tinh sạch ái lực Ni-NTA His-bind và kỹ thuật Western blot.
  • Cán bộ nghiên cứu Thú y và Y tế dự phòng: Cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử của xoắn khuẩn Leptospira, phương pháp xét nghiệm ngưng kết vi thể MAT và mô hình gây nhiễm công cường độc in vivo trên động vật thí nghiệm.
  • Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm và vắc xin thú y: Cung cấp quy trình công nghệ chế tạo vắc xin nhũ dầu bằng thiết bị nhũ hóa Silverson L4RT cùng hệ thống tiêu chí kiểm nghiệm chất lượng (vô trùng, an toàn, hiệu lực) làm cơ sở cho việc nâng cấp quy mô sản xuất công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao gen LipL21 được lựa chọn làm kháng nguyên mục tiêu để sản xuất vắc xin thay vì các gen khác như OmpL1, LipL32, LipL41, LigA, LigB?

Kết quả sàng lọc PCR 6 gen kháng nguyên trên 5 chủng L. interrogans nghiên cứu cho thấy gen LipL21 xuất hiện ổn định và đồng nhất trên toàn bộ 5 chủng với độ tương đồng trình tự nucleotit và axit amin đạt trên 98%. Phân tích tin sinh học xác nhận LipL21 có cấu trúc không gian bảo tồn cao (chỉ số TM-score cao) và chứa nhiều vùng epitope tiếp xúc bề mặt có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch chéo mạnh.

2. Hệ thống vector và tế bào chủ nào đã được sử dụng để dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp rLipL21?

Nghiên cứu sử dụng vector nhân dòng chọn lọc pJET1.2 (kích thước 2974 bp, mang gen enzyme gây chết Eco47IR để sàng lọc thể tái tổ hợp) trong tế bào khả biến E. coli DH10b. Để biểu hiện protein, đoạn gen LipL21 được cắt bằng cặp enzyme XhoI / EcoRV và gắn vào vector biểu hiện pET32a (5900 bp, mang T7 promoter và đuôi His-tag/Trx-tag), sau đó biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21.

3. Điều kiện tối ưu để thu được lượng protein rLipL21 biểu hiện ở dạng hòa tan là gì?

Qua khảo sát thực nghiệm các thông số nuôi cấy cảm ứng, điều kiện tối ưu được xác định là: nhiệt độ nuôi cấy 30°C, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM, thời gian thu hoạch sau cảm ứng từ 4 đến 6 giờ. Điều kiện này giúp hạn chế tạo thể vùi không tan và tối ưu hóa lượng protein rLipL21 hòa tan trong dịch chiết tế bào để tinh sạch qua cột Ni-NTA.

4. Kết quả kiểm nghiệm hiệu lực bảo hộ của vắc xin rLipL21 trên mô hình chuột thí nghiệm như thế nào?

Khi thử thách công cường độc bằng xoắn khuẩn Leptospira sống liều gây chết LD50 trên chuột nhắt trắng, nhóm chuột được tiêm vắc xin rLipL21 có tỷ lệ sống sót cao vượt trội, trong khi nhóm đối chứng không tiêm vắc xin chết 100%. Đánh giá mô bệnh học vi thể cho thấy nhu mô gan và thận của nhóm chuột tiêm vắc xin được bảo vệ nguyên vẹn, không xuất hiện các biến đổi bệnh lý hoại tử hay xuất huyết do xoắn khuẩn gây ra.

5. Quy mô chế tạo thử nghiệm của luận án đạt bao nhiêu liều và quy trình kiểm nghiệm chất lượng gồm những chỉ tiêu nào?

Luận án đã chế tạo thử nghiệm thành công 600 liều vắc xin nhũ dầu tái tổ hợp rLipL21 ở quy mô pilot. Chế phẩm vắc xin được kiểm nghiệm đạt các tiêu chuẩn ngành của Việt Nam bao gồm: chỉ tiêu vô trùng (âm tính với vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, nấm mốc, Mycoplasma, Salmonella), chỉ tiêu an toàn trên chuột lang và chuột nhắt trắng, và chỉ tiêu hiệu lực thông qua phản ứng vi ngưng kết MAT và thử thách công cường độc in vivo.

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Tuấn Hùng đã giải quyết thành công bài toán xác định kháng nguyên bảo tồn và chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam. Bằng phương pháp tiếp cận sinh học phân tử kết hợp công nghệ biểu hiện gen trên E. coli BL21, tác giả đã thu nhận được protein rLipL21 có tính kháng nguyên cao, xây dựng hoàn chỉnh quy trình sản xuất vắc xin nhũ dầu và sản xuất thành công 600 liều vắc xin quy mô pilot đạt đầy đủ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vô trùng, an toàn và hiệu lực bảo hộ in vivo. Kết quả của công trình là luận cứ khoa học và công nghệ thực tiễn để chuyển giao cho Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO phục vụ sản xuất công nghiệp vắc xin phòng bệnh Leptospirosis cho đàn vật nuôi.