Luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn leptospira interrogans gây ra

Luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn leptospira interrogans, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

• Tác giả: Nguyễn Tuấn Hùng
• Người hướng dẫn: PTS. Võ Thị Bích Thủy
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
• 1.3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
• 1.4. Những đóng góp mới của luận án
• 1.5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
• 1.6. Bố cục của luận án
• 1. CHƢƠNG 1: Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis
• 1.1. Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira
• 1.1.1. Phân loại học
• 1.1.2. Cấu trúc hình thái
• 1.1.3. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira
• 1.1.4. Sức đề kháng của mầm bệnh
• 1.1.5. Tính sinh miễn dịch
• 1.2. Đặc điểm dịch tễ học
• 1.3. Đường xâm nhập của mầm bệnh
• 1.4. Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira
• 1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis
• 1.5.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới
• 1.5.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt Nam
• 1.6. Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira
• 1.6.1. Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira
• 1.6.2. Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira
• 1.6.3. Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira
• 1.7. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên thế giới
• 1.7.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam
• 2. CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
• 2.1.1. Trang thiết bị
• 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope
• 2.2.2. Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira
• 2.2.3. Tách chiết DNA tổng số
• 2.2.4. Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số
• 2.2.5. Thiết kế cặp mồi của gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB
• 2.2.6. Kỹ thuật PCR
• 2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.2.8. Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger
• 2.2.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và định danh chính xác 5 chủng Leptospira về mặt phân tử
• 2.2.10. Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định kháng nguyên
• 2.2.11. Phản ứng gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng
• 2.2.12. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.2.13. Tách chiết và định lượng DNA plasmid
• 2.2.14. Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
• 2.2.15. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn
• 2.2.16. Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu hiện
• 2.2.17. Biểu hiện gen đích trong chủng E. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.18. Điện di protein trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS-PAGE)
• 2.2.19. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào
• 2.2.20. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký protein qua cột ái lực His-bind
• 2.2.21. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21
• 2.2.22. Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch
• 2.2.23. Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21
• 2.2.24. Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể
• 2.2.25. Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test: MAT)
• 2.2.26. Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21
• 2.2.27. Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21
• 2.2.28. Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp rLipL21 khác nhau
• 2.2.29. Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21
• 2.2.30. Định liều tiêm vắc xin
• 2.2.31. Quy trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 3
• 2.2.32. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch
• 2.2.33. Chế tạo thử nghiệm 600 liều vacxin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis
• 2.2.34. Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu
• 2.2.35. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
• 3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 3.1.1. Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn
• 3.1.2. Tách chiết DNA tổng số
• 3.1.3. Nhân gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu
• 3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
• 3.1.5. Giải trình tự gen 5 chủng xoắn khuẩn
• 3.1.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 3.2. Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu epitop của gen
• 3.2.1. Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên
• 3.2.2. Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn
• 3.3. Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21
• 3.3.1. Trình tự nucleotit
• 3.3.2. So sánh trình tự axit amin
• 3.3.3. Xác định vùng giàu epitop
• 3.4. Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên và biểu hiện protein LipL21
• 3.4.1. Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector pJET1.2 trong hệ biểu hiện E.
• 3.4.2. Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a
• 3.4.3. Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp LipL21
• 3.5. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp rLipL21
• 3.6. Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh Leptospirosis
• 3.6.1. Xác định chất bổ trợ phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp
• 3.6.2. Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động vật thí nghiệm
• 3.7. Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21
• 3.7.1. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng
• 3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu an toàn
• 3.7.3. Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực
• 3.8. Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch trên động vật thí nghiệm
• 3.9. Sản xuất vắc xin và các đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp rLipL21
• 3.9.1. Sản xuất 600 liều vắc xin
• 3.9.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của vacxin theo tiêu chuẩn ngành
• 3.9.3. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm các loại vi khuẩn và nấm mốc
• 3.9.4. Kết quả kiểm tra an toàn
• 3.9.5. Kết quả kiểm tra hiệu lực
• 4. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. Kiến nghị
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospira interrogans

Bệnh Leptospirosis, do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp nhằm tạo ra giải pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh này. Việc phát triển vắc xin không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng mà còn giảm thiểu thiệt hại kinh tế do dịch bệnh gây ra.

1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

Xoắn khuẩn Leptospira có hình dạng đặc trưng và khả năng sống sót lâu trong môi trường. Bệnh Leptospirosis lây truyền qua tiếp xúc với nước hoặc đất ô nhiễm, gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng.

1.2. Tình hình dịch tễ học bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

Tình hình dịch tễ học cho thấy bệnh Leptospirosis đang gia tăng tại Việt Nam, đặc biệt ở các vùng nông thôn. Việc nghiên cứu và phát triển vắc xin là cần thiết để kiểm soát dịch bệnh.

II. Thách thức trong việc phát triển vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospira

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu vắc xin, nhưng việc phát triển vắc xin tái tổ hợp vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như tính an toàn, hiệu quả và chi phí sản xuất cần được giải quyết để đảm bảo vắc xin có thể được sử dụng rộng rãi.

2.1. Vấn đề an toàn trong sản xuất vắc xin

An toàn là yếu tố quan trọng trong phát triển vắc xin. Cần đảm bảo rằng vắc xin không gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng cho người và động vật.

2.2. Chi phí sản xuất và khả năng tiếp cận vắc xin

Chi phí sản xuất vắc xin tái tổ hợp cần được tối ưu hóa để đảm bảo khả năng tiếp cận cho người dân, đặc biệt là ở các vùng nông thôn.

III. Phương pháp nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospira

Nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định và phát triển các gen quyết định kháng nguyên. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy, tách chiết DNA và biểu hiện protein tái tổ hợp.

3.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp từ gen LipL21

Gen LipL21 được chọn làm ứng cử viên cho việc tạo kháng nguyên tái tổ hợp. Quá trình này bao gồm việc nhân dòng gen vào vector và biểu hiện trong tế bào E. coli.

3.2. Kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên

Sau khi sản xuất protein tái tổ hợp, cần tiến hành kiểm tra tính sinh miễn dịch để đánh giá khả năng tạo kháng thể của vắc xin.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của vắc xin tái tổ hợp

Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin tái tổ hợp có khả năng tạo miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin truyền thống. Việc ứng dụng vắc xin này trong thực tiễn sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis.

4.1. Đánh giá hiệu quả của vắc xin trên động vật thí nghiệm

Các thử nghiệm trên động vật cho thấy vắc xin tái tổ hợp rLipL21 có hiệu quả cao trong việc phòng ngừa bệnh Leptospirosis.

4.2. Triển khai vắc xin trong cộng đồng

Việc triển khai vắc xin trong cộng đồng cần được thực hiện đồng bộ với các biện pháp giáo dục sức khỏe để nâng cao nhận thức về bệnh Leptospirosis.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu vắc xin Leptospira

Nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do Leptospira interrogans gây ra mở ra nhiều triển vọng trong việc kiểm soát bệnh Leptospirosis. Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất và nâng cao hiệu quả của vắc xin.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực vắc xin

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa công thức vắc xin và đánh giá hiệu quả lâu dài của vắc xin trong cộng đồng.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu quốc tế

Hợp tác nghiên cứu quốc tế sẽ giúp chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm, từ đó thúc đẩy nhanh chóng quá trình phát triển vắc xin hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh xoắn khuẩn (Leptospirosis) do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính lây truyền từ động vật sang người (Zoonosis) nguy hiểm và phổ biến trên toàn cầu. Theo báo cáo dịch tễ học quốc tế, bệnh xoắn khuẩn "được Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam". Với hơn 500.000 ca nhiễm lâm sàng nặng và tỷ lệ tử vong vượt mức 10% mỗi năm trên thế giới, mầm bệnh đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng lẫn ngành chăn nuôi gia súc sinh sản. Tại Việt Nam, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tình trạng ngập úng định kỳ cùng hệ thống chăn nuôi nông hộ xen kẽ tạo điều kiện lý tưởng cho sự lưu hành phức tạp của hơn 17 serovar Leptospira khác nhau trên trâu, bò, lợn và chó.

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) cốt lõi xuất phát từ sự bất cập của các thế hệ vắc xin truyền thống. Các vắc xin vi khuẩn bất hoạt (Bacterin) phổ biến như vax-SPIRAL (Cuba) hay các dòng vắc xin vô hoạt 6 chủng của Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO chỉ tạo được thời gian bảo hộ ngắn (khoảng 6 tháng), yêu cầu tiêm nhắc lại nhiều lần và quan trọng nhất là hoàn toàn thiếu khả năng bảo vệ chéo (Cross-protection) giữa hơn 260 serovar thuộc 24 serogroup khác nhau. Trong khi đó, vắc xin sống giảm độc lực lại tiềm ẩn nguy cơ phục hồi độc lực và gây phản ứng phụ tự miễn nghiêm trọng. Tính đến thời điểm thực hiện nghiên cứu, Việt Nam hoàn toàn chưa có quy trình công nghệ nào sản xuất vắc xin tái tổ hợp nhắm vào các kháng nguyên bảo tồn chung.

Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học của nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hùng (2022) với đề tài "Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra" (mã số 9420201) đã giải quyết toàn diện khoảng trống trên thông qua các câu hỏi và giả thuyết khoa học xác định:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Trong số các gen mã hóa protein màng ngoài (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB), gen nào bảo tồn tuyệt đối trên các chủng Leptospira interrogans lưu hành thực địa tại Việt Nam?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Protein tái tổ hợp rLipL21 biểu hiện trong hệ thống sinh vật nhân sơ Escherichia coli có giữ nguyên cấu trúc không gian 3D, các cụm epitope và kích hoạt được đáp ứng miễn dịch dịch thể lẫn tế bào đặc hiệu hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Công thức vắc xin rLipL21 phối trộn nhũ dầu có đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vô trùng, an toàn, hiệu lực bảo hộ in vivo và khả năng mở rộng sản xuất ở quy mô pilot 600 liều hay không?

Tương ứng với các câu hỏi trên, hai giả thuyết chính được kiểm chứng:

• Giả thuyết 1 (H1): Kháng nguyên lipoprotein màng ngoài LipL21 là yếu tố độc lực bảo tồn cao nhất, chứa mật độ epitope tế bào B/T dày đặc, không bị biến đổi cấu trúc giữa các serovar phân lập tại Việt Nam.
• Giả thuyết 2 (H2): Kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 dung hợp khóa His-tag khi được tối ưu hóa biểu hiện và nhũ hóa với tá dược dầu khoáng sẽ kích thích sinh hiệu giá kháng thể ngưng kết cao, bảo hộ chuột thí nghiệm sống sót 100% trước liều công cường độc gây chết.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên thuyết Miễn dịch học Đảo ngược (Reverse Vaccinology) của Rino Rappuoli kết hợp với lý thuyết Kháng nguyên học Cấu trúc (Structural Vaccinology) và thuyết Miễn dịch Th1/Th2 phân cực. Luận án thực hiện trên phạm vi 5 chủng xoắn khuẩn phân lập đại diện (L. Canicola, L. Icterohaemorrhagiae, L. Pomona, L. Bataviae, L. Grippotyphosa), tiến hành sàng lọc trên thỏ New Zealand (2,0–2,5 kg), chuột lang (180–200 g), chuột nhắt trắng (18–20 g) và kiểm chứng thực địa trên đàn gia súc thông qua mẻ sản xuất pilot 600 liều tiêu chuẩn.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu bệnh xoắn khuẩn ghi nhận các mốc quan trọng từ khi Adolph Weil (1886) mô tả hội chứng vàng da cấp tính, tiếp nối bởi Inada và Ido (1916) phân lập thành công tác nhân vi khuẩn tại Nhật Bản, và Noguchi (1917, 1918) xác lập danh pháp Leptospira icterohaemorrhagiae. Trong suốt thế kỷ 20, các nghiên cứu dịch tễ học kinh điển tập trung vào phương pháp phân loại huyết thanh học dựa trên phản ứng ngưng kết vi thể (Microscopic Agglutination Test - MAT), định danh hơn 260 serovar.

Trong y văn thế giới, cuộc tranh luận học thuật sâu sắc diễn ra giữa hai trường phái phát triển vắc xin:

1. Trường phái vắc xin tế bào nguyên vẹn (Whole-cell Bacterin): Đại diện bởi các chế phẩm thương mại như SPIROLEPT (Sanofi-Pasteur) và vax-SPIRAL (Cuba). Mặc dù vax-SPIRAL đạt hiệu quả bảo hộ dịch tễ 78% qua 11 năm giám sát tại Cuba, các công trình của Adler và de la Peña Moctezuma (2010) đã chỉ ra nhược điểm chí mạng: thành phần lipopolysaccharide (LPS) kích thích miễn dịch phụ thuộc serovar ngắn hạn, không tạo trí nhớ miễn dịch chéo và mang nội độc tố gây sốt, áp-xe cục bộ.
2. Trường phái vắc xin tái tổ hợp tiểu phần (Recombinant Subunit Vaccine): Nổi lên mạnh mẽ từ thập niên 1990 khi Haake và cộng sự (1993, 1999) giải mã porin xuyên màng OmpL1 (31 kDa) và lipoprotein LipL41. Tiếp đó, Palaniappan và cộng sự (2002) phát hiện các protein tương tự globulin miễn dịch LigA/LigB. Tuy nhiên, rOmpL1 và rLigA bộc lộ sự đa hình di truyền lớn giữa các phân lập thực địa, làm suy giảm hiệu lực bảo vệ chéo diện rộng.

Vị trí của luận án được định vị chính xác tại điểm giao thoa giữa hệ thống phân loại gen học và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Nhận thấy sự hạn chế của OmpL1 và LigA, luận án tập trung sâu vào lipoprotein màng ngoài LipL21 (21 kDa) - một yếu tố độc lực giữ vai trò ức chế myeloperoxidase trong bạch cầu trung tính của vật chủ.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

• Nghiên cứu của Dong-jiao Luo và cộng sự tại Trung Quốc đã chứng minh: "tiêm protein tái tổ hợp rLipL21 cho thỏ, kết quả cho thấy mức độ sinh kháng thể cao gấp 4 lần so với dạng vắc xin sử dụng gen LipL21 nguyên bản".
• Nghiên cứu đột phá của Kumari A và cộng sự (2018) trên mô hình động vật khẳng định: "khả năng miễn dịch bảo hộ của protein tái tổ hợp rLipL21 và dạng cắt ngắn của nó I-LipL21 (rI-LipL21). Kết quả cho thấy, sau khi công cường độc bằng chủng Leptospiral N2, tỷ lệ chuột tiêm vắc xin sống sót lần lượt là 66% và 83% tương ứng với rLipL21 và rI-LipL21, trong khi đó, nhóm đối chứng chết 100%".

Luận án của NCS. Nguyễn Tuấn Hùng đã kế thừa các thành tựu trên, nhưng tiến xa hơn một bước mang tính bản địa hóa quyết định: kiểm tra sự hiện diện đồng thời của 6 locus gen kháng nguyên trên các chủng phân lập tại Việt Nam, chứng minh LipL21 là gen duy nhất hiện diện ổn định 100%, từ đó thiết lập quy trình biểu hiện nồng độ cao và nhũ hóa tá dược dầu khoáng đạt độ bảo hộ tuyệt đối in vivo.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào lý thuyết Miễn dịch học Phân tử và Bệnh sinh Vi khuẩn thông qua ba luận điểm nền tảng:

1. Mở rộng lý thuyết Kháng nguyên Màng ngoài Xoắn khuẩn: Công trình củng cố mô hình cấu trúc màng kép của Leptospira, xác nhận LipL21 là lipoprotein gắn màng ngoài phong phú bậc nhất, đóng vai trò then chốt trong tương tác ký chủ - mầm bệnh. Bằng chứng giải trình tự khẳng định tính bảo tồn tuyệt đối của trình tự nucleotit và axit amin gen LipL21 (560 bp) giữa các serovar dị đồng kháng nguyên bề mặt.
2. Làm sáng tỏ cơ chế điều hòa miễn dịch qua trung gian LipL21: LipL21 không chỉ là một kháng nguyên cấu trúc đơn thuần mà còn là chất ức chế men myeloperoxidase, ngăn chặn quá trình oxy hóa tiêu diệt vi khuẩn của thực bào. Việc tạo ra kháng thể đặc hiệu kháng rLipL21 giúp vô hiệu hóa hoạt tính ức chế này, tái kích hoạt phản ứng opsonin hóa và thực bào qua thụ thể Fc.
3. Chuyển đổi hình thái đáp ứng miễn dịch (Paradigm Shift): Khắc phục định kiến cho rằng miễn dịch chống Leptospira chỉ phụ thuộc vào kháng thể kháng LPS (chủ yếu là IgM ngắn hạn). Luận án chứng minh kháng nguyên tiểu phần protein rLipL21 kích thích chọn lọc dòng tế bào Th1, giải phóng nồng độ cao IFN-γ, kích hoạt sản xuất kháng thể IgG2a bền vững và hình thành tế bào B nhớ lâu dài.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa Tin sinh học (Bioinformatics), Di truyền học Phân tử (Molecular Genetics) và Kỹ thuật Miễn dịch Ứng dụng (Applied Immunotechnology) qua 4 trụ cột logic:

• Trụ cột 1: Phân tích phát sinh loài & Khảo sát đa hình gen: Sử dụng công cụ BLAST, PSI-BLAST và thuật toán MEGA6 trên trình tự 16S rRNA và 6 gen kháng nguyên (OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB).
• Trụ cột 2: Dự đoán Epitope & Mô hình hóa Không gian 3D: Khai thác phần mềm BioEdit, I-TASSER và điểm số TM-score để phân tích các cụm axit amin ưa nước, có tính kháng nguyên cao trên chuỗi polypeptide của LipL21.
• Trụ cột 3: Kỹ thuật Tái tổ hợp & Tối ưu hóa Biểu hiện: Thiết kế hệ thống tái tổ hợp hai bước sử dụng vector nhân dòng pJET1.2/blunt và vector biểu hiện pET-32a(+) trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3), kiểm soát biểu hiện bởi promoter T7 và chất cảm ứng IPTG.
• Trụ cột 4: Thẩm định Miễn dịch Đa tầng (Multi-tier Immunological Validation): Kết hợp phân tích Western Blot, chuẩn độ kháng thể ngưng kết (MAT), thử nghiệm độc tính in vivo và đánh giá mô bệnh học lát cắt cơ quan gan - thận.

Điều kiện biên (Boundary conditions) của khung phân tích được xác lập chặt chẽ: áp dụng chuyên biệt cho các loài xoắn khuẩn thuộc phân nhóm gây bệnh (L. interrogans sensu stricto), không bao gồm các loài hoại sinh (L. biflexa) vốn không mang gen mã hóa protein độc lực LipL21.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu theo đuổi triết lý thực chứng hậu thực nghiệm (Post-positivism) với thiết kế thực nghiệm can thiệp có đối chứng (Controlled Laboratory and Field Experimental Design). Quy trình thực hiện đa tầng từ mức độ gen phân tử, cấu trúc protein, đáp ứng tế bào động vật thí nghiệm đến thử nghiệm thực địa quy mô bầy đàn.

Kích thước mẫu và vật liệu sinh học chuẩn mực:

• 05 chủng xoắn khuẩn chuẩn: Leptospira interrogans các serovar Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Bataviae, Grippotyphosa được cung cấp bởi Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
• Hệ thống tế bào chủ: E. coli DH10b dùng trong tạo dòng plasmid trung gian và E. coli BL21(DE3) dùng trong biểu hiện sinh khối protein.
• Động vật thử nghiệm: Thỏ New Zealand khỏe mạnh (2,0–2,5 kg); 60 chuột lang (180–200 g, 4–6 tuần tuổi); 120 chuột nhắt trắng Swiss (18–20 g, 6–8 tuần tuổi) nuôi dưỡng tại khu động vật sạch mầm bệnh của Công ty VETVACO.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm tuân thủ các quy chuẩn thao tác chuẩn (SOP) quốc tế nghiêm ngặt:

• Nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường lỏng Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) bổ sung 10% huyết thanh thỏ tươi bất hoạt nhiệt (56°C trong 30 phút, lọc vô trùng), duy trì ở 28°C trong 7–10 ngày đến khi mật độ đạt $2 \times 10^8$ vi khuẩn/ml. Bổ sung kháng sinh chọn lọc 5-fluorouracil để triệt tiêu tạp nhiễm.
• Tách chiết DNA & Khuếch đại gen: Sử dụng kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Thiết kế mồi xuôi/ngược đặc hiệu qua Primer3Plus cho gen 16S rRNA (550 bp, Tm 50°C), OmpL1 (273 bp, Tm 55°C), LipL32 (782 bp, Tm 50°C), LipL21 (560 bp, Tm 50°C, Forward: 5'-ATGATCAATAGACTTATAGCTC-3', Reverse: 5'-TTATTGTTTGGAAACCTCTTGA-3'), LipL41 (423 bp, Tm 50°C), LigA (991 bp, Tm 55°C) và LigB (248 bp, Tm 50°C).
• Giải trình tự Sanger & Tạo dòng phân tử: Phản ứng chuỗi Sanger trên máy ABI 3500. Đoạn gen LipL21 sau tinh sạch được xử lý tạo đầu bằng, gắn vào vector pJET1.2/blunt (2974 bp) bằng T4 DNA Ligase, biến nạp vào E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt ($42^\circ\text{C}$ trong 45 giây). Sàng lọc khuẩn lạc kháng ampicillin (100 µg/ml) và kiểm tra bằng colony-PCR.
• Biểu hiện & Tinh sạch Kháng nguyên: Tách chiết plasmid tái tổ hợp, cắt đồng thời bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và EcoRV, gắn đoạn chèn vào vector biểu hiện pET-32a(+) (5900 bp) mang đuôi polyhistidine ($6\times\text{His-tag}$). Biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3). Cảm ứng sinh tổng hợp protein bằng IPTG ở các dải nồng độ (0,2–1,0 mM), nhiệt độ nuôi cấy ($25^\circ\text{C}$, $30^\circ\text{C}$, $37^\circ\text{C}$) và thời gian cảm ứng (2, 4, 6, 8 giờ). Thu nhận sinh khối, siêu âm phá vỡ màng tế bào, ly tâm thu dịch nổi và tinh sạch qua cột sắc ký ái lực kim loại cố định Ni-NTA His-bind agarose.

Data và phân tích

• Phân tích Điện di & Định lượng Protein: Sản phẩm DNA được phân tích trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide (0,5 µg/ml). Sản phẩm biểu hiện protein được điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12%, nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250. Định lượng protein bằng phương pháp đo màu Bradford ở bước sóng 595 nm dựa trên đường chuẩn BSA.
• Xác định tính sinh miễn dịch & Độ nhạy Western Blot: Gây miễn dịch cho thỏ bằng protein rLipL21 tinh sạch phối trộn tá dược Freund hoàn toàn (lần 1) và không hoàn toàn (lần 2, 3). Huyết thanh thỏ được thẩm tách và lai miễn dịch Western Blot trên màng PVDF sử dụng kháng thể thứ cấp anti-rabbit IgG liên hợp enzyme phosphatase kiềm, hiện màu bằng cơ chất BCIP/NBT.
• Kỹ thuật Phản ứng Vi ngưng kết (MAT): Chuẩn độ kháng thể kháng xoắn khuẩn sống của 5 chủng L. interrogans với các dãy pha loãng huyết thanh bậc 2 từ 1:10 đến 1:12.800. Đọc phản ứng dưới kính hiển vi huỳnh quang nền đen ở độ phóng đại $\times 400$.
• Đánh giá Công thức Vắc xin Pilot: Phối trộn kháng nguyên rLipL21 với tá dược nhũ dầu khoáng theo tỷ lệ thể tích tối ưu bằng máy tạo nhũ đồng hóa tốc độ cao Silverson L4RT (Anh Quốc). Kiểm tra các chỉ tiêu theo Tiêu chuẩn ngành: vô trùng vi khuẩn/nấm mốc, an toàn trên chuột lang và hiệu lực bảo hộ in vivo sau khi công liều độc $10 \times \text{LD}_{50}$ của chủng cường độc.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Khẳng định tính phổ quát duy nhất của gen LipL21 tại Việt Nam: Khảo sát PCR trên 5 chủng L. interrogans thực địa chỉ ra rằng các gen OmpL1, LipL32, LipL41, LigA, LigB chỉ xuất hiện rải rác trên một số chủng nhất định. Riêng gen LipL21 (560 bp) xuất hiện đồng nhất 100% trên cả 5 chủng. Trình tự nucleotit và chuỗi 186 axit amin dự đoán của LipL21 đạt độ tương đồng 99,5–100% so với cơ sở dữ liệu GenBank, chứa 3 vùng giàu epitope liên kết kháng thể bền vững.
2. Thiết lập thông số biểu hiện tối ưu cho rLipL21: Protein tái tổ hợp pET32a-LipL21 được biểu hiện thành công ở dạng hòa tan trong E. coli BL21(DE3) với kích thước phân tử lý thuyết 39,5 kDa (bao gồm 21 kDa của LipL21 và 18,5 kDa đoạn peptide dung hợp Trx-tag/His-tag). Điều kiện cảm ứng tối ưu được xác định chính xác tại: nồng độ IPTG 0,6 mM, nhiệt độ nuôi cấy $30^\circ\text{C}$ và thời gian cảm ứng 6 giờ, cho hàm lượng protein tinh sạch đạt trên 85 mg/lít dịch nuôi cấy sau khi qua cột sắc ký Ni-NTA.
3. Hiệu giá kháng thể MAT vượt trội: Huyết thanh miễn dịch tạo ra từ rLipL21 biểu hiện hoạt tính ngưng kết chéo mạnh mẽ với cả 5 chủng L. interrogans sống. Ở các hàm lượng kháng nguyên 100 µg, 250 µg và 500 µg tiêm cho thỏ, hiệu giá kháng thể MAT đạt đỉnh ở mức 1:3.200 đến 1:6.400 sau mũi tiêm thứ ba, cao gấp 4 lần so với lô chứng tiêm lysate tế bào tự nhiên.
4. Hiệu lực bảo hộ 100% trước thử thách cường độc: Động vật thí nghiệm được tiêm 2 mũi vắc xin rLipL21 nhũ dầu (liều 1,0 ml và 2,0 ml chứa 50 µg protein/liều) đạt tỷ lệ sống sót 100% sau 28 ngày theo dõi khi công cường độc với $10 \times \text{LD}_{50}$ xoắn khuẩn sống. Toàn bộ lô đối chứng không tiêm chết 100% trong vòng 5–7 ngày với các triệu chứng xuất huyết nội tạng nặng.
5. Bảo tồn vi thể cấu trúc mô: Quan sát lát cắt mô bệnh học nhuộm H&E cho thấy động vật được bảo hộ bằng vắc xin rLipL21 duy trì cấu trúc nhu mô gan và cầu thận hoàn toàn bình thường, không ghi nhận tình trạng thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, hoại tử ống thận hay lắng đọng thể vùi xoắn khuẩn như ở lô đối chứng.

Implications đa chiều

• Về mặt Lý thuyết: Công trình xác lập bằng chứng thực nghiệm vững chắc chứng minh một protein lipoprotein đơn lẻ (LipL21) khi được tái nạp đúng cấu trúc không gian 3D có khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch bảo vệ chéo đa chủng, vượt qua rào cản đa hình huyết thanh học phức tạp vốn tồn tại hàng thế kỷ của chi Leptospira.
• Về mặt Phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình biểu hiện prokaryote năng suất cao và tinh sạch protein màng ngoài kỵ nước bằng đệm biến tính urea kết hợp tái cuộn gập (refolding) trên cột Ni-NTA, cung cấp giải pháp mẫu mực cho nghiên cứu biểu hiện các OMP khó sản xuất khác.
• Về mặt Thực tiễn Sản xuất: Làm chủ công nghệ tạo nhũ tương nước trong dầu (W/O) bền vững bằng máy Silverson L4RT, tạo ra chế phẩm vắc xin có độ nhớt phù hợp, không lắng cặn sau 12 tháng bảo quản ở 2–8°C, sẵn sàng cho quy trình đóng lọ công nghiệp.
• Về mặt Chính sách và Dịch tễ: Cung cấp giải pháp vắc xin tái tổ hợp nội địa giá thành thấp cho Chương trình Quốc gia Phòng chống Bệnh Truyền lây giữa Động vật và Người, giảm thiểu phụ thuộc vào nguồn vắc xin nhập khẩu đắt đỏ và tăng cường an toàn sinh học vùng chăn nuôi trọng điểm.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu:

1. Quy mô serovar khảo sát: Nghiên cứu tập trung chuyên sâu vào 5 chủng đại diện chính gây bệnh ở Việt Nam. Mặc dù LipL21 có tính bảo tồn cao, cần mở rộng tầm soát trên toàn bộ 17 serovar lưu hành để khẳng định tuyệt đối tính bảo vệ phổ quát.
2. Hệ thống biểu hiện vi khuẩn nhân sơ: Biểu hiện rLipL21 trong E. coli tạo ra protein không có liên kết lipid hóa (lipidation) ở gốc cystein đầu N như protein tự nhiên của Leptospira, mặc dù tính sinh miễn dịch vẫn được bảo tồn nhờ đoạn dung hợp thioredoxin.
3. Thời gian giám sát miễn dịch thực địa: Nghiên cứu pilot 600 liều trên gia súc bước đầu chứng minh tính an toàn và đáp ứng kháng thể trong 6 tháng; cần kéo dài thời gian theo dõi đến 12–24 tháng để xác định chính xác thời điểm cần tiêm nhắc lại.

Chương trình nghiên cứu tương lai đề xuất 4 hướng cụ thể:

• Phát triển vắc xin chimeric đa epitope kết hợp giữa đoạn kháng nguyên rLipL21 và các miền ngoại bào của LigA/OmpL1 nhằm tối ưu hóa tính sinh miễn dịch dịch thể.
• Đánh giá biểu hiện LipL21 trên hệ thống nấm men Pichia pastoris hoặc vi khuẩn Lactobacillus để hướng tới vắc xin uống hoặc vắc xin niêm mạc.
• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng (RCT) trên đàn lợn nái và bò sữa quy mô hàng chục ngàn liều tại các điểm nóng dịch tễ đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long.
• Nghiên cứu ứng dụng protein rLipL21 tinh sạch làm kháng nguyên bao màng chuẩn hóa cho bộ kit chẩn đoán nhanh ELISA phát hiện sớm kháng thể Leptospira trên người và gia súc.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động Học thuật: Luận án mở ra hướng tiếp cận chuẩn tắc về vắc xin tái tổ hợp thú y tại Việt Nam, đóng góp nguồn dữ liệu trình tự gen giá trị lên ngân hàng gen quốc tế NCBI và công bố 4 công trình khoa học chuyên ngành trên các tạp chí uy tín trong nước và quốc tế.
• Chuyển dịch Công nghệ Ngành Thú y: Tạo nền tảng chuyển giao công nghệ trực tiếp sang Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung ương VETVACO để nâng cấp dây chuyền sản xuất vắc xin từ công nghệ vô hoạt truyền thống sang công nghệ protein tái tổ hợp hiện đại đạt chuẩn GMP-WHO.
• Tác động Kinh tế - Xã hội: Giảm thiểu thiệt hại kinh tế hàng trăm tỷ đồng mỗi năm do sảy thai, khô thai, chết phôi và sụt giảm sản lượng sữa ở đàn gia súc sinh sản. Đồng thời, việc cắt đứt nguồn bài thải xoắn khuẩn qua nước tiểu động vật vào nguồn nước sinh hoạt mang lại lợi ích bảo vệ sức khỏe cộng đồng to lớn cho hàng triệu nông dân.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chi tiết từ phân lập gen, thiết kế mồi, tạo dòng biểu hiện đến thử nghiệm in vivo của một nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp hoàn chỉnh.
• Các chuyên gia Miễn dịch học & Công nghệ Sinh học: Khai thác dữ liệu về epitope và cấu trúc không gian của LipL21 phục vụ các nghiên cứu sinh học cấu trúc và thiết kế kháng nguyên đa giá.
• Bộ phận R&D các Doanh nghiệp Dược Thú y: Ứng dụng ngay quy trình công nghệ tạo nhũ dầu và tinh sạch His-tag vào sản xuất quy mô công nghiệp mà không phải đầu tư lại từ đầu.
• Cơ quan Quản lý Thú y & Y tế Dự phòng: Có thêm công cụ khoa học vững chắc để xây dựng các kịch bản kiểm soát dịch bệnh Zoonosis và ban hành tiêu chuẩn kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp cấp quốc gia.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của công trình là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?
Trả lời: Luận án đã mở rộng Thuyết Miễn dịch học Đảo ngược (Reverse Vaccinology) và làm sâu sắc thêm Lý thuyết Ức chế Miễn dịch qua Độc lực Lipoprotein. Công trình chứng minh rằng kháng nguyên tiểu phần lipoprotein LipL21 – một chất ức chế myeloperoxidase tự nhiên – khi được tái tạo nhân tạo vẫn giữ trọn vẹn hoạt tính kích hoạt dòng thác miễn dịch dịch thể và bảo vệ chéo đa chủng mà không cần đến cấu trúc tế bào nguyên vẹn mang nội độc tố LPS.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận cốt lõi so với các nghiên cứu quốc tế trước đây là gì?
Trả lời: So với công trình của Haake và cs (chỉ khảo sát OmpL1 đơn lẻ) hay Kumari và cs (2018) (sử dụng biểu hiện rLipL21 nhưng chưa chuẩn hóa quy trình tạo nhũ thương mại), luận án đã cải tiến tích hợp hệ thống vector dung hợp pET-32a(+) giúp protein LipL21 đạt độ hòa tan cao, không bị kết hạt vùi (inclusion bodies), kết hợp với kỹ thuật đồng hóa nhũ tương tá dược dầu khoáng bằng máy Silverson L4RT đạt độ đồng nhất kích thước hạt nano, nâng tỷ lệ bảo hộ in vivo từ 66% (trong nghiên cứu của Kumari) lên 100% tuyệt đối trước liều công độc $10 \times \text{LD}_{50}$.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm có số liệu minh chứng là gì?
Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự biến mất hoàn toàn của 5 gen kháng nguyên bề mặt kinh điển (OmpL1, LipL32, LipL41, LigA, LigB) trên một số chủng thực địa tại Việt Nam (ví dụ: chủng L. Bataviae và L. Grippotyphosa mất một số đoạn gen màng ngoài), trong khi duy nhất locus gen LipL21 (560 bp) duy trì sự hiện diện 100% với độ tương đồng trình tự gần như tuyệt đối giữa cả 5 chủng. Điều này lý giải tại sao các vắc xin tái tổ hợp OmpL1 trước đây thường thất bại trong việc tạo miễn dịch bảo hộ phổ rộng.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?
Trả lời: Có. Luận án mô tả chi tiết từng bước có thể tái lặp hoàn toàn: từ trình tự các cặp mồi PCR, chu kỳ nhiệt luân nhiệt (Biến tính $95^\circ\text{C}$/30s, Bắt mồi $50–55^\circ\text{C}$/30s, Kéo dài $72^\circ\text{C}$/1 phút qua 30 chu kỳ), nồng độ enzyme cắt XhoI/EcoRV, thành phần gel acrylamide, nồng độ IPTG 0,6 mM, đến công thức phối trộn tá dược dầu khoáng và quy trình phản ứng ngưng kết MAT chuẩn hóa.

5. Luận án đã vạch ra chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo như thế nào?
Trả lời: Chương trình 10 năm tập trung vào: (i) Giai đoạn 1–3 năm: Hoàn thiện thủ tục cấp phép lưu hành vắc xin vô hoạt rLipL21 quy mô công nghiệp tại VETVACO; (ii) Giai đoạn 3–6 năm: Phát triển nền tảng vắc xin đa giá rLipL21-LigA tái tổ hợp thế hệ mới; (iii) Giai đoạn 6–10 năm: Nghiên cứu vắc xin nano màng nhầy dùng cho đường uống hoặc xịt mũi trên gia súc và thử nghiệm tiền lâm sàng pha 1 trên người có nguy cơ phơi nhiễm nghề nghiệp cao.

Kết luận

1. Định danh và phân lập thành công bộ gen: Xác định chính xác đặc tính phân tử của 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh phổ biến tại Việt Nam thông qua giải trình tự gen 16S rRNA và thiết lập cây phát sinh chủng loại.
2. Khám phá và khẳng định kháng nguyên đích LipL21: Chứng minh gen LipL21 (560 bp) là gen quyết định kháng nguyên bảo tồn phổ quát 100% trên tất cả các chủng khảo sát, sở hữu cấu trúc không gian 3D ổn định và các vùng epitope giàu tính sinh miễn dịch.
3. Chế tạo thành công protein tái tổ hợp rLipL21 chất lượng cao: Thiết lập hệ thống biểu hiện pET32a-LipL21 trong tế bào chủ E. coli BL21(DE3), tối ưu hóa điều kiện lên men và tinh sạch qua cột ái lực Ni-NTA thu được protein tái tổ hợp đạt hàm lượng và hoạt tính sinh học xuất sắc.
4. Phát triển công thức vắc xin nhũ dầu đạt chuẩn quốc gia: Phối trộn thành công protein rLipL21 với tá dược nhũ dầu khoáng bằng thiết bị Silverson L4RT, đáp ứng hoàn hảo các tiêu chuẩn vô trùng, an toàn tuyệt đối và hiệu lực bảo hộ 100% trên mô hình động vật công cường độc.
5. Sản xuất thử nghiệm thành công 600 liều quy mô pilot: Hoàn thiện quy trình công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp ở quy mô pilot, kiểm chứng thực địa trên đàn gia súc đạt hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao, sẵn sàng chuyển giao cho sản xuất công nghiệp quy mô lớn.
6. Đặt nền móng khoa học vững chắc: Mở ra 3 hướng nghiên cứu mới về vắc xin đa giá chimeric, kit chẩn đoán nhanh kháng nguyên tái tổ hợp và vắc xin phòng bệnh Leptospirosis trên người, khẳng định năng lực tự chủ công nghệ sinh học vắc xin thú y của Việt Nam trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 23 trang; Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 27 trang; Kết quả và thảo luận 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục công trình của tác giả 1 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang gồm 140 tài liệu; Trong luận án có 20 bảng, 34 hình và 4 bài báo trong phần Phụ lục. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 CHƢƠNG 1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis 1. Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira 1.

Phân loại học Theo khóa phân loại khoa học Leptospira đƣợc xếp vào Giới: Bacteria Ngành: Spirochaetes Lớp: Spirochaetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Dựa trên sự tƣơng đồng của bộ gen, các xoắn khuẩn thuộc giống Leptospira spp. đã đƣợc chia thành 20 loài [1], bao gồm những loài gây bệnh và không gây bệnh (hoại sinh): Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. Những loài hoại sinh (không gây bệnh): L. Trƣớc năm 1989, chi Leptospira đƣợc chia thành hai loài Leptospira interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các chủng hoại sinh (không gây bệnh).

Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu hình và sự sinh trƣởng của chúng nhƣ các chủng hoại sinh có khả năng mọc đƣợc ở nhiệt độ 11-13oC và sinh trƣởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) [2]. Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. Tuy nhiên, cũng có một số loài lại bao gồm cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại mới dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trƣớc đây dựa trên khảo sát huyết thanh học [5].

Các serovar Leptospira gây bệnh đƣợc xếp vào các nhóm khác nhau dựa vào mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngƣng kết hay LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 theo kiểu hấp phụ ngƣng kết chéo với kháng nguyên tƣơng đồng [3]. Mặc dù không dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại Leptospira nhƣng chúng rất có ý nghĩa về mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ biến đƣợc thể hiện qua Bảng 1.

Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans Số TT Nhóm Serovar (s) huyết thanh 1 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae, copenhageni, lai, zimbabwe 2 Hebdomadis hebdomadis, jules, kremastos 3 Autumnalis autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe 4 Pyrogenes pyrogenes 5 Bataviae bataviae 6 Gryppotyphosa gryppotyphosa, canalzonae, ratnapura 7 Canicola canicola 8 Australis australis, bratislava, lora 9 Pomona pomona 10 Javanica javanica 11 Sejroe sejroe, saxkoebing, hardjo 12 Panama panama, mangus 13 Cynopteri cynopteri 14 Djasiman djasiman 15 Sarmin sarmin 16 Mini mini, georgia 17 Tarassovi tarassovi 18 Ballum ballum, aroborea 19 Celledoni celledoni 20 Louisiana louisiana, lanka LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 Số TT Nhóm Serovar (s) huyết thanh 21 Ranarum ranarum 22 Manhao manhao 23 Shermani shermani 24 Hurstbridge hurstbridge [3]. Theo các nhà nghiên cứu huyết thanh học, hiện nay có trên 260 serovar gây bệnh đƣợc xếp vào 24 serogroup huyết thanh và 60 serovar thuộc nhóm hoại sinh [6]. Các serovar gây bệnh đƣợc phân chia thành các serogroup dựa trên mối quan hệ kháng nguyên đƣợc xác định bằng phản ứng ngƣng kết và tiếp theo đƣợc chia thành các serovar theo kiểu hấp thụ ngƣng kết.

Việc phân loại kiểu hình của Leptospira đã đƣợc thay thế bằng kiểu gen, trong đó gen phổ biến bao gồm tất cả các serovar của cả L. Hiện tại, các serovar gây bệnh còn đƣợc tìm thấy trong 10 loài Leptospira interrogans, L. Trong đó, một serovar mới đã đƣợc bổ sung L. fainei serovar Hurstbridge [7], Hệ thống phân loại mới dễ bị lẫn lộn bởi vì nhiều serovar và serogroup gây bệnh cũng nhƣ không gây bệnh có thể nằm trong cùng một loài, ngƣợc lại một serovar hoặc serogroup cũng có thể nằm trong nhiều loài khác nhau.

Điều này cho thấy không có sự tƣơng đồng giữa hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên bề mặt và hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc gen. Sự nhận dạng và phân loại đến loài trong chi Leptospira là rất quan trọng, bởi vì chúng có tính gây bệnh trên các loài động vật khác nhau. Việc tái phân loại Leptospira dựa trên nền tảng kiểu gen là chính xác về mặt danh pháp và cung cấp cơ sở vững chắc cho định loại xoắn khuẩn này trong tƣơng lai. Bên cạnh đó, việc phân loại dựa vào cơ sở phân tử cũng gặp một số khó khăn đối với các nhà nghiên cứu lâm sàng, bởi vì hệ thống này không tƣơng hợp rõ ràng với hệ thống serovar (chủng)/serogroups (nhóm huyết thanh) lâu nay đã đƣợc sử dụng trong chẩn đoán xác định xoắn khuẩn Leptospira và trong các nghiên cứu về dịch tễ học [8].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 Hiện nay một số kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để xác định và mô tả đặc điểm của Leptospira spp. đã xác định đƣợc 20 loài Leptospira spp. trong đó có 9 loài Leptospira gây bệnh [6]. Việc phân loại này dựa trên kết quả phân tích phát sinh loài, gen 16S rRNA đƣợc xem nhƣ thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác định Leptospira trong các mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira [9, 10].

Cấu trúc hình thái Leptospira là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình móc câu, xoắn, chuyển động không theo quy luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay tròn, theo hình sóng… Leptospira có kích thƣớc: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng cách giữa các vòng xoắn là 0,5 µm [3]. Vi khuẩn bắt màu nâu đen với phƣơng pháp nhuộm thấm bạc, bộ phận di động của vi khuẩn gồm một trục ở giữa và thân xoắn nhƣ lò xo quanh trục. Ngoài cùng có một vỏ mềm co giãn đƣợc chứa nhiều kháng nguyên, tiếp theo là màng bao bọc tế bào chất bao gồm 3-5 lớp, ở giữa là nhân không có màng ngăn cách với nguyên sinh chất đảm nhận chức năng di truyền. Do có cấu trúc đặc biệt nhƣ vậy nên Leptospira vận động rất uyển chuyển và có khả năng co giãn dễ dàng, chúng có thể chui qua da, niêm mạc của gia súc hoặc của ngƣời khi ngâm nƣớc hoặc có vết trầy xƣớc.

Khi cho qua lọc Seitz với kích thƣớc lỗ lọc 0,1-0,45 µm, hầu hết các vi khuẩn đều bị giữ lại nhƣng chỉ có xoắn khuẩn Leptospira có thể chui qua đƣợc dễ dàng. Hình dạng Leptospira interrogans dƣới kính hiển vi điện tử quét [11]. Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira Leptospira có thể phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ thích hợp 28-30oC.

pH hơi kiềm 7,2 – 7,5 và thời gian phân LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 chia của mỗi thế hệ kéo dài khoảng 7-10 ngày đối với các chủng mới phân lập, do vậy khó phát hiện bằng phƣơng pháp nuôi cấy thông thƣờng ở phòng thí nghiệm. Môi trƣờng nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira cần phải có huyết thanh thỏ tƣơi nhƣ môi trƣờng Terskich, môi trƣờng Korthof. Trong các môi trƣờng này xoắn khuẩn Leptospira mọc chậm khoảng 1 tuần, làm môi trƣờng đục nhẹ. Ngoài ra vi khuẩn có thể phát triển trong phôi gà.

Xoắn khuẩn có thể phát triển trong môi trƣờng Ellinghausen- McCullough- Johnson-Harris (EMJH) nhƣng sự phát triển của Leptospira rất chậm, có đôi khi kéo dài đến 3 tháng. Ở nhiệt độ 28-30oC có thể nhận thấy đƣợc sự phát triển của các chủng gây bệnh sau 4-7 ngày nuôi cấy, còn sự phát triển của các chủng hoại sinh chỉ sau 2-3 ngày ở nhiệt độ 11-130C. Do đó có thể dựa vào khả năng phát triển ở 130C để phân biệt các loài Leptospira hoại sinh hay loài Leptospira gây bệnh [3]. Trong cùng một điều kiện môi trƣờng nuôi cấy những loài hoại sinh sẽ phát triển nhanh hơn các loài gây bệnh do chúng thƣờng sống trong môi trƣờng nƣớc đọng hay hòa lẫn trong đất ẩm cho nên khi nuôi cấy phải thƣờng xuyên kiểm tra, ít nhất mỗi tuần 1 lần dƣới kính hiển vi nền đen để có đƣợc kết quả chính xác [12].

Leptospira interrogans dƣới KHV nền đen (x400) [13]. Trong quá trình nuôi cấy Leptospira, để tránh sự vấy nhiễm của các vi khuẩn trong giai đoạn đầu nuôi cấy, đặc biệt các mẫu có nguồn gốc từ động vật bệnh có biểu hiện triệu chứng lâm sàng hoặc từ môi trƣờng, cần bổ sung thêm kháng sinh 5- fluorouracil vào môi trƣờng nuôi cấy làm hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn vấy nhiễm khác nhƣng không làm giảm sự tăng trƣởng của Leptospira [3, 11]. Sức đề kháng của mầm bệnh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 10 Sự tồn tại của Leptospira gây bệnh trong môi trƣờng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ pH hay nhiệt độ môi trƣờng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, Leptospira trong nƣớc ở nhiệt độ phòng vẫn duy trì đƣợc trong nhiều tháng ở pH=7,2 đến pH=8,0.

Trong nƣớc thải cống rãnh Leptospira có thể sống đƣợc trong vài tuần lễ. Ở trong đất có tính axit (pH= 6,2) Leptospira serovar Australis có thể sống sau 7 tuần và đất ngập nƣớc mƣa sống đƣợc ít nhất 3 tuần. Trong đất ẩm ƣớt Leptospira có thể tồn tại 180 ngày và nhiều tháng trong nƣớc mặt và khi đất bị ô nhiễm nƣớc tiểu từ chuột nhiễm Leptospira, Leptospira sống đƣợc khoảng 2 tuần [3]. Tính sinh miễn dịch Miễn dịch đối với Leptospira là miễn dịch đặc hiệu cho từng nhóm huyết thanh, một số trƣờng hợp cho thấy có miễn dịch chéo giữa L.

Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể gia súc, xoắn khuẩn có tác động lên hệ miễn dịch của cơ thể ký chủ, kích thích cơ thể tạo ra kháng thể. Kháng thể là một globulin miễn dịch có phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên. Globulin miễn dịch đƣợc chia làm 5 nhóm IgA, IgG, IgE, IgM, và IgD, trong đó IgG và IgM là quan trọng nhất. Thƣờng thì khi có tác động của kháng nguyên, sau 7 ngày trong cơ thể đã xuất hiện IgM và đạt cao nhất vào ngày thứ 10, trong khi IgG xuất hiện sau khi nhiễm mầm bệnh vài tuần và đạt cao nhất vào ngày thứ 20-30, sau đó hàm lƣợng kháng thể này giảm dần.

Kháng thể IgM không đặc hiệu, có thể ngƣng kết với nhiều chủng huyết thanh, trong khi IgG có đặc tính đặc hiệu cao đối với từng chủng huyết thanh gây bệnh. Việc xuất hiện kháng thể IgM và IgG cho phép ta suy diễn về các giai đoạn của bệnh. Thời gian tồn tại của kháng thể động vật dài hay ngắn tùy thuộc từng loại kháng thể và tính chất cùa bệnh. Tuy nhiên, do Leptospira thƣờng khu trú ở hệ thống ống lƣợn của thận, dịch não tủy, dịch của mắt và trong lòng ống cơ quan sinh dục cho nên tác động của kháng thể ở những nơi này rất hạn chế.