Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hoạt nhục đầu khấu myristica fragrans

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hoạt nhục đầu khấu myristica, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Nguyễn Thị Chinh
• Người hướng dẫn: TS. Phương Thiện Thương
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Ung Thư Của Một Số Hoạt Chất Phân Lập Từ Hạt Nhục Đậu Khấu (Myristica fragrans)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. UNG THƯ VÀ CƠ CHẾ SINH BỆNH
• 1.1.1. Đặc điểm tế bào ung thư và quá trình tiến triển bệnh
• 1.1.1.1. Đặc điểm tế bào ung thư
• 1.1.1.2. Quá trình tiến triển bệnh ung thư
• 1.1.2. Hậu quả của ung thư đối với cơ thể
• 1.2. MỘT SỐ LOẠI THUỐC THƯỜNG DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
• 1.2.1. Thuốc chống chuyển hóa
• 1.2.2. Thuốc làm thay đổi đáp ứng sinh học
• 1.2.3. Dược liệu Việt Nam chữa ung thư
• 1.3. MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CHẾ PHẨM
• 1.3.1. Mô hình nuôi cấy tế bào in vitro
• 1.3.2. Nuôi cấy spheroid
• 1.3.3. Ứng dụng của spheroid trong nghiên cứu ung thư
• 1.3.4. Một số đặc tính của tế bào ung thư phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D
• 1.3.5. Mô hình in vivo
• 1.3.6. CÁC DÒNG CHUỘT SWISS VÀ BALB/C
• 1.3.6.1. Dòng chuột Swiss
• 1.3.6.2. Dòng chuột BALB/c
• 1.3.7. CÁC CHẾ PHẨM PHÂN LẬP TỪ HẠT NHỤC ĐẬU KHẤU Myristica fragrans
• 1.3.8. THUỐC ĐỐI CHỨNG TAXOL VÀ 6MP
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
• 2.2.1. Hóa chất thí nghiệm
• 2.2.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao
• 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Phương pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt chất trong mô hình in vitro
• 2.3.2. Phương pháp thử tác dụng của hoạt chất trên spheroid MCF7
• 2.3.3. Phương pháp tạo spheroid MCF7
• 2.3.4. Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid trên spheroid MCF7
• 2.3.5. Xác định thể tích khối spheroid MCF7
• 2.3.6. Phương pháp gây u rắn và thử tác dụng chống ung thư của hoạt chất trên chuột. Cách cho uống
• 2.3.7. Xác định kích thước khối u
• 2.3.8. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÀ DÒNG TẾ BÀO THƯỜNG
• 3.2. SỰ BIẾN ĐỔI THỂ TÍCH VÀ HÌNH THÁI KHỐI SPHEROID MCF7 DƯỚI TÁC DỤNG CỦA CHẾ PHẨM
• 3.2.1. Sự tạo spheroid MCF7 trong thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1
• 3.2.2. Hình thái của khối spheroid MCF7 dưới tác dụng của hoạt chất 1
• 3.2.3. Thể tích khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của hoạt chất 1
• 3.3. SỰ BIẾN ĐỔI VỀ THỂ TÍCH VÀ HÌNH THÁI KHỐI U RẮN SAR180 TRÊN CHUỘT SWISS DƯỚI TÁC DỤNG CỦA CHẾ PHẨM 3.8 Ở CÁC LIỀU THỬ KHÁC NHAU
• 3.3.1. Ảnh hưởng của hoạt chất 1 đến kích thước khối u
• 3.3.2. Ảnh hưởng của hoạt chất 1 đến hình thái khối u chuột
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng chống ung thư của hạt nhục đậu khấu

Hạt nhục đậu khấu (Myristica fragrans) không chỉ là một gia vị phổ biến mà còn chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học mạnh mẽ. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu có khả năng chống ung thư đáng kể. Các hoạt chất này bao gồm fragransin A2, nectandrin B, macelignan và meso-dihydroguaiaretic acid. Những hoạt chất này đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong các mô hình nghiên cứu khác nhau.

1.1. Các hoạt chất chính trong hạt nhục đậu khấu và tác dụng của chúng

Hạt nhục đậu khấu chứa nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là các lignan. Fragransin A2 và macelignan đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng meso-dihydroguaiaretic acid có tác dụng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do.

1.2. Lịch sử nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của nhục đậu khấu

Mặc dù hạt nhục đậu khấu đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ lâu, nhưng nghiên cứu khoa học về tác dụng chống ung thư của nó chỉ mới bắt đầu trong những năm gần đây. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu có thể làm giảm sự phát triển của nhiều loại ung thư khác nhau, bao gồm ung thư vú và ung thư đại tràng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng chống ung thư

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về tác dụng của hạt nhục đậu khấu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định cơ chế hoạt động của các hoạt chất này. Một trong những vấn đề lớn là thiếu các nghiên cứu lâm sàng để xác nhận hiệu quả của chúng trên con người. Ngoài ra, việc chiết xuất và phân lập các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu cũng gặp nhiều khó khăn.

2.1. Thiếu nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của hạt nhục đậu khấu

Mặc dù có nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo, nhưng việc thiếu các thử nghiệm lâm sàng trên người khiến cho việc áp dụng các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu vào điều trị ung thư gặp nhiều khó khăn. Cần có thêm các nghiên cứu để xác định liều lượng và hiệu quả thực tế của các hoạt chất này.

2.2. Khó khăn trong việc chiết xuất và phân lập hoạt chất

Quá trình chiết xuất và phân lập các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu thường phức tạp và tốn thời gian. Các phương pháp hiện tại chưa tối ưu hóa được hiệu suất chiết xuất, dẫn đến việc khó khăn trong việc thu nhận đủ lượng hoạt chất cần thiết cho nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống ung thư của hạt nhục đậu khấu

Để nghiên cứu tác dụng chống ung thư của các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các mô hình nuôi cấy tế bào in vitro và in vivo được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các hoạt chất này. Phương pháp SRB (Sulforhodamine B) là một trong những phương pháp phổ biến để xác định độc tính của các hoạt chất.

3.1. Mô hình nuôi cấy tế bào in vitro

Mô hình nuôi cấy tế bào in vitro cho phép nghiên cứu tác dụng của các hoạt chất trong môi trường kiểm soát. Các tế bào ung thư như MCF-7 được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu.

3.2. Mô hình in vivo trong nghiên cứu tác dụng chống ung thư

Mô hình in vivo sử dụng chuột để nghiên cứu tác dụng chống ung thư của các hoạt chất. Các nghiên cứu này giúp đánh giá hiệu quả thực tế của các hoạt chất trong cơ thể sống, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

IV. Kết quả nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt nhục đậu khấu

Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Các thí nghiệm cho thấy rằng meso-dihydroguaiaretic acid có tác dụng mạnh mẽ trong việc giảm kích thước khối u trong mô hình chuột. Những kết quả này mở ra triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới từ thiên nhiên.

4.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hoạt chất

Nghiên cứu cho thấy rằng các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư MCF-7. Các thí nghiệm cho thấy rằng nồng độ cao của meso-dihydroguaiaretic acid có thể làm giảm đáng kể sự tăng trưởng của tế bào ung thư.

4.2. Kết quả từ mô hình in vivo

Trong các thí nghiệm trên chuột, các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu đã cho thấy khả năng làm giảm kích thước khối u. Kết quả này cho thấy tiềm năng của các hoạt chất này trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt nhục đậu khấu mở ra nhiều triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn cơ chế hoạt động và hiệu quả của các hoạt chất này. Việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên có thể là một hướng đi tiềm năng trong điều trị ung thư.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần thiết phải tiến hành các nghiên cứu lâm sàng để xác nhận hiệu quả của các hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu trên con người. Điều này sẽ giúp đưa các sản phẩm này vào ứng dụng thực tiễn trong điều trị ung thư.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị ung thư từ thiên nhiên

Việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư từ thiên nhiên không chỉ giúp giảm tác dụng phụ mà còn mang lại hiệu quả cao. Hạt nhục đậu khấu có thể là một trong những nguồn tài nguyên quý giá cho nghiên cứu và phát triển các sản phẩm chống ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Giai đoạn từ năm 2000 đến năm 2010 ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh ung thư tại Việt Nam gia tăng nhanh chóng, trong đó tỷ lệ mắc ở nam giới tăng từ 104 lên 181 ca trên 100.000 dân, còn ở nữ giới tăng từ 101 lên 134 ca trên 100.000 dân. Mỗi năm cả nước có khoảng 75.000 bệnh nhân tử vong và ước tính riêng năm 2011 có thêm 126.000 ca mắc mới. Tình trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các hợp chất điều trị mới có nguồn gốc tự nhiên nhằm nâng cao hiệu quả diệt tế bào ác tính và giảm thiểu độc tính trên tế bào lành.

Vấn đề cốt lõi của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính ức chế tăng sinh và tiêu diệt tế bào ung thư của các hợp chất lignan phân lập từ hạt cây nhục đậu khấu (Myristica fragrans). Mục tiêu cụ thể của đề tài bao gồm việc sàng lọc độc tính tế bào trên mô hình nuôi cấy hai chiều 2D, khảo sát khả năng phá hủy mô hình khối u ba chiều 3D spheroid, và đánh giá tác dụng ức chế u rắn in vivo trên chuột nhắt trắng.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai tại phòng thí nghiệm chuyên sâu thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2011. Đề tài tập trung phân tích 4 hoạt chất lignan tinh khiết gồm meso-dihydroguaiaretic acid, macelignan, fragransin A2 và nectandrin B. Ý nghĩa học thuật và thực tiễn của công trình thể hiện qua việc phát hiện hoạt chất meso-dihydroguaiaretic acid đạt giá trị ức chế bán tối đa IC50 ấn tượng ở mức 10,11 µM trên dòng ung thư phổi H358 và 16,9 µM trên dòng ung thư vú MCF-7, mở ra tiềm năng ứng dụng nguồn dược liệu nhiệt đới phong phú của Việt Nam vào hỗ trợ điều trị ung bướu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết 6 giai đoạn phát sinh và tiến triển ung thư của Robert Weinberg, bao gồm: giai đoạn khởi phát tín hiệu phân bào tự thân, giai đoạn thúc đẩy làm tê liệt kiểm soát chu trình tế bào, giai đoạn chuyển biến mất chức năng protein p53, giai đoạn lan tràn bất tử hóa nhờ enzyme telomerase, giai đoạn củng cố tăng sinh mạch máu, và giai đoạn xâm lấn di căn chiếm hơn 90% nguyên nhân tử vong ở bệnh nhân ung bướu.

Cơ sở lý thuyết về vi môi trường khối u được áp dụng để giải thích sự khác biệt giữa nuôi cấy đơn lớp 2D và khối cầu đa bào 3D spheroid. Cấu trúc spheroid mô phỏng chính xác ba tầng tế bào của khối u thực tế gồm: lớp ngoài cùng phân chia mạnh mẽ, lớp trung gian ngừng phân chia nhưng còn sống, và lõi hoại tử trung tâm thiếu oxy.

Hệ thống phân loại dược lý đối với các thuốc chống ung thư kinh điển cũng được thiết lập làm khung tham chiếu, bao gồm cơ chế bảo vệ vi ống gây ngưng trệ chu trình tế bào của Paclitaxel (Taxol) và cơ chế ức chế cạnh tranh sinh tổng hợp purine của 6-Mercaptopurine (6-MP) với giá trị độc tính cấp liều chết 50% đạt 480 mg/kg thể trọng chuột.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 8 dòng tế bào ung thư người gồm HeLa (cổ tử cung), H358 (phổi), RD (mô liên kết), KPL4 (vú), H460 (phổi), MCF-7 (vú), H1299 (phổi), HepG2 (gan), cùng 1 dòng tế bào thường MDCK (thận chó) đạt chuẩn ATCC. Mô hình in vivo sử dụng cỡ mẫu 70 chuột nhắt trắng dòng Swiss thuần dưỡng 5 tuần tuổi có trọng lượng trung bình 18 đến 20 gam do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.

Quy trình phân tích độc tính in vitro sử dụng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) nạp 8.000 tế bào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng, ủ hoạt chất ở 5 dải nồng độ từ 0,3 µM đến 30 µM trong 48 giờ và đo mật độ quang học ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc tự động Microplate Reader Model 680. Phương pháp tạo khối 3D spheroid ứng dụng kỹ thuật giọt treo với mật độ 5.000 tế bào trên nền gel agarose 1,5%.

Mô hình u rắn in vivo được thiết lập bằng cách tiêm dưới da ngực chuột 10^6 tế bào Sarcoma 180, chia ngẫu nhiên thành 7 lô thí nghiệm (10 cá thể mỗi lô) và cho uống hoạt chất theo các liều 0,2 g/kg, 0,5 g/kg và 1 g/kg trong 24 ngày. Toàn bộ số liệu kích thước u được đo bằng thước kẹp điện tử, tính toán thể tích theo công thức chuẩn và xử lý thống kê bằng thuật toán Student's t-test với độ tin cậy đạt mức sai số p nhỏ hơn 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, hoạt chất meso-dihydroguaiaretic acid thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh vượt trội trên toàn bộ 8 dòng tế bào ung thư khảo sát, với dải giá trị IC50 từ 10,11 µM đến 33,4 µM. Đáng chú ý, tại nồng độ 30 µM, hoạt chất này ức chế tới 91,18% sự phát triển của dòng ung thư phổi H358 và đạt chỉ số IC50 thấp nhất là 10,11 ± 4,0 µM.

Thứ hai, hoạt chất macelignan thể hiện tính chọn lọc cao khi ức chế mạnh dòng ung thư phổi H358 với IC50 đạt 10,0 ± 1,0 µM và dòng ung thư cổ tử cung HeLa với IC50 đạt 25,1 ± 3,8 µM, trong khi giá trị IC50 trên 6 dòng tế bào còn lại đều vượt mức 30 µM. Hai hoạt chất fragransin A2 và nectandrin B hầu như không biểu hiện hoạt tính ức chế rõ rệt.

Thứ ba, các hoạt chất phân lập từ nhục đậu khấu đều chứng minh tính an toàn cao trên tế bào lành MDCK. Tại nồng độ tối đa 30 µM, tỷ lệ sống sót của tế bào thận chó MDCK khi ủ với meso-dihydroguaiaretic acid vẫn duy trì ở mức cao 87,76% so với đối chứng dung môi, khẳng định độ độc chọn lọc chỉ hướng vào mô ác tính.

Thứ tư, trên mô hình 3D spheroid MCF-7, meso-dihydroguaiaretic acid ở nồng độ 30 µM làm tan rã hoàn toàn khối cầu đa bào chỉ sau 24 đến 48 giờ điều trị, khiến tế bào co cụm đậm màu, mất vành liên kết ngoài và hoại tử nhanh chóng so với nhóm đối chứng sinh học.

Thảo luận kết quả

Khả năng phá hủy tế bào ung thư của meso-dihydroguaiaretic acid bắt nguồn từ cấu trúc phenylpropanoid đặc thù, giúp hoạt chất dễ dàng xâm nhập qua màng lipid kép và can thiệp vào quá trình truyền tín hiệu nội bào. Hiện tượng khối 3D spheroid bị thoái lui nhanh chóng giải thích do hoạt chất làm suy giảm hàm lượng liên kết sialic acid trên bề mặt màng, kích hoạt con đường tự chết apoptosis và phá vỡ cấu trúc không gian ba chiều của khối u.

So sánh với các công bố quốc tế của nhóm tác giả Park và cộng sự, dữ liệu thực nghiệm trong luận văn đã mở rộng phổ tác dụng của hợp chất này trên nhiều dạng ung thư biểu mô mới. Các phát hiện có thể được hệ thống hóa qua biểu đồ động học đường cong tăng trưởng tế bào theo thời gian và bảng ma trận đối sánh giá trị IC50 giữa 4 hợp chất lignan với thuốc đối chứng Taxol, minh chứng rõ nét mức độ đáp ứng phụ thuộc vào nồng độ và thời gian xử lý mẫu.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, Viện Dược liệu và các trung tâm nghiên cứu hóa thực vật cần chuẩn hóa quy trình chiết xuất và tinh chế meso-dihydroguaiaretic acid từ hạt nhục đậu khấu quy mô pilot, hướng tới mục tiêu nâng độ tinh khiết lên trên 98% và tăng hiệu suất thu hồi thêm 25% trong thời hạn 12 tháng.

Thứ tư, nhóm nghiên cứu sinh học phân tử cần thực hiện các phân tích Western blot và RT-PCR trong vòng 18 tháng tới nhằm định lượng chính xác sự thay đổi nồng độ các protein chỉ thị apoptosis như Caspase-3, Caspase-9, Bax và Bcl-2 dưới tác động của hoạt chất.

Thứ ba, các nhà khoa học dược chế phẩm tại các trường đại học khối y dược cần phối hợp nghiên cứu công nghệ bào chế dạng hạt nano liposome hoặc polymer sinh học cho meso-dihydroguaiaretic acid, đặt mục tiêu cải thiện độ hòa tan trong nước và tăng sinh khả dụng đường uống lên 40% trong lộ trình 24 tháng.

Thứ tư, cơ quan quản lý và các quỹ tài trợ khoa học cần tạo điều kiện mở rộng thử nghiệm tiền lâm sàng trên các mô hình chuột chuyển gen hoặc chuột suy giảm miễn dịch mang khối u dị ghép từ người (xenograft) trong vòng 36 tháng nhằm chuẩn bị hồ sơ cho các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tiếp theo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Dược lý, Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn mực về kỹ thuật thử độc tính tế bào SRB 2D kết hợp tạo khối đa bào 3D spheroid giọt treo, hỗ trợ thiết kế các đề tài sàng lọc thuốc từ tự nhiên.

Học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Hóa sinh: Luận văn là hình mẫu trực quan về phương pháp phân tích số liệu, xử lý sai số thống kê sinh học trên phần mềm chuyên dụng và kỹ năng biện luận kết quả thực nghiệm.

Chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) tại các công ty dược phẩm: Dữ liệu về hoạt tính của các khung cấu trúc lignan từ hạt nhục đậu khấu cung cấp tiền đề định hướng tổng hợp bán phần hoặc phát triển các dòng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư.

Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và dược sĩ lâm sàng: Công trình mang lại góc nhìn cập nhật về cơ chế tác động chọn lọc của hoạt chất thảo dược tự nhiên, làm giàu cơ sở dữ liệu để nghiên cứu các phác đồ phối hợp nhằm giảm thiểu tác dụng phụ của hóa trị liệu thông thường.

Câu hỏi thường gặp

Mô hình nuôi cấy khối u ba chiều 3D spheroid mang lại ưu điểm vượt trội gì so với nuôi cấy 2D? Mô hình 3D spheroid tái tạo chân thực cấu trúc không gian, gradient nồng độ oxy, dưỡng chất và các tương tác đa bào của khối u rắn trong cơ thể sống. Nhờ đó, việc đánh giá độ nhạy cảm và khả năng thẩm thấu của hoạt chất meso-dihydroguaiaretic acid trên spheroid MCF-7 đạt độ chính xác cao hơn hẳn nuôi cấy đơn lớp 2D.

Hoạt chất nào phân lập từ hạt nhục đậu khấu có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh nhất? Hoạt chất meso-dihydroguaiaretic acid thể hiện hoạt tính mạnh nhất trên tất cả 8 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, đạt IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM trên dòng ung thư phổi H358 và gây tan rã hoàn toàn khối u 3D sau 48 giờ ở nồng độ 30 µM.

Các hợp chất lignan trong đề tài có gây tổn thương cho các mô tế bào bình thường không? Kết quả kiểm tra trên dòng tế bào thận chó MDCK cho thấy các hoạt chất không gây độc tính đáng kể. Ngay cả ở nồng độ cao nhất 30 µM của meso-dihydroguaiaretic acid, tỷ lệ tế bào thường sống sót vẫn đạt 87,76%, chứng minh tính an toàn cao đối với tế bào lành.

Tác dụng của meso-dihydroguaiaretic acid trên khối cầu đa bào MCF-7 diễn ra theo trình tự nào? Ở nồng độ 30 µM, sau 24 giờ đầu tiên, lớp tế bào phân chia ở vành ngoài bị bong tách và tan rã. Đến ngày thứ hai và thứ ba, toàn bộ khối cầu bị phá hủy hoàn toàn, các tế bào co đặc, mất liên kết và chuyển thành các đám mảnh vụn hoại tử.

Quy mô thí nghiệm in vivo trên động vật được thiết kế như thế nào? Thí nghiệm được triển khai trên 70 chuột nhắt trắng Swiss mang khối u Sarcoma 180 được phân thành 7 lô. Chuột được cho uống hoạt chất ở các liều 0,2 g/kg, 0,5 g/kg và 1 g/kg định kỳ các ngày trong tuần suốt 24 ngày để theo dõi sự suy giảm thể tích khối u.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập và xác định thành công hoạt tính sinh học của 4 hợp chất lignan từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans.
• Khẳng định meso-dihydroguaiaretic acid là hoạt chất có hoạt tính kháng u mạnh nhất với IC50 đạt 10,11 µM trên tế bào ung thư phổi H358.
• Chứng minh tính an toàn vượt trội của các dẫn xuất lignan trên dòng tế bào lành MDCK với tỷ lệ sống sót đạt 87,76%.
• Xác lập thành công mô hình 3D spheroid MCF-7 và ghi nhận khả năng làm tan rã khối u của hoạt chất chỉ sau 24 đến 48 giờ.
• Đóng góp luận cứ khoa học quan trọng để thúc đẩy các nghiên cứu tiền lâm sàng và công nghệ bào chế dược phẩm kháng ung thư từ nguồn thực vật Việt Nam; các đơn vị nghiên cứu quan tâm nên tiếp tục phối hợp thực hiện các thử nghiệm cơ chế sâu hơn trong giai đoạn tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu mọc ở miền Nam Việt Nam. Các lignan (tức là các phenylpropanoids) là thành phần chủ yếu có tác dụng sinh học của hạt nhục đậu khấu, gồm các chất chính fragransin A2, nectandrin B, macelignan, meso-dihydroguaiaretic acid. Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học các lignan phân lập từ hạt có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm giảm đau, có tác dụng bảo vệ gan, giảm cholesterol trong máu, chống xơ vữa động mạch, kháng khuẩn. Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt và các lignan phân lập từ hạt ở Việt Nam và thế giới mới có rất ít [27].

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans” với các mục đích chính như sau: - Thử hoạt tính chống ung thư của các hoạt chất lignan phân lập được trên mô hình nuôi cấy tế bào 2D. - Tạo mô hình và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của lignan có tác dụng chống ung thư mạnh nhất (trong các lignan đã thử nghiệm 2D) trên mô hình 3D và in vivo. Nguyễn Thị Chinh K18 Cao học Sinh học 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Tổng quan Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. UNG THƢ VÀ CƠ CHẾ SINH BỆNH Ung thư không phải chỉ là một loại bệnh mà là khoảng trên 200 loại bệnh khác nhau [34].

Mỗi loại có nguyên nhân riêng của nó, nhưng đều có nguồn gốc chung từ việc tế bào bị đột biến gen [34]. Năm 1953, lần đầu tiên tế bào ung thư được quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Những thành tựu nghiên cứu ở mô hình tế bào cho đến nay là cơ sở chắc chắn cho nhận định của giáo sư Arnold Graffi “vấn đề của ung thư thực chất là vấn đề của tế bào học”. Vì vậy muốn điều trị ung thư phải hiểu được cơ sở tế bào học của nó [8, 34].

Các đặc điểm nổi bật chung của tế bào ung thư là tế bào bị đột biến gen, có khả năng sự tăng sinh vô hạn, không kiểm soát được, có khả năng xâm lấn và phát triển ở các cơ quan, tổ chức khác của cơ thể (sự di căn), có khả năng tăng sinh mạch máu [13, 34]. Bệnh ung thư bắt đầu từ khi có một tế bào bắt đầu vượt qua sự kiểm soát của cơ thể, bị đột biến gen, phát triển không ngừng và hình thành một đám tế bào có chung đặc điểm là phát triển vô kiểm soát, xâm lấn và chèn ép các mô xung quanh. Có rất nhiều nguyên nhân làm chuyển dạng tế bào lành thành tế bào ung thư, bao gồm: các tác nhân vật lý (chủ yếu là tia bức xạ ion hóa), các tác nhân hóa học, các virus, một số bệnh viêm mạn tính, nhiễm trùng lâu ngày, rối loạn nội tiết, rối loạn hoạt động enzyme và nhiều vấn đề dinh dưỡng liên quan. Các tác nhân này gây ảnh hưởng sâu sắc đến cơ cấu di truyền phân tử của tế bào, làm thay đổi khả năng trao đổi chất, năng lượng và thông tin với môi trường.

Ngoài ra, ung thư còn có thể do yếu tố di truyền bẩm sinh [3, 8, 34]. Quá trình hình thành khối u từ tế bào ung thư phải trải qua nhiều giai đoạn. Thời gian từ tế bào ung thư khởi đầu đến khi xuất hiện một u có thể nhận biết gọi là thời kì tiềm ẩn (ở người có thể kéo dài từ 10 đến 20 năm) [8, 34]. Sau khi phát triển thành khối u, các tế bào ung thư tiếp tục tăng sinh hỗn loạn, tự mất đi các thụ thể để nhận biết giới hạn với các tế bào bên cạnh, sản xuất ồ ạt cytokin và enzyme proteaza để phá hủy màng đệm lót và môi trường ngoại bào xung quanh.

Do đó, các Nguyễn Thị Chinh K18 Cao học Sinh học 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Tổng quan tế bào ung thư liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục sinh sôi, nảy nở, tăng sinh số lượng. Quá trình này được gọi là sự di căn (metastasis) [10, 34]. Nói cách khác, di căn là một hay nhiều tế bào ung thư tăng trưởng ở một khoảng cách nào đấy cách nơi phát sinh tiên phát của khối u. Thông thường do hậu quả của di căn mà ung thư gây ra là xấu, có khả năng gây tử vong.

Đặc điểm tế bào ung thƣ và quá trình tiến triển bệnh 1. Đặc điểm tế bào ung thư Tế bào ung thư là những tế bào đột biến, phân chia vô hạn không chịu sự kiểm soát của cơ thể, cho nên so với tế bào bình thường, tế bào ung thư có những đặc điểm bất thường về hình dạng và kích thước của tế bào cũng như của nhân. Kích thước của tế bào ung thư khá lớn, khoảng 20 - 40µm. Hình dạng tế bào rất đa dạng, có thể là hình cầu, bầu dục, hình thoi, hình hạt…, có thể có dạng gai.

Những đặc điểm bất thường của nhân cũng là đặc trưng quan trọng của tế bào ung thư. Chúng có thể chứa một hoặc nhiều nhân, thường có kích thước lớn và đa hình thái, có thể tròn, hình thoi, méo mó hoặc tạo túi. Kích thước nhân có thể rất khác nhau, song đa số nhân nằm lệch sang một bên và tỷ lệ giữa nhân và tế bào chất cao hơn so với tỷ lệ này ở tế bào thường. Đây chính là những đặc điểm chính để có thể phân biệt và nhận biết tế bào ung thư về mặt hình thái.

Tính chất bắt màu của nhân và tế bào chất cũng thay đổi đậm nhạt khác nhau. Các đặc điểm hình thái bất thường trên của tế bào ung thư là dấu hiệu quan trọng được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán ung thư. Về cấu trúc và chức năng, nhìn chung các tế bào ung thư đều giữ được đặc điểm đặc trưng của những tế bào gốc tạo ra nó. Tuy nhiên cũng có nhiều khía cạnh khác biệt: - Tế bào bình thường trong cơ thể sau nhiều lần phân chia sẽ chết theo con đường apoptosis.

Riêng tế bào ung thư có khả năng tăng sinh vô hạn độ, tạo thành những tế bào bất diệt. Nguyễn Thị Chinh K18 Cao học Sinh học 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Tổng quan - Tế bào ung thư không tuân theo những tín hiệu từ những tế bào khác trong đó có những tín hiê ̣u ức chế tăng sinh , bất kể những tác hại gây ra do số lượng tế bào quá lớn gây chèn ép các mô xung quanh. - Tế bào ung thư bị mất các phân tử trên bề mặt màng tế bào có khả năng giữ chúng ở đúng vị trí, vì vậy chúng có thể tự tách ra và di chuyển đến những vị trí khác trong cơ thể, quá trình này gọi là di căn. - Thời gian nhân đôi của tế bào ung thư rất ngắn (dòng tế bào Sarcoma 180 có thời gian nhân đôi là 15,2 giờ) do tế bào ung thư có khả năng thoát khỏi sự kiểm soát và điều hòa của cơ thể.

Quá trình tiến triển bệnh ung thư Weinberg R. đề xuất 6 giai đoạn trong quá trình phát sinh ung thư ác tính [18]. Có thể tóm tắt như sau: 1. Giai đoạn khởi phát Các tế bào ung thư nhận được các tín hiệu thúc đẩy sự tăng sinh và phân bào.

Các tín hiệu này có thể xuất hiện do sự thay đổi của các yếu tố ngoại bào hoặc do sự thay đổi bên trong hệ thống truyền tín hiệu nội bào dẫn tới sự tăng sinh và phân bào. Trong những trường hợp “cực đoan” nhất, các tín hiệu kích thích phân bào lại do chính các tế bào ung thư tự sản sinh ra. Lúc đó, tế bào được kích thích phân chia không giới hạn. Giai đoạn thúc đẩy Các tế bào trở nên “vô cảm” một cách bất thường với các tín hiệu ức chế phân bào.

Trong các tế bào bình thường, sự phân bào thường được kích hoạt bởi các tín hiệu nhất định; và tồn tại song song với chúng là các tín hiệu ức chế phân bào. Bình thường, hai cơ chế này tồn tại song song và phối hợp với nhau ở mức cân bằng, vì vậy sự phân bào diễn ra ổn định và có tổ chức. Ở các tế bào ung thư thì sự ngăn cản phân bào bị tê liệt, khi đó tế bào sẽ luôn được chuyển từ pha G1 sang S đề tiến hành sao chép ADN và bước vào một chu trình tế bào mới bất kể các sai Nguyễn Thị Chinh K18 Cao học Sinh học 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Tổng quan hỏng ADN có được khắc phục hay không. Các tế bào sau giai đoạn tăng trưởng này sẽ tiếp tục phát triển thành các khối u ác tính 3.

Giai đoạn chuyển biến Như ta đã biết, protein p53 giữ vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự tích lũy sai hỏng ADN có thể gây nguy hiểm cho cơ thể. Khi p53 bị mất chức năng này thì con đường apoptosis của tế bào không hoạt động. Vì vậy tế bào hỏng có thể sống và tiếp tục nhân lên nhanh chóng. Những tế bào này có xu hướng tạo ra các thế hệ tế bào con có mức độ sai hỏng còn cao hơn chính nó.

Hậu quả là mỗi tế bào con hình thành đều có nguy cơ chuyển thành các tế bào ung thư. Như vậy có thể nói, khả năng thoát khỏi cơ chế chết theo chương trình là “cột mốc” quan trọng để một tế bào ung thư phát triển thành khối u ác tính. Giai đoạn lan tràn Các tế bào ung thư có khả năng sao chép vô tận. Ở người, mỗi tế bào soma thường chỉ có khả năng sao chép trung bình khoảng 60 – 70 lần.

Tuy nhiên các tế bào ung thư có thể vượt quá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mút nhiễm sắc thể được kéo dài nhờ hoạt động mạnh của enzyme ADN telomerase. Khi các tế bào ung thư đạt đến giai đoạn này, chúng được gọi là các tế bào bất tử. Giai đoạn củng cố Các tế bào phát triển hệ thống tự nuôi dưỡng. Các mô trong cơ thể đa bào đều cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh dưỡng.

Các tế bào khối u tiền ác tính thường tăng trưởng chậm do chúng được nuôi dưỡng bởi hệ tuần hoàn bình thường. Nhưng ở các tế bào ung thư, khi khối u phát triển đến một mức nhất định thì xuất hiện sự hình thành mạch máu mới.