MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức phân tử là C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học, tính chất hƣơng liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị [11]. Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thƣờng tồn tại với hàm lƣợng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng.
Việt Nam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nƣớc có ý nghĩa rất thiết thực. Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng con đƣờng hóa học thƣờng đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chất xúc tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner [13].
Để khắc phục điều này, xu hƣớng nghiên cứu gần đây về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã hóa P450 và các redox partner của nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa cơ chất trong môi trƣờng tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn k m. Trong nghiên cứu trƣớc, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã đƣợc phát hiện có khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện tử cho enzyme này cũng đã đƣợc xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận chuyển điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin).
Đặc biệt, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / - ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện đƣợc bởi các quá trình chuyển hóa sinh học khác. Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban đầu 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhƣ tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thƣ (dẫn xuất của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn xuất của / -ionone) [26]. Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới. Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E.
coli tái tổ hợp để chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1 và 2 redox partner của nó, đƣợc điều khiển bởi promoter T7. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h c c c i i h ên h h ng ch nh h ch i n 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1. - Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene.
Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t chuy n h cơ ch t + Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR colony và giải trình tự gene. + Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phƣơng pháp đo nồng độ CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phƣơng pháp western blot. + Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phƣơng pháp HPLC. + Tối ƣu điều kiện chuyển hóa nootkatone.
- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa + Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm chuyển hóa bằng kỹ thuật GCMS. + Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel. + Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩ v hân ại * Định nghĩ Cytochrome P450 (thƣờng viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ bƣớc sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức hợp với CO (cacbon monooxit) [13]. P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm chí cả ở virus [20]. P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh và ngoại sinh. Số lƣợng P450 cao nhất ở thực vật, ở ngƣời có 57 enzyme P450 [13].coli không có enzyme P450 nào.
Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 đƣợc quy định bởi chữ CYP, theo sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt. Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1, CYP260A1. Cách gọi tên enzyme P450 * Phân loại Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã đƣợc tách dòng từ động vật, thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner.
Do P450 rất đa dạng trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú. Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử, Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau. - Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế bào nhân chuẩn. Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lƣu huỳnh, đến lƣợt ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này thực hiện chức năng xúc tác.
- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450 reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lƣới nội chất. CPR là một enzyme chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450. - Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii. Hệ thống này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme cytochrome cytochrome mới là P450cin.
- Nhóm 4: đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase. - Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450). - Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450). - Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450 (PFOR-P450).
- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử tƣơng tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450). - Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng NADH làm chất cho điện tử. P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện tử nhƣ: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13].
Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D). Trong đó: CPR: NADPH-P450 reductase FDX: ferredoxin FDR:NAD(P)H-ferredoxin ADX: Adrenodoxin reductase RH: Cơ chất ADR: NADPH - ROH: Sản phẩm.2 c củ cytochrome P450 P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lƣợng phân tử khoảng 45- 60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một chu i polypeptide. Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i chu i isozyme thƣờng có thể khác nhau rất nhiều (có trƣờng hợp khác đến 70%), hơn nữa đoạn amino acid đầu N thƣờng không giống nhau giữa các P450. Sự khác biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến hơn 95%.
M i isozyme đƣợc mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene mã hóa protein quy định [6]. Đến nay ngƣời ta đã biết đƣợc 1200 cấu trúc bậc I của P450. Các trình tự amino acid của các P450 cũng nhƣ trình tự của các nucleotide mã hóa chúng đƣợc 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lƣu trong GenBank. Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên kết bởi lực hydro kỵ nƣớc.
Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol thƣờng của gốc cysteine. Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nƣớc có khả năng trao đổi. Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhƣng một số cấu trúc đƣợc bảo toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ nhƣ gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần đầu carboxyl. Trong số những cytochrome đã đƣợc tách chiết, cytochrome P450cam là enzyme P450 đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và cộng sự [2].
Hình dạng tổng thể của P450cam tƣơng tự nhƣ một hình lăng trụ tam giác với đƣờng kính cực đại khoảng 60 Ǻ. Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam Vùng liên kết hem đƣợc mô tả bằng màu đen. Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của heme Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã đƣợc nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i -helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này. Sự khác biệt trong cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu cơ chất của các isozyme.
Vào đầu những năm 1990, ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc của một số enyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF (CYP107) và P450nor (CYP55) [6]. Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể đã xác định đƣợc cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn.