Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp CYP264B1 để chuyển hóa sesquiterpene

• Tác giả: Trần Thị Mai
• Người hướng dẫn: TS. Lý Thị Bích Thủy
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Định nghĩa và phân loại
• 1.2. Cấu trúc của cytochrome P450
• 1.3. Cơ chế xúc tác của cytochrome P450
• 1.4. Ứng dụng của cytochrome P450
• 1.5. Nghiên cứu về CYP264B1
• 1.6. Hợp chất sesquiterpene
• 1.6.1. Định nghĩa và nguồn gốc
• 1.6.2. Phân loại sesquiterpene
• 1.6.3. Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene
• 1.6.4. Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450
• 1.6.5. Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị thí nghiệm
• 2.3. Dung dịch và đệm
• 2.4. Môi trường
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc
• 2.5.2. Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx
• 2.5.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene
• 2.5.4. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone
• 2.5.5. Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu
• 2.5.6. Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa CYP264B1, AdR và Adx
• 3.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene
• 3.2.1. Khả năng biểu hiện gene CYP264B1
• 3.2.2. Khả năng biểu hiện của Adx
• 3.3. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx
• 3.4. Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu
• 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lên khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.5. Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa
• 3.5. Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene
• 3.5.1. Kết quả chuyển hóa longipinene
• 3.5.2. Kết quả chuyển hóa isolongifolene
• 3.5.3. Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu chuyển hóa sesquiterpene bằng CYP264B1

Nghiên cứu chuyển hóa sesquiterpene bằng hệ xúc tác E. coli tái tổ hợp CYP264B1 đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Sesquiterpene là nhóm hợp chất quan trọng, có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp. Việc sử dụng enzyme CYP264B1 từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum cho phép chuyển hóa các hợp chất này một cách hiệu quả. Hệ thống này không chỉ giúp tối ưu hóa quá trình chuyển hóa mà còn giảm thiểu tác động đến môi trường.

1.1. Định nghĩa và vai trò của sesquiterpene trong tự nhiên

Sesquiterpene là nhóm hợp chất hữu cơ có công thức phân tử C15H24, thường được tìm thấy trong thực vật. Chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương liệu và có hoạt tính sinh học cao, giúp bảo vệ thực vật khỏi sâu bệnh.

1.2. Tại sao chọn CYP264B1 cho nghiên cứu chuyển hóa

CYP264B1 là enzyme cytochrome P450 có khả năng hydroxyl hóa chọn lọc các hợp chất sesquiterpene. Enzyme này cho phép thực hiện các phản ứng chuyển hóa ở điều kiện nhẹ nhàng, giảm thiểu chất thải độc hại.

II. Thách thức trong nghiên cứu chuyển hóa sesquiterpene

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc chuyển hóa sesquiterpene vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các enzyme tự nhiên thường có hiệu suất thấp và điều kiện phản ứng khắc nghiệt. Việc phát triển hệ xúc tác sinh học như E. coli tái tổ hợp CYP264B1 giúp giải quyết những vấn đề này. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để tối ưu hóa điều kiện chuyển hóa.

2.1. Vấn đề về hiệu suất chuyển hóa của enzyme

Nhiều enzyme P450 có hiệu suất chuyển hóa thấp, dẫn đến việc cần nhiều nguyên liệu và thời gian. Việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng là cần thiết để nâng cao hiệu suất.

2.2. Tác động môi trường từ quá trình chuyển hóa

Quá trình chuyển hóa hóa học truyền thống thường tạo ra nhiều chất thải độc hại. Hệ xúc tác sinh học như CYP264B1 giúp giảm thiểu tác động này, nhưng vẫn cần nghiên cứu để đảm bảo tính bền vững.

III. Phương pháp nghiên cứu chuyển hóa sesquiterpene bằng CYP264B1

Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp để chuyển hóa sesquiterpene thông qua các bước như nhân dòng plasmid và kiểm tra khả năng biểu hiện gene. Phương pháp này cho phép tối ưu hóa điều kiện chuyển hóa và nâng cao hiệu suất sản phẩm.

3.1. Nhân dòng plasmid và kiểm tra gene CYP264B1

Quá trình nhân dòng plasmid giúp tạo ra các tế bào E. coli mang gene CYP264B1. Kiểm tra gene bằng kỹ thuật PCR colony đảm bảo sự hiện diện của gene trong tế bào.

3.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme CYP264B1

Sử dụng phương pháp Western blot để xác định khả năng biểu hiện của enzyme CYP264B1 trong tế bào E. coli. Điều này giúp đánh giá hiệu quả của hệ xúc tác.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ xúc tác E. coli tái tổ hợp CYP264B1 có khả năng chuyển hóa hiệu quả một số hợp chất sesquiterpene. Các sản phẩm chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm. Việc tối ưu hóa điều kiện chuyển hóa đã giúp nâng cao năng suất sản phẩm.

4.1. Kết quả chuyển hóa longipinene và isolongifolene

Hệ xúc tác đã thành công trong việc chuyển hóa longipinene và isolongifolene, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao. Phân tích sản phẩm bằng GCMS cho thấy sự khác biệt rõ rệt về cấu trúc.

4.2. Ứng dụng sản phẩm chuyển hóa trong công nghiệp

Các sản phẩm chuyển hóa từ sesquiterpene có thể được sử dụng trong sản xuất hương liệu và dược phẩm. Điều này mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp sinh học.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu chuyển hóa sesquiterpene bằng hệ xúc tác E. coli tái tổ hợp CYP264B1 đã mở ra hướng đi mới trong công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và giải quyết các vấn đề môi trường. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng.

5.1. Tương lai của enzyme CYP264B1 trong nghiên cứu

CYP264B1 có tiềm năng lớn trong việc chuyển hóa nhiều hợp chất khác nhau. Nghiên cứu sâu hơn về enzyme này có thể dẫn đến những phát hiện mới trong lĩnh vực sinh học.

5.2. Hướng phát triển công nghệ sinh học bền vững

Việc phát triển các hệ xúc tác sinh học như CYP264B1 sẽ giúp giảm thiểu tác động đến môi trường. Công nghệ này có thể được áp dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp.