Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật đại cương tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tài liệu nghiên cứu Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật đại cương trường đh bách khoa hà nội, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh
• Đề tài: Tài Liệu Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Cơ Bản
• Loại tài liệu: Tài liệu thí nghiệm
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM
• 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT
• 2.1. Vật liệu và phương pháp
• 2.2. Phương pháp tiến hành
• 3. PHÂN LẬP VI SINH VẬT - Phân lập vi sinh vật hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp amylase
• 3.1. Vật liệu và phương pháp
• 3.2. Phương pháp
• 4. PHÂN LẬP VI SINH VẬT - Phân lập vi sinh vật yếm khí
• 4.1. Vật liệu
• 4.2. Phương pháp thực hiện
• 5. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
• 5.1. Mở đầu
• 5.2. Vật liệu và phương pháp

Tóm tắt

I. Tổng quan về tài liệu thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật cơ bản tại Đại học Bách Khoa Hà Nội cung cấp những kiến thức cần thiết cho sinh viên trong lĩnh vực khoa học vi sinh vật. Tài liệu này không chỉ giúp sinh viên nắm vững lý thuyết mà còn thực hành các kỹ thuật thí nghiệm cơ bản. Nội dung tài liệu bao gồm các phương pháp gieo cấy, phân lập vi sinh vật, và định lượng vi sinh vật. Việc thực hành các thí nghiệm này là rất quan trọng để sinh viên có thể áp dụng kiến thức vào thực tiễn.

1.1. Nội dung chính của tài liệu thí nghiệm vi sinh vật

Tài liệu bao gồm các phần như môi trường dinh dưỡng, phương pháp gieo cấy, và các kỹ thuật phân lập vi sinh vật. Mỗi phần đều có hướng dẫn chi tiết về cách thực hiện và các lưu ý cần thiết.

1.2. Mục tiêu của tài liệu thí nghiệm vi sinh vật

Mục tiêu chính của tài liệu là giúp sinh viên hiểu rõ về các phương pháp thí nghiệm vi sinh vật, từ đó nâng cao kỹ năng thực hành và khả năng nghiên cứu trong lĩnh vực này.

II. Thách thức trong việc thực hiện thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Việc thực hiện thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội gặp phải một số thách thức. Đầu tiên là vấn đề về an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm. Sinh viên cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về an toàn để đảm bảo không xảy ra sự cố. Thứ hai, việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dụng cụ thí nghiệm cũng đòi hỏi sự chính xác cao. Cuối cùng, việc phân lập và định lượng vi sinh vật cũng có thể gặp khó khăn nếu không thực hiện đúng quy trình.

2.1. Vấn đề an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm

An toàn sinh học là yếu tố quan trọng trong thí nghiệm vi sinh vật. Sinh viên cần được đào tạo về cách sử dụng hóa chất và thiết bị an toàn để tránh rủi ro.

2.2. Khó khăn trong việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy đòi hỏi sự chính xác trong việc cân đo và pha chế. Bất kỳ sai sót nào cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.

III. Phương pháp thí nghiệm vi sinh vật cơ bản tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội giới thiệu nhiều phương pháp thí nghiệm cơ bản. Các phương pháp này bao gồm cấy trải trên đĩa thạch, phân lập vi sinh vật hiếu khí và yếm khí, cũng như định lượng vi sinh vật. Mỗi phương pháp đều có hướng dẫn chi tiết và yêu cầu cụ thể để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong thí nghiệm.

3.1. Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch

Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là một trong những kỹ thuật phổ biến để định lượng vi sinh vật. Kỹ thuật này giúp xác định số lượng khuẩn lạc trong mẫu thí nghiệm.

3.2. Phân lập vi sinh vật hiếu khí và yếm khí

Phân lập vi sinh vật hiếu khí và yếm khí là bước quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật. Các phương pháp này giúp tách biệt các loài vi sinh vật khác nhau để nghiên cứu sâu hơn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Các thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội không chỉ mang tính lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Kết quả từ các thí nghiệm này có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, và môi trường. Việc nghiên cứu và phát triển các chủng vi sinh vật có lợi cũng là một trong những mục tiêu quan trọng.

4.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất thực phẩm như sữa chua, bia, và rượu. Các thí nghiệm giúp cải thiện chất lượng và an toàn thực phẩm.

4.2. Ứng dụng trong y học

Nghiên cứu vi sinh vật có thể dẫn đến phát triển các loại thuốc kháng sinh và vaccine, góp phần quan trọng trong việc điều trị bệnh.

V. Kết luận và tương lai của thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật tại Đại học Bách Khoa Hà Nội đóng vai trò quan trọng trong việc đào tạo sinh viên. Những kiến thức và kỹ năng thu được từ các thí nghiệm này sẽ giúp sinh viên tự tin hơn trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong thực tiễn. Tương lai của lĩnh vực này hứa hẹn sẽ có nhiều tiến bộ với sự phát triển của công nghệ và nghiên cứu mới.

5.1. Tầm quan trọng của thí nghiệm vi sinh vật trong giáo dục

Thí nghiệm vi sinh vật là một phần không thể thiếu trong chương trình đào tạo, giúp sinh viên nắm vững kiến thức và kỹ năng cần thiết.

5.2. Triển vọng phát triển trong nghiên cứu vi sinh vật

Nghiên cứu vi sinh vật sẽ tiếp tục phát triển, mở ra nhiều cơ hội mới trong các lĩnh vực như y học, công nghệ thực phẩm và bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan về giáo trình

Tài liệu thí nghiệm Vi sinh vật đại cương được biên soạn bởi Bộ môn Vi sinh - Hoá sinh – Sinh học Phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội (ban hành nội bộ năm 2021). Đây là tài liệu học tập và hướng dẫn thực hành bắt buộc, giữ vai trò nền tảng trong chương trình đào tạo kỹ sư và cử nhân các ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm và Kỹ thuật Hóa sinh.

Mục tiêu học tập của tài liệu tập trung vào việc trang bị cho người học:

• Hiểu và thực thi các quy tắc an toàn sinh học, an toàn hóa chất và xử lý chất thải trong phòng thí nghiệm vi sinh.
• Làm chủ kỹ thuật pha chế, khử trùng các loại môi trường dinh dưỡng (môi trường lỏng, thạch đứng, thạch nghiêng, đĩa Petri).
• Thực hiện thành thạo các thao tác gieo cấy vô trùng, phân lập vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí từ nguồn mẫu tự nhiên và thực phẩm.
• Áp dụng các phương pháp định lượng vi sinh vật trực tiếp (buồng đếm hồng cầu Neubauer) và gián tiếp (cấy trải đĩa thạch, phương pháp MPN, phương pháp lắng không khí Omelianxki).
• Chuẩn bị tiêu bản quan sát hình thái tế bào (tiêu bản giọt ép, tiêu bản cố định, nhuộm đơn, nhuộm Gram).
• Đánh giá các hoạt tính sinh hóa đặc trưng như khả năng lên men sinh khí và sinh tổng hợp enzyme amylase ngoại bào.
• Vận hành đúng quy trình kỹ thuật các thiết bị chuyên dụng như nồi hấp thanh trùng, tủ cấy vô trùng Clean bench, tủ an toàn sinh học cấp 2, tủ nuôi lắc và kính hiển vi quang học.

Cấu trúc tài liệu được thiết kế theo tiến trình thực nghiệm logic: mở đầu bằng nội quy an toàn, tiếp nối bằng 10 bài thực hành chuyên đề thao tác từ cơ bản đến nâng cao, và kết thúc bằng phần hướng dẫn vận hành thiết bị cùng phụ lục công thức môi trường nuôi cấy. Điểm đặc trưng của tài liệu là tính định lượng rõ ràng, cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết (nồng độ, nhiệt độ, thời gian, kích thước vi mô) và sơ đồ thực hiện chuẩn hóa cho từng bài thí nghiệm.

---

Nội dung kiến thức cốt lõi

Các chương/chủ đề chính

Tài liệu được chia thành các chuyên đề thực hành và hướng dẫn kỹ thuật sau:

1. Nội quy phòng thí nghiệm và quy định an toàn: Quy định quy tắc vô trùng khi thao tác; quản lý và phân loại chất thải (chất thải sinh học vi sinh vật phải được hấp thanh trùng ở 121°C trong 30 phút trước khi xả thải; phân loại chất thải lỏng gồm axit, bazơ, dung môi, kim loại nặng; lưu trữ chất thải rắn độc hại trong tủ hút).

2. Môi trường dinh dưỡng và các phương pháp gieo cấy vi sinh vật: Quy trình cân, hòa tan, bổ sung chất đông tụ (agar 2%), phân phối vào ống nghiệm (thạch nghiêng 5–6 mL, thạch đứng 10 mL, môi trường lỏng 1/4 thể tích ống) hoặc đĩa Petri (15–20 mL), khử trùng bằng hơi nước bão hòa có áp suất. Kỹ thuật thao tác vô trùng trong phạm vi đối lưu 20 cm quanh ngọn lửa đèn cồn; các phương pháp cấy: cấy ria vết cạn dần (Streak technique), cấy đâm sâu thạch đứng để theo dõi khả năng di động và tính chất hô hấp, cấy chấm điểm và cấy trải.

3. Phân lập vi sinh vật hiếu khí và yếm khí:

   • Phân lập vi sinh vật hiếu khí sinh amylase: Sử dụng mẫu tương bần và bánh men, pha loãng mẫu theo hệ số 10 trong nước muối sinh lý, nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc Czapek có nguồn carbon là tinh bột tan ở 30°C trong 2 ngày; nguyên lý sử dụng kháng sinh cycloheximide (ức chế nấm) hoặc tetracycline (ức chế vi khuẩn).
   • Phân lập vi sinh vật yếm khí tùy tiện: Phân lập Lactobacillus casei từ sữa chua uống Yakult trên môi trường MRS, áp dụng kỹ thuật đổ thạch hai lớp (lớp thạch agar 1.5% giữ ấm ở 45–50°C đổ phủ lên trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy mẫu), nuôi ở 37°C trong 2–4 ngày.

4. Các phương pháp định lượng vi sinh vật:

   • Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch (Spread plate technique): Định lượng CFU/mL hoặc CFU/g với dải đếm chuẩn 30–300 khuẩn lạc/đĩa 90 mm; phương pháp lắng Omelianxki định lượng vi sinh vật không khí (diện tích 100 cm² mở trong 5 phút tương đương 10 lít không khí).
   • Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN): Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform chỉ thị ô nhiễm phân trong mẫu nước tự nhiên qua 3 xét nghiệm (giả định, xác nhận trên môi trường thạch EMB, hoàn thành); sử dụng tổ hợp 3 ống nghiệm (F1 nồng độ kép 10 mL, F2 nồng độ đơn 1 mL, F3 nồng độ đơn 0.1 mL) có đặt ống Durham úp ngược để phát hiện khí lên men lactose sau 48±2 giờ ở 35°C, tra bảng thống kê ở độ tin cậy 95%.
   • Phương pháp định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer: Xác định mật độ tế bào nấm men; kích thước buồng đếm 30 × 70 mm, dày 4 mm, chiều sâu lưới đếm $h = 0.1\text{ mm}$; diện tích lưới $3 \times 3\text{ mm}$ gồm 9 ô vuông lớn $1\text{ mm}^2$; ô trung tâm chia thành 25 ô vuông vừa ($0.2\text{ mm} \times 0.2\text{ mm}$), mỗi ô vừa gồm 16 ô nhỏ ($0.05\text{ mm} \times 0.05\text{ mm}$); đếm tế bào ở 5 ô chéo (hoặc 4 góc và 1 tâm) ở dải 25–250 tế bào/ô tại vật kính 40X; tính mật độ theo công thức: $$\text{Mật độ (tế bào/mL)} = \frac{a \times 1000 \times D_f}{S \times h}$$

5. Quan sát hình thái và kỹ thuật nhuộm màu:

   • Tiêu bản giọt ép (Wet mount slide): Đánh giá nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula mucilaginosa); dùng xanh methylen 1% để phân biệt tế bào sống (không màu) và tế bào chết (bắt màu); dùng NaOH 10% hoặc H₂SO₄ 10% đánh giá tỷ lệ nảy chồi; kiểm tra độ thuần khiết của canh trường.
   • Tiêu bản cố định (Smear slide): Áp dụng trên Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus sp.; kỹ thuật dàn vết bôi, làm khô, cố định bằng nhiệt (ngọn lửa đèn cồn) hoặc hóa chất (cồn tuyệt đối, cồn 95°, cồn metylic, axeton); nhuộm đơn bằng Fuchsin Ziehl (1–2 phút) hoặc xanh methylen (3–5 phút); quan sát ở vật kính 100X soi dầu.
   • Nhuộm Gram: Phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm dựa trên quy trình chuẩn: tím tinh thể (1 phút) $\rightarrow$ dung dịch Lugol (1 phút) $\rightarrow$ tẩy màu bằng cồn (15 giây) $\rightarrow$ nhuộm bổ sung bằng Fuchsin (30–60 giây).

6. Đánh giá đặc tính sinh hóa và hoạt tính enzyme:

   • Đánh giá khả năng lên men: Đo chiều cao cột khí CO₂ sinh ra trong ống Durham úp ngược chứa môi trường lên men saccharose lỏng sau 24–48 giờ ở 30°C.
   • Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme $\alpha$-amylase: Cấy chấm điểm vi sinh vật lên môi trường Czapek tinh bột; sau 2 ngày nuôi ở 30°C, bổ sung dung dịch iod/Lugol 1% để tạo phức màu với tinh bột; đo đường kính vòng phân giải ($D_{\text{vòng}}$) và đường kính khuẩn lạc ($d_{\text{khuẩn lạc}}$), tính tỷ lệ $D_{\text{vòng}} / d_{\text{khuẩn lạc}}$.

7. Hướng dẫn vận hành trang thiết bị vi sinh: Nguyên lý và quy trình vận hành nồi hấp thanh trùng hơi nước bão hòa; tủ vô trùng dạng thổi đứng (Clean bench) trang bị màng lọc HEPA; tủ an toàn sinh học cấp 2 (Biosafety Cabinet) với chu trình đếm ngược 3 phút và cảm biến vị trí kính (Sash height); tủ nuôi tĩnh FOC215E (dải nhiệt 3–50°C); tủ nuôi lắc Labtech LSI-3016R (dải lắc 0–300 rpm, nhiệt độ 10–60°C); cấu tạo và quy trình sử dụng kính hiển vi quang học (vật kính 10X, 40X, 100X soi dầu sử dụng kèm dầu soi và dung môi toluen để làm sạch).

Kiến thức nền tảng được xây dựng

• Nguyên lý kiểm soát vô trùng và tiệt trùng: Nắm vững cơ chế bất hoạt vi sinh vật và bào tử bằng nhiệt ẩm (hơi nước bão hòa dưới áp suất cao), bức xạ cực tím (đèn UV bước sóng ngắn) và màng lọc không khí hiệu năng cao (HEPA filter).
• Cấu trúc sinh học tế bào: Hiểu rõ sự khác biệt về cấu trúc thành tế bào peptidoglycan giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm dẫn đến cơ chế giữ phức màu tím tinh thể - iod sau khi tẩy cồn; tính thấm chọn lọc của màng tế bào nấm men sống và chết đối với các chất thị màu.
• Đặc tính sinh lý và chuyển hóa: Phân loại vi sinh vật theo nhu cầu oxy (hiếu khí bắt buộc, kỵ khí tùy tiện, kỵ khí nghiêm ngặt); cơ chế phân giải tinh bột ngoại bào của enzyme amylase và con đường lên men tạo ethanol và CO₂.
• Nguyên lý thống kê và định lượng sinh học: Áp dụng phương pháp xác suất Poisson trong định lượng MPN và tính toán thể tích chính xác trong buồng đếm tế bào.

Kỹ năng phát triển

• Kỹ năng thao tác kỹ thuật (Technical skills): Cầm và sử dụng que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang; thao tác micropipette chính xác ở các thể tích nhỏ ($100,\mu\text{L}$, $1000,\mu\text{L}$); kỹ thuật làm vết bôi mỏng đồng đều, cố định nhiệt và nhuộm vi sinh vật; kỹ thuật soi kính hiển vi ở vật kính dầu 100X.
• Kỹ năng phân tích và xử lý số liệu (Analytical skills): Quan sát và ghi nhận đặc điểm hình thái khuẩn lạc (kích thước, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, núm trung tâm, màu sắc, tính khuếch tán sắc tố); tính toán mật độ vi sinh vật có kèm sai số thống kê; tra cứu và giải thích bảng chỉ số MPN với độ tin cậy 95%.
• Kỹ năng an toàn và tổ chức phòng thí nghiệm (Practical competencies): Tuân thủ quy định bảo hộ cá nhân (áo blouse); xử lý và phân loại rác thải nguy hại sinh học và hóa học đúng quy định; vận hành các thiết bị áp lực và tủ nuôi cấy theo đúng quy trình chuẩn.

---

Phương pháp giảng dạy và học tập

Tài liệu áp dụng phương pháp tiếp cận thực hành chuẩn hóa (Standard Operating Procedure - SOP), gắn liền lý thuyết vi sinh vật học đại cương với kỹ năng thao tác thực nghiệm trực tiếp tại phòng lab.

Cấu trúc mỗi bài thí nghiệm được xây dựng thống nhất theo 3 phần rõ ràng:

1. Mở đầu (Nguyên lý): Giải thích ngắn gọn cơ sở khoa học, cơ chế phản ứng sinh hóa hoặc nguyên lý vật lý của phép thử.
2. Vật liệu và phương pháp: Liệt kê cụ thể chủng vi sinh vật (E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, L. casei...), hóa chất, môi trường nuôi cấy (Czapek, MRS, TSA, NA, Lactose) và dụng cụ cần chuẩn bị; trình bày các bước thực hiện chi tiết kèm thông số thời gian, nhiệt độ và thể tích.
3. Kết quả và thảo luận: Hướng dẫn sinh viên cách ghi nhận hiện tượng, vẽ hình thái hoặc chụp ảnh khuẩn lạc/tiêu bản tế bào, tính toán mật độ theo công thức và lập luận giải thích các hiện tượng sai lệch nếu có.

Quy trình đánh giá kết quả học tập của sinh viên dựa trên:

• Kỹ năng thao tác vô trùng và mức độ tuân thủ an toàn trong suốt buổi thực hành.
• Kết quả tạo mẫu (độ thuần khiết của đĩa phân lập, chất lượng tiêu bản nhuộm màu không bị cặn, đĩa cấy trải không bị rách thạch).
• Báo cáo thí nghiệm: Bắt buộc hoàn thành đầy đủ mục đích, phương pháp, bảng biểu số liệu thực nghiệm, tính toán sai số thống kê và phần nhận xét - thảo luận khoa học.

Đối với việc tự học, sinh viên được yêu cầu đọc trước tài liệu, chuẩn bị trước sơ đồ pha loãng mẫu, hiểu rõ nồng độ hóa chất cần sử dụng và ghi chép nhật ký sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm đầy đủ.

---

Điểm nổi bật và cập nhật

• Tích hợp các tiêu chuẩn và tài liệu tham khảo chuẩn mực: Phương pháp định lượng nhóm vi khuẩn Coliform bằng MPN được thiết kế trực tiếp theo tài liệu Guidelines for drinking-water quality (2nd Edition, 1997) của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO); quy trình nhuộm Gram được đối chiếu theo Gram stain protocols của Hiệp hội Vi sinh vật học Hoa Kỳ (American Society for Microbiology - ASM); các nguyên lý thực hành kế thừa từ các giáo trình quốc tế như Brock Biology of Microorganisms (Madigan MT và cộng sự, 2011) và Microbiological Applications Laboratory Manual (Benson HJ, 2001).
• Quy chuẩn kỹ thuật vận hành thiết bị hiện đại: Hướng dẫn chi tiết từng bước vận hành các thiết bị thực tế tại phòng lab như tủ an toàn sinh học cấp 2 (Biosafety Cabinet) với chu trình đếm ngược khởi động 3 phút và quy định vị trí kính chắn an toàn; tủ nuôi lắc ổn nhiệt Labtech LSI-3016R (kiểm soát tốc độ lắc và nhiệt độ làm việc từ 10–60°C); tủ nuôi tĩnh FOC215E.
• Tiêu chuẩn an toàn sinh học nghiêm ngặt: Đưa ra các mốc thông số cụ thể về xử lý rác thải sinh học (hấp nhiệt 121°C trong 30 phút trước khi thải bỏ) và quản lý hóa chất độc hại, dung môi bay hơi qua hệ thống tủ hút chuyên dụng.

---

Đối tượng sử dụng giáo trình

• Sinh viên đại học: Sinh viên các ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Kỹ thuật Hóa học, Kỹ thuật Môi trường tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và các cơ sở giáo dục đại học khối kỹ thuật, công nghệ.
• Kiến thức tiên quyết (Prerequisites): Sinh viên cần hoàn thành hoặc đang theo học các học phần lý thuyết Vi sinh vật học đại cương, Hóa sinh học, Hóa vô cơ và Hóa phân tích cơ bản để hiểu rõ các cơ chế phản ứng và kỹ thuật tính toán nồng độ dung dịch.
• Giảng viên và trợ giảng: Sử dụng làm tài liệu giảng dạy thực hành chuẩn, căn cứ để hướng dẫn sinh viên thao tác tại phòng thí nghiệm và xây dựng biểu mẫu chấm điểm kỹ năng thực hành.
• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và nghiên cứu viên: Dùng làm tài liệu tra cứu các công thức pha chế môi trường dinh dưỡng thường quy (Czapek, MRS, TSA, NA, broth lactose), bảng tra cứu số liệu MPN 95% và quy trình bảo trì, hiệu chỉnh thiết bị nuôi cấy vi sinh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tài liệu này phù hợp cho đối tượng nào?

Tài liệu được biên soạn trực tiếp cho sinh viên đại học khối ngành Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm tham gia học phần thực hành Vi sinh vật đại cương, đồng thời là tài liệu tham khảo cho kỹ thuật viên phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản.

2. Cần chuẩn bị những kiến thức nền tảng nào trước khi học?

Người học cần nắm vững kiến thức lý thuyết về đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào vi khuẩn, nấm men; các kiểu trao đổi chất và hô hấp của vi sinh vật; kỹ thuật tính toán nồng độ hóa chất và quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm hóa - sinh.

3. Điểm khác biệt của tài liệu này so với các sách lý thuyết vi sinh là gì?

Tài liệu tập trung hoàn toàn vào kỹ năng thực hành và phương pháp thực nghiệm. Mỗi bài học đều cung cấp quy trình thao tác từng bước (SOP), bảng định lượng thành phần môi trường, công thức tính toán mật độ vi sinh vật cụ thể và hướng dẫn chi tiết cách vận hành từng model máy móc thực tế.

4. Làm thế nào để học và làm việc trong phòng thí nghiệm đạt hiệu quả cao nhất?

Sinh viên cần đọc trước bài thí nghiệm, vẽ trước sơ đồ các bước pha loãng và phân phối môi trường vào sổ tay thí nghiệm; ghi nhớ các thông số an toàn (nhiệt độ thanh trùng 110°C hoặc 121°C, thời gian nhuộm màu từng loại thuốc nhuộm); và tuân thủ nghiêm ngặt kỹ thuật vô trùng trong suốt quá trình gieo cấy.

5. Tài liệu có đi kèm các nguồn tham khảo học thuật bổ trợ nào?

Tài liệu trích dẫn và đối chiếu với các nguồn tham khảo uy tín gồm: tài liệu kiểm định vi sinh nguồn nước của WHO (1997), giáo trình Brock Biology of Microorganisms (Madigan MT et al., 2011), cẩm nang thí nghiệm vi sinh của Benson (2001) và tiêu chuẩn nhuộm Gram của American Society for Microbiology (ASM).

---

Kết luận

Tài liệu thí nghiệm Vi sinh vật đại cương của Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội là tài liệu hướng dẫn thực nghiệm mang tính chuẩn mực, hệ thống và chi tiết. Nội dung tài liệu bao quát toàn diện các kỹ thuật nền tảng: từ vô trùng, pha chế môi trường, phân lập, định lượng (trực tiếp và gián tiếp), nhuộm soi hình thái đến kiểm tra hoạt tính sinh hóa của vi sinh vật.

Tiến trình bài giảng được thiết kế mạch lạc giúp sinh viên từng bước nâng cao kỹ năng thực hành, rèn luyện tư duy thu thập và xử lý số liệu khoa học chính xác. Việc kết hợp chặt chẽ giữa quy trình thao tác và hướng dẫn vận hành thiết bị chuyên dụng tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc cho các học phần chuyên ngành và đề tài nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu - Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là phương pháp định lượng gián tiếp vi sinh vật dựa trên sự phát triển của các tế bào vi sinh vật thành các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng rắn khi mẫu nghiên cứu được trải trên bề mặt của môi trường (spread plate technique) hoặc khi mẫu nghiên cứu được trộn với môi trường dinh dưỡng khi còn ở dạng lỏng và đổ vào dụng cụ nuôi cấy sau đó để đông lại (pour plate technique). Phương pháp này chỉ xác định được mật độ vi sinh vật sống trong mẫu. - Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường lỏng hoặc g môi trường rắn. - Nếu số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm lớn (105 – 1012 tế bào/ml), trước khi tiến hành trải đĩa hoặc đổ đĩa, mẫu nghiên cứu phải được pha loãng.

Mẫu được pha loãng tới số khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 trên mỗi đĩa petri 90 mm. - Để xác định mật độ vi sinh vật có trong mẫu không khí, một phương pháp đơn giản thường được sử dụng là phương pháp có nguyên tắc dựa trên ước tính của Omelianxki: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí. Vật liệu và phương pháp 2. Vật liệu - Mẫu nghiên cứu cần xác định hàm lượng vi sinh vật ở trạng thái: rắn, lỏng và khí - Môi trường nuôi cấy: môi trường phổ dụng TSA - NaCl - Bình tam giác, micropipette 1 mL, 100 µL - Ống Eppendorf 1.5 mL, đầu tip 1 mL, 100 µL vô trùng - Que trang 2.2 Phương pháp a.

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, vô trùng môi trường và dụng cụ cần thiết: - Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2 - Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi hấp áp lực và sấy khô. Định lượng vi sinh vật trong mẫu vật rắn và lỏng Chuẩn bị và pha loãng mẫu: - Hút 900 uL nước muối sinh lý đã vô trùng vào mỗi ống Eppendorf 1. Số lượng ống Eppendorf cần chuẩn bị phụ thuộc vào sơ đồ pha loãng được thảo luận trên lớp. - Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý vô trùng, mẫu đã được pha loãng 1:100.

Lắc để trộn đều mẫu. Đối với mẫu sinh vật kỵ khí, để hạn chế vi sinh vật kỵ khí trong mẫu tiếp xúc với oxy, bước pha loãng đầu tiên nên được thực hiện trong ống Eppendorf. Mẫu trong bình tam giác được lắc đều cho vi sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng. - Pha loãng lần lượt theo hệ số 10 vào các ống Eppendorf chứa sẵn nước muối sinh lý bằng cách hút 100 uL của dịch pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa muối sinh lý mới.

Trộn mẫu trên máy vortex ngay sau khi hút mẫu vào. Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu phẩm rắn. Mức độ pha loãng tùy thuộc vào mẫu cụ thể được sử dụng trong buổi thí nghiệm Cấy mẫu: - Kí hiệu tên mẫu, độ pha loãng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng - Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri - Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến khi mặt thạch se lại 19 - Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để nuôi trong 24 – 48h để khuẩn lạc hình thành Kiểm tra mẫu: - Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch, lựa chọn những đĩa có số lương khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 để đếm chính xác số lượng khuẩn lạc, ghi lại số lượng khuẩn lạc trên đĩa có độ pha loãng tương ứng vào sổ thí nghiệm và sử dụng những giá trị này để tính toán. - Tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ đồ pha loãng.

b) Đối với mẫu không khí: sử dụng phương pháp lắng của Omelianxki - Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng - Đặt hộp Petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu. Chú ý lựa chọn những khu vực có không khí tĩnh, không có gió. - Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút). - Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ - Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch - Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki.

Báo cáo thí nghiệm: Báo cáo thí nghiệm gồm các phần: 1. Vật liệu và phương pháp 3. Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch, báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính toán mật độ vi sinh vật trong mỗi mẫu 20 5. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER) Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên 1.

Mở đầu Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là phương pháp định lượng vi sinh vật được sử dụng rất nhiều trong thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường. MPN xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu phẩm một cách gián tiếp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng trong các tổ hợp gồm 3-5 ống nghiệm ở các độ pha loãng hơn kém nhau 10 lần. Tổng hợp kết quả ống dương tính đối với sự phát triển của vi sinh vật là cơ sở để tính toán giá trị mật độ vi sinh vật trong mẫu. Trong bài này, sinh viên kiểm tra sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.

Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo, động vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v. Nước tự nhiên có thể bị ô nhiễm phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao. Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên, việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến hành. Coliform được xem là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường không có mặt trong môi trường nước tự nhiên, môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong môi trường nước tự nhiên hơn các loài vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và (4) việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản.

Coliform là nhóm các vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose sinh ra acid và giải phóng khí ở 35°C sau 48±2 h. Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hoàn thành. + Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48±2 h ở nhiệt độ 35°C. + Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm giả định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: môi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương (những loài cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).

21 + Thí nghiệm hoàn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường ở thí nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que, và không sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform). Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number). Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

Vật liệu và phương pháp 2. Vật liệu - Mẫu nước - Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL - Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL - Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men lactose 2. Phương pháp Chuẩn bị môi trường Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau Bảng 5-1 Thành phần môi trường Thành phần Nồng độ kép Nồng độ đơn Peptone 10g 5g Lactose 10g 5g Cao thịt bò 6g 3g Nước 1000 mL 1000 mL pH được điều chỉnh đến 6.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau: Bảng 5-2. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm 22 Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Số lượng ống F1 Nồng độ kép 10 mL 3 F2 Nồng độ đơn 10 mL 3 F3 Nồng độ đơn 10 mL 3 Các ống chứa môi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút.

Lấy mẫu: Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo tiêu chuẩn Việt Nam hoặc quốc tế (WHO – World Health Organization) về lấy mẫu nước.