Mở đầu - Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là phương pháp định lượng gián tiếp vi sinh vật dựa trên sự phát triển của các tế bào vi sinh vật thành các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng rắn khi mẫu nghiên cứu được trải trên bề mặt của môi trường (spread plate technique) hoặc khi mẫu nghiên cứu được trộn với môi trường dinh dưỡng khi còn ở dạng lỏng và đổ vào dụng cụ nuôi cấy sau đó để đông lại (pour plate technique). Phương pháp này chỉ xác định được mật độ vi sinh vật sống trong mẫu. - Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường lỏng hoặc g môi trường rắn. - Nếu số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm lớn (105 – 1012 tế bào/ml), trước khi tiến hành trải đĩa hoặc đổ đĩa, mẫu nghiên cứu phải được pha loãng.
Mẫu được pha loãng tới số khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 trên mỗi đĩa petri 90 mm. - Để xác định mật độ vi sinh vật có trong mẫu không khí, một phương pháp đơn giản thường được sử dụng là phương pháp có nguyên tắc dựa trên ước tính của Omelianxki: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí. Vật liệu và phương pháp 2. Vật liệu - Mẫu nghiên cứu cần xác định hàm lượng vi sinh vật ở trạng thái: rắn, lỏng và khí - Môi trường nuôi cấy: môi trường phổ dụng TSA - NaCl - Bình tam giác, micropipette 1 mL, 100 µL - Ống Eppendorf 1.5 mL, đầu tip 1 mL, 100 µL vô trùng - Que trang 2.2 Phương pháp a.
Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, vô trùng môi trường và dụng cụ cần thiết: - Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2 - Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi hấp áp lực và sấy khô. Định lượng vi sinh vật trong mẫu vật rắn và lỏng Chuẩn bị và pha loãng mẫu: - Hút 900 uL nước muối sinh lý đã vô trùng vào mỗi ống Eppendorf 1. Số lượng ống Eppendorf cần chuẩn bị phụ thuộc vào sơ đồ pha loãng được thảo luận trên lớp. - Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý vô trùng, mẫu đã được pha loãng 1:100.
Lắc để trộn đều mẫu. Đối với mẫu sinh vật kỵ khí, để hạn chế vi sinh vật kỵ khí trong mẫu tiếp xúc với oxy, bước pha loãng đầu tiên nên được thực hiện trong ống Eppendorf. Mẫu trong bình tam giác được lắc đều cho vi sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng. - Pha loãng lần lượt theo hệ số 10 vào các ống Eppendorf chứa sẵn nước muối sinh lý bằng cách hút 100 uL của dịch pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa muối sinh lý mới.
Trộn mẫu trên máy vortex ngay sau khi hút mẫu vào. Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu phẩm rắn. Mức độ pha loãng tùy thuộc vào mẫu cụ thể được sử dụng trong buổi thí nghiệm Cấy mẫu: - Kí hiệu tên mẫu, độ pha loãng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng - Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri - Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến khi mặt thạch se lại 19 - Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để nuôi trong 24 – 48h để khuẩn lạc hình thành Kiểm tra mẫu: - Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch, lựa chọn những đĩa có số lương khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 để đếm chính xác số lượng khuẩn lạc, ghi lại số lượng khuẩn lạc trên đĩa có độ pha loãng tương ứng vào sổ thí nghiệm và sử dụng những giá trị này để tính toán. - Tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ đồ pha loãng.
b) Đối với mẫu không khí: sử dụng phương pháp lắng của Omelianxki - Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng - Đặt hộp Petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu. Chú ý lựa chọn những khu vực có không khí tĩnh, không có gió. - Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút). - Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ - Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch - Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki.
Báo cáo thí nghiệm: Báo cáo thí nghiệm gồm các phần: 1. Vật liệu và phương pháp 3. Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch, báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính toán mật độ vi sinh vật trong mỗi mẫu 20 5. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER) Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên 1.
Mở đầu Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là phương pháp định lượng vi sinh vật được sử dụng rất nhiều trong thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường. MPN xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu phẩm một cách gián tiếp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng trong các tổ hợp gồm 3-5 ống nghiệm ở các độ pha loãng hơn kém nhau 10 lần. Tổng hợp kết quả ống dương tính đối với sự phát triển của vi sinh vật là cơ sở để tính toán giá trị mật độ vi sinh vật trong mẫu. Trong bài này, sinh viên kiểm tra sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.
Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo, động vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v. Nước tự nhiên có thể bị ô nhiễm phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao. Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên, việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến hành. Coliform được xem là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường không có mặt trong môi trường nước tự nhiên, môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong môi trường nước tự nhiên hơn các loài vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và (4) việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản.
Coliform là nhóm các vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, không sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose sinh ra acid và giải phóng khí ở 35°C sau 48±2 h. Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hoàn thành. + Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48±2 h ở nhiệt độ 35°C. + Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm giả định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: môi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương (những loài cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).
21 + Thí nghiệm hoàn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường ở thí nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que, và không sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform). Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number). Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.
Vật liệu và phương pháp 2. Vật liệu - Mẫu nước - Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL - Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL - Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men lactose 2. Phương pháp Chuẩn bị môi trường Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau Bảng 5-1 Thành phần môi trường Thành phần Nồng độ kép Nồng độ đơn Peptone 10g 5g Lactose 10g 5g Cao thịt bò 6g 3g Nước 1000 mL 1000 mL pH được điều chỉnh đến 6.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau: Bảng 5-2. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm 22 Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Số lượng ống F1 Nồng độ kép 10 mL 3 F2 Nồng độ đơn 10 mL 3 F3 Nồng độ đơn 10 mL 3 Các ống chứa môi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút.
Lấy mẫu: Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo tiêu chuẩn Việt Nam hoặc quốc tế (WHO – World Health Organization) về lấy mẫu nước.