Luận văn thạc sĩ vnua sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi

Luận văn thạc sĩ phân tích vnua sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora sp gây, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Diệu Hương
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Hồng Hiển
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Danh mục chữ viết tắt
• 1.2. Danh mục bảng
• 1.3. Danh mục hình
• 1.4. Trích yếu luận văn
• 1.5. Mục đích nghiên cứu của đề tài
• 1.6. Yêu cầu của đề tài
• 1.7. Tổng quan tài liệu
• 1.7.1. Tổng quan tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi
• 1.7.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới
• 1.7.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam
• 1.7.2. Sâu bệnh hại trên cây có múi
• 1.7.2.1. Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi
• 1.7.2.2. Cơ chế gây bệnh
• 1.7.2.3. Biện pháp phòng trừ
• 1.7.3. Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật
• 1.7.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước
• 1.7.4.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở ngoài nước
• 1.7.4.2. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong nước
• 1.8. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.8.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.8.2. Môi trường nghiên cứu
• 1.8.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng
• 1.8.4. Phương pháp nghiên cứu
• 1.8.4.1. Giữ giống vi sinh vật
• 1.8.4.2. Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh
• 1.8.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm
• 1.8.4.4. Phương pháp tái lây nhiễm
• 1.8.4.5. Đánh giá đặc điểm sinh học
• 1.8.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh vật
• 1.8.4.7. Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật
• 1.8.4.8. Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn
• 1.9. Kết quả và thảo luận
• 1.9.1. Phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 1.9.1.1. Lây nhiễm nhân tạo
• 1.9.1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.9.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng HDB và DB5
• 1.9.1.4. Định danh chủng nấm DB5
• 1.9.2. Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 1.9.2.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng
• 1.9.2.2. Một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn 38
• 1.9.2.3. Định danh chủng xạ khuẩn 38
• 1.9.2.4. Một số đặc điểm sinh học và phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2
• 1.9.2.5. Định danh 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2
• 1.9.3. Kết quả phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây
• 1.9.4. Kết quả sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 1.10. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• MỞ ĐẦU
• 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
• 3. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
• 4. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 4.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI
• 4.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới
• 4.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam
• 4.2. Sâu bệnh hại trên cây có múi
• 4.2.1. Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi
• 4.2.2. Cơ chế gây bệnh
• 4.2.3. Biện pháp phòng trừ

Tóm tắt

I. Tổng quan về sàng lọc và định danh vi sinh vật kháng nấm Phytophthora

Sàng lọc và định danh vi sinh vật kháng nấm Phytophthora là một trong những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực nông nghiệp hiện đại. Nấm Phytophthora gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây có múi, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp.

1.1. Định nghĩa và vai trò của vi sinh vật kháng nấm

Vi sinh vật kháng nấm là những vi sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh. Chúng có thể sản sinh ra các hợp chất kháng sinh hoặc tạo ra môi trường không thuận lợi cho nấm phát triển. Việc sử dụng vi sinh vật kháng nấm trong nông nghiệp giúp tăng cường sức đề kháng cho cây trồng và bảo vệ môi trường.

1.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật kháng nấm Phytophthora

Nghiên cứu về vi sinh vật kháng nấm Phytophthora đã được thực hiện ở nhiều quốc gia. Các nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và định danh các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora, từ đó phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả cho cây có múi.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát bệnh do Phytophthora gây ra

Bệnh do nấm Phytophthora gây ra trên cây có múi đang trở thành một thách thức lớn cho nông dân. Các triệu chứng bệnh như thối rễ, thối quả và tàn lụi lá không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Việc kiểm soát bệnh này gặp nhiều khó khăn do nấm có khả năng tồn tại lâu dài trong đất và phát tán nhanh chóng.

2.1. Các triệu chứng bệnh do Phytophthora gây ra

Các triệu chứng bệnh do nấm Phytophthora gây ra trên cây có múi rất đa dạng. Chúng thường bắt đầu từ rễ, sau đó lan lên thân và lá, gây ra hiện tượng thối rễ, thối quả và tàn lụi lá. Những triệu chứng này không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng đến chất lượng trái cây.

2.2. Nguyên nhân gây ra sự lây lan của bệnh

Sự lây lan của bệnh do nấm Phytophthora chủ yếu xảy ra qua đất và nước. Nấm có khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi và phát tán qua các hoạt động canh tác, tưới tiêu. Điều này làm cho việc kiểm soát bệnh trở nên khó khăn hơn, đặc biệt trong các vùng có khí hậu ẩm ướt.

III. Phương pháp sàng lọc vi sinh vật kháng nấm Phytophthora hiệu quả

Để sàng lọc và định danh các chủng vi sinh vật kháng nấm Phytophthora, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập mẫu, nuôi cấy và thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi sinh vật. Việc áp dụng các công nghệ sinh học hiện đại cũng giúp nâng cao hiệu quả của quá trình sàng lọc.

3.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

Phân lập vi sinh vật từ các mẫu cây có múi bị bệnh là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu. Các mẫu được thu thập từ rễ, thân, lá và quả, sau đó được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để xác định các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm.

3.2. Thử nghiệm khả năng đối kháng của vi sinh vật

Sau khi phân lập, các chủng vi sinh vật sẽ được thử nghiệm khả năng đối kháng với nấm Phytophthora. Các phương pháp đồng nuôi cấy và kiểm tra hoạt tính kháng nấm sẽ được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các chủng vi sinh vật trong việc ức chế sự phát triển của nấm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm Phytophthora đã được phân lập thành công. Những chủng này không chỉ có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mà còn có thể được ứng dụng trong thực tiễn để bảo vệ cây có múi khỏi bệnh tật. Việc sử dụng vi sinh vật kháng nấm là một giải pháp bền vững cho nông nghiệp.

4.1. Các chủng vi sinh vật kháng nấm đã được phân lập

Trong quá trình nghiên cứu, đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm Phytophthora. Các chủng này được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học, từ đó có thể ứng dụng trong việc phát triển các chế phẩm sinh học.

4.2. Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp

Việc ứng dụng các chủng vi sinh vật kháng nấm vào sản xuất nông nghiệp không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại. Các chế phẩm sinh học từ vi sinh vật kháng nấm đang được nghiên cứu và phát triển để đưa vào sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu vi sinh vật kháng nấm

Nghiên cứu về vi sinh vật kháng nấm Phytophthora đang mở ra nhiều triển vọng mới cho ngành nông nghiệp. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ vi sinh vật không chỉ giúp bảo vệ cây có múi mà còn góp phần vào việc phát triển nông nghiệp bền vững. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp hiệu quả cho việc kiểm soát bệnh hại trên cây trồng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu vi sinh vật kháng nấm

Nghiên cứu vi sinh vật kháng nấm không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn góp phần vào việc bảo vệ môi trường. Việc sử dụng vi sinh vật thay thế cho hóa chất độc hại là một xu hướng tất yếu trong nông nghiệp hiện đại.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu và ứng dụng

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chủng vi sinh vật kháng nấm mới, đồng thời ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại để nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh hại trên cây có múi. Sự kết hợp giữa nghiên cứu cơ bản và ứng dụng thực tiễn sẽ mang lại những kết quả tích cực cho ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sản xuất cây ăn quả có múi đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp toàn cầu với tổng sản lượng hàng năm đạt dao động từ 123 đến 131 triệu tấn. Tại Việt Nam, ngành trồng cây có múi ghi nhận bước tăng trưởng ấn tượng khi diện tích canh tác tăng thêm 52.000 ha vào năm 2017, đưa sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn (tăng 20,4%) và bưởi đạt 571,3 nghìn tấn (tăng 13,4%). Đến năm 2018, tổng sản lượng cây có múi cả nước đã chạm mốc 1.697,9 nghìn tấn. Tuy nhiên, sự phát triển vùng trồng tập trung đang đối mặt với thiệt hại nghiêm trọng do các loài vi sinh vật gây bệnh, trong đó chi nấm Phytophthora là tác nhân nguy hiểm hàng đầu gây ra các bệnh thối rễ, xì mủ thân, cháy lá và thối quả nâu.

Việc lạm dụng các loại thuốc hóa học như Aliette hay Ridomil mang lại hiệu quả phòng trừ thấp do mầm bệnh lưu tồn sâu trong đất, đồng thời gây ô nhiễm môi trường đất và phát sinh các chủng nấm kháng thuốc. Xuất phát từ thực tiễn đó, luận văn tập trung vào mục tiêu sàng lọc, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật bản địa có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi. Nghiên cứu được triển khai thực hiện từ tháng 4 năm 2019 đến tháng 9 năm 2019 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, với nguồn mẫu thực vật và đất bệnh thu thập từ 4 vùng sinh thái gồm Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái. Kết quả của đề tài tạo tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh hại an toàn, giúp giảm thiểu khoảng 30% đến 50% chi phí sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong các trang trại canh tác bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trục lý thuyết trọng tâm là bệnh học thực vật chuyên sâu về vi sinh vật thuộc lớp Oomycetes và lý thuyết kiểm soát sinh học bằng vi sinh vật đối kháng:

• Lý thuyết sinh bệnh học của chi Phytophthora: Phytophthora thuộc giới Chromalveolata, ngành Heterokontophyta, lớp Oomycetes. Khác với nấm thực, vách tế bào của chúng cấu tạo chủ yếu từ glucan và cellulose thay vì chitin. Chu trình sống của mầm bệnh xen kẽ giữa pha vô tính với các túi bào tử phóng thích động bào tử có 2 lông roi bơi tự do trong môi trường nước và pha hữu tính tạo noãn bào tử vách dày tồn tại nhiều năm trong đất. Mô hình lây nhiễm mô tả sự xâm nhập của mầm bệnh qua các vết thương cơ giới ở rễ, cổ rễ và vỏ quả khi gặp độ ẩm bão hòa.
• Lý thuyết kiểm soát sinh học và đối kháng vi sinh vật: Cơ chế đối kháng trong môi trường đất diễn ra qua ba phương thức chính: sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh tự nhiên (chiếm trên 80% từ chi Streptomyces), tiết enzyme ngoại bào phân giải vách tế bào mầm bệnh (chitinase, cellulase, glucanase) và cạnh tranh dinh dưỡng hoặc không gian sống (tiết siderophore cạnh tranh nguồn sắt Fe3+).
• Các khái niệm cốt lõi: Bào tử động bơi tự do (Zoospores), Kháng sinh sinh học (Bio-antibiotics), Vòng vô khuẩn ức chế (Inhibition zone), Mã vạch phân tử định danh sinh vật (Molecular DNA barcoding).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng hệ thống dữ liệu thực nghiệm gồm 18 mẫu bệnh phẩm tự nhiên (12 mẫu đất, 2 mẫu rễ, 2 mẫu thân, 2 mẫu lá và 2 mẫu quả) thu thập từ các cây chanh, cam, bưởi có triệu chứng thối nhũn, xì mủ tại 4 tỉnh thành. Bên cạnh đó, nguồn vi sinh vật sàng lọc gồm 80 chủng xạ khuẩn và 30 chủng vi khuẩn sẵn có tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh.

Phương pháp lấy mẫu được thực hiện theo nguyên tắc phân tầng ngẫu nhiên dọc theo hình chiếu tán cây ở tầng đất sâu từ 10 đến 30 cm, kết hợp thu nhận các bộ phận thân rễ biểu hiện bệnh điển hình. Quy trình phân lập nấm Phytophthora kết hợp phương pháp bẫy sinh học bằng cánh hoa hồng nhạy cảm và cấy gạt trực tiếp trên môi trường chọn lọc PDA. Hoạt tính gây bệnh được kiểm chứng qua kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh với vết rạch cơ giới 3-4 mm so sánh với mẫu đối chứng vô trùng.

Khả năng đối kháng của 110 chủng vi sinh vật được đánh giá bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường thạch PGA, đo đường kính vòng ức chế sau 3 đến 7 ngày ở 30°C. Đặc tính sinh lý học được khảo sát qua ngưỡng chịu mặn từ 0% đến 7% NaCl, nhiệt độ sinh trưởng từ 20°C đến 45°C và khả năng sinh enzyme cellulase trên môi trường thạch CMC bằng thuốc thử Lugol. Phương pháp định danh phân tử sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA tổng số, khuếch đại gen ITS rRNA (cặp mồi ITS1/ITS4) cho nấm và gen 16S rRNA (cặp mồi 27F/1492R) cho vi khuẩn và xạ khuẩn qua chu trình nhiệt 30 chu kỳ PCR. Trình tự gen được phân tích qua công cụ Blast trên NCBI và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng thuật toán Maximum Parsimony với hệ số lặp lại 1000 lần Bootstrap trên phần mềm MEGA7.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ 18 mẫu bệnh phẩm thực địa đã thu được 5 chủng nấm ký hiệu là DB1, DB5, RB, HQC và HDB. Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh tươi cho thấy có 2 trong số 5 chủng (chiếm tỷ lệ 40%) gồm DB5 và HDB biểu hiện độc lực gây bệnh thối nâu hoàn toàn sau 7 ngày ủ bệnh. Quan sát hình thái vi thể dưới độ phóng đại 1000 lần ghi nhận hệ sợi nấm không có vách ngăn, chuỗi bào tử hình chùm, trong đó chủng HDB mang bào tử hình tròn còn chủng DB5 có bào tử hình quả chanh đặc trưng của chi Phytophthora. Cả hai chủng nấm bệnh đều phát triển rất yếu trên môi trường nghèo dinh dưỡng WA nhưng sinh trưởng nhanh trên môi trường giàu dưỡng chất PDA và V8-juice agar.

Từ 110 chủng vi sinh vật khảo sát, nghiên cứu đã tuyển chọn thành công 3 chủng có hoạt tính đối kháng vượt trội nhất đối với cả 2 chủng nấm kiểm chứng HDB và DB5:

1. Chủng xạ khuẩn số 38 tạo vòng ức chế sinh trưởng rõ nét sau 3 ngày đồng nuôi cấy, khuẩn lạc chuyển từ trắng sang xám sau 7 ngày, sợi nấm có cuống sinh bào tử xoắn sau 24 giờ và duỗi thẳng giải phóng bào tử sau 36 giờ. Chủng này có khả năng chịu mặn lên đến 7% NaCl và sinh trưởng tối ưu ở dải nhiệt độ 30°C đến 37°C.
2. Chủng vi khuẩn VK1 là trực khuẩn Gram âm, khuẩn lạc tròn nhỏ, mép trơn nhầy, có khả năng di động mạnh và ức chế nấm bệnh rõ rệt trên môi trường PGA.
3. Chủng vi khuẩn VK2 là trực khuẩn Gram dương, bề mặt khuẩn lạc khô, mép trơn, phát triển ổn định ở nhiệt độ 30°C đến 37°C.

Kết quả giải trình tự vùng gen ITS rRNA và cây phát sinh chủng loại trên phần mềm MEGA7 với độ tin cậy Bootstrap 1000 lần đã xác định chủng nấm bệnh DB5 là Phytophthora colocasiae DB5. Tương tự, trình tự gen 16S rRNA định danh chính xác 3 chủng đối kháng gồm: chủng xạ khuẩn Streptomyces mutabilis 38, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa VK1 và chủng vi khuẩn Bacillus velezensis VK2.

Thảo luận kết quả

Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu là cả hai chủng nấm bệnh Phytophthora colocasiae DB5 và HDB đều không thể tạo vòng phân giải trên đĩa thạch CMC chứa thuốc thử Lugol, chứng minh chúng không có khả năng tự sinh enzyme cellulase ngoại bào để phá vỡ thành tế bào thực vật. Điều này giải thích tại sao trong thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, nếu không tạo vết cắt cơ giới sâu 3-4 mm trên vỏ quả mà chỉ tưới dịch nấm bề mặt thì quả chanh hoàn toàn không bị nhiễm bệnh. Dữ liệu này có thể được trình bày trực quan thông qua bảng so sánh đường kính tổn thương mô vỏ và biểu đồ tương quan giữa tổn thương cơ giới với tỷ lệ phát bệnh.

So với các công bố quốc tế của Burgess (2008) và Ivana Plisi (2017) về sự phong phú của Phytophthora tại Đông Nam Á, kết quả phân lập khẳng định sự hiện diện phức tạp của loài Phytophthora colocasiae trên cây có múi tại miền Bắc Việt Nam. Về khả năng đối kháng, hoạt tính kháng nấm mạnh của Streptomyces mutabilis 38 và Bacillus velezensis VK2 tương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Thị Phong Lan (2015) và Charu Singh (2016). Khả năng chịu nồng độ muối 7% của chủng xạ khuẩn 38 là ưu thế vượt trội, mở ra tiềm năng ứng dụng chế phẩm sinh học tại các vùng đất canh tác bị nhiễm mặn hoặc suy thoái dinh dưỡng. Các mối quan hệ di truyền được thể hiện rõ ràng qua cây phát sinh chủng loại MEGA7 với nhánh phân loại có độ tương đồng trình tự nucleotide trên 99% so với ngân hàng gen thế giới.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp cụ thể nhằm đưa các chủng vi sinh vật đối kháng vào thực tiễn sản xuất:

• Tối ưu hóa công nghệ lên men và tạo chế phẩm sinh học: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chìm bán liên tục đối với hai chủng Bacillus velezensis VK2 và Streptomyces mutabilis 38 trên nguồn cơ chất giá rẻ như rỉ mật đường và cám gạo. Mục tiêu đạt mật độ tế bào hữu hiệu từ 10 mũ 9 CFU trên mỗi mililit trong thời gian lên men 48 đến 72 giờ, hoàn thành trong vòng 6 đến 12 tháng do các trung tâm công nghệ sinh học chủ trì.
• Triển khai khảo nghiệm thực địa diện rộng: Thực hiện thử nghiệm bón gốc và phun tán chế phẩm phối trộn VK2 và chủng 38 trên các vườn cam, bưởi tại 4 vùng trọng điểm (Thái Bình, Phú Thọ, Yên Bái, Hà Nội). Đặt mục tiêu giảm thiểu từ 60% đến 75% tỷ lệ bệnh thối rễ, xì mủ thân trong niên vụ 2020-2021, do Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn phối hợp với các hợp tác xã triển khai.
• Xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp: Khuyến cáo nhà vườn không để vườn ngập úng quá 24 giờ trong mùa mưa, bón lót phân chuồng ủ hoai mục kết hợp vi sinh vật đối kháng, đồng thời kiểm soát nghiêm ngặt các loại sâu đục cành, sâu vẽ bùa để hạn chế tối đa các vết thương cơ giới trên thân, lá và quả.
• Thương mại hóa và đăng ký sở hữu trí tuệ: Tiến hành các thủ tục đăng ký bản quyền chủng giống vi sinh vật và đăng ký lưu hành sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học an toàn theo tiêu chuẩn ngành trong khung thời gian 18 đến 24 tháng, do các doanh nghiệp sản xuất vật tư nông nghiệp công nghệ cao đảm nhiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng cụ thể:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật: Tài liệu cung cấp quy trình bài bản từ khâu phân lập bằng phương pháp bẫy hoa hồng, khảo sát đặc tính sinh hóa đến kỹ thuật sinh học phân tử định danh đa gen bằng Mega7, phục vụ trực tiếp cho các đề tài nghiên cứu vi sinh vật nông nghiệp.
• Kỹ sư nông nghiệp và cán bộ trạm khuyến nông địa phương: Giúp nâng cao năng lực chẩn đoán nhanh triệu chứng nấm Phytophthora trên đồng ruộng và chuyển giao kỹ thuật ủ phân hữu cơ vi sinh chứa xạ khuẩn, trực khuẩn đối kháng cho nông dân.
• Doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh và chế phẩm sinh học: Tiếp cận nguồn vật liệu sinh học giá trị gồm các chủng Bacillus velezensis VK2 và Streptomyces mutabilis 38 có sức sống tốt, khả năng chịu muối 7% để phát triển dòng sản phẩm thương mại mới.
• Chủ trang trại và nhà vườn chuyên canh cây ăn quả có múi: Cung cấp hiểu biết chuyên sâu về nguyên nhân bệnh không thể tự xâm nhiễm qua vỏ quả lành, từ đó cải thiện kỹ thuật đốn tỉa cành, thu hái nhẹ tay và vệ sinh đồng ruộng sau các đợt mưa kéo dài.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao phương pháp bẫy bằng cánh hoa hồng lại được ưu tiên khi phân lập nấm Phytophthora từ đất?
Phương pháp bẫy sinh học tận dụng tính hướng động cao của động bào tử Phytophthora đối với mô cánh hoa hồng tươi trong môi trường nước. Cánh hoa chuyển sang màu nâu cánh gián sau 3 ngày nuôi cấy giúp tách lọc mầm bệnh mục tiêu khỏi hàng trăm loài nấm hoại sinh và vi khuẩn đất khác mà không cần hóa chất phức tạp.

Tại sao chủng nấm Phytophthora colocasiae DB5 chỉ gây bệnh khi có vết thương cơ giới?
Thực nghiệm xác định chủng DB5 hoàn toàn không có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ngoại bào để phân giải lớp màng cellulose bảo vệ bên ngoài quả. Do đó, nấm chỉ có thể xâm nhập, nảy mầm và gây thối nhũn khi vỏ quả xuất hiện vết rách cơ giới có kích thước từ 3-4 mm do sâu hại hoặc va quẹt.

Chủng xạ khuẩn Streptomyces mutabilis 38 có những ưu điểm sinh học nổi bật nào?
Chủng xạ khuẩn 38 có phổ đối kháng nấm bệnh rất mạnh sau 3 ngày nuôi cấy, đồng thời thích nghi dải nhiệt độ rộng từ 30°C đến 37°C. Đặc biệt, chủng chịu được nồng độ muối cao lên đến 7% NaCl, đảm bảo duy trì mật độ và hoạt tính ức chế nấm khi ứng dụng ngoài đồng ruộng thực tế.

Vi khuẩn Bacillus velezensis VK2 kháng nấm thông qua những cơ chế chủ yếu nào?
Bacillus velezensis VK2 là trực khuẩn Gram dương có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh dạng lipopeptide, tiết enzyme phân giải màng tế bào nấm và cạnh tranh mạnh mẽ vị trí bám dinh dưỡng ở vùng rễ cây trồng, từ đó ngăn chặn sự xâm nhiễm của sợi nấm Phytophthora.

Có thể phối hợp đồng thời chủng xạ khuẩn 38 và vi khuẩn VK2 trong cùng một chế phẩm không?
Việc phối trộn hoàn toàn khả thi và tạo ra tác động cộng hưởng nếu hai chủng không đối kháng lẫn nhau trong môi trường nuôi cấy chung. Sự kết hợp giữa trực khuẩn phát triển nhanh và xạ khuẩn sinh kháng sinh bền vững giúp mở rộng phổ kiểm soát nấm bệnh trong suốt chu kỳ sinh trưởng của cây.

Kết luận

• Phân lập thành công 5 chủng nấm thực địa và xác định Phytophthora colocasiae DB5 là tác nhân chính gây thối nâu quả trên cây có múi.
• Chứng minh chủng nấm bệnh không sinh enzyme cellulase ngoại bào, khẳng định tầm quan trọng của việc kiểm soát vết thương cơ giới trên cây trồng.
• Tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật đối kháng vượt trội gồm xạ khuẩn Streptomyces mutabilis 38, vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa VK1 và Bacillus velezensis VK2.
• Làm rõ đặc tính sinh học ưu việt của chủng xạ khuẩn 38 với khả năng chịu mặn tới 7% NaCl và sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30°C đến 37°C.
• Ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen 16S/ITS rRNA và thuật toán Maximum Parsimony trên MEGA7 để định danh chính xác các chủng vi sinh vật phục vụ nghiên cứu.

Trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tiếp theo, các nhà khoa học và đơn vị chuyển giao công nghệ cần đẩy mạnh hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột hòa nước từ chủng Bacillus velezensis VK2 và Streptomyces mutabilis 38. Các tổ chức nông nghiệp và doanh nghiệp vật tư bảo vệ thực vật hãy tích cực hợp tác, ứng dụng nguồn giống vi sinh vật đối kháng bản địa này vào quy trình canh tác hữu cơ nhằm nâng cao chất lượng nông sản xuất khẩu và xây dựng nền nông nghiệp Việt Nam bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Gần đây, diễn biến dịch bệnh trên cây có múi vẫn rất phức tạp mà nguyên nhân không phải là do bệnh mới. Trong những năm gần đây từ năm 2015, thế giới sản xuất 1.938 triệu tấn nước cam (chuyển đổi sang FCOJ), tỉ lệ này ngày càng giảm chủ yếu do dịch bệnh. Theo nghiên cứu dịch bệnh chủ yếu do nấm Phytophthora sp. gây ra là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất làm giảm sút sản lượng của cây có múi.

Bệnh thường xuất hiện và tấn công ở các vườn trồng trên nền đất thấp, kém thoát nước. Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở xung quanh gốc hay ở chản hai, chản ba của cây, sau đó vỏ cây bị thối có màu nâu hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ nhựa ra màu nâu đen và có mùi hôi. Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế bệnh dịch trên cây có múi nhưng chỉ dừng lại ở phòng bệnh là chính. Tuy nhiên, trong những trường hợp bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc phun để tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế bệnh lây lan như: Aliette, Ridomil, Phosacide.

Do tác nhân gây bệnh tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân sát mặt đất nên hiệu quả của các loại thuốc này còn thấp. Bên cạnh đó việc sử dụng thuốc hóa học để phòng hay trừ bệnh không những không đạt kết quả như mong đợi, chúng còn gây ra ảnh hưởng không tốt với sức khỏe con người, môi trường và các sinh vật sống khác. Do những tác động bất lợi kể trên của thuốc hóa học, việc sử dụng vi sinh vật thay thế các loại thuốc hóa học được coi là sự thay thế bền vững để kiểm soát sâu bệnh và mầm bệnh thực vật (Chandler et al. Kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các vi sinh vật đã và đang trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành công nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc mới, các hoạt chất kháng khuẩn mới, an toàn và thân thiện hơn.

Hơn nữa, tình hình biến động của chủng nấm cũng như bệnh dịch ngày một gia tăng. Đặc biệt ở nước vùng nhiệt đới như ở Việt Nam thì bệnh dịch ngày một lan rộng. Trước tình hình gây bệnh trên họ cam chanh của nấm Phytophthora sp chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi”.

1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập một số chủng nấm Phytophthora sp.

có khả năng gây bệnh cây trên cây có múi. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng nấm đã phân lập được. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với chủng nấm phân lập được. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh.

Định danh một số chủng nấm bệnh và một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh trên cây có múi. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI 2.

Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới Sản xuất quả có múi trên thế giới vẫn tăng do giá trị kinh tế, giá trị dinh dưỡng cao và do tăng trưởng thu nhập của các nền kinh tế mới nổi. Tổng sản lượng quả có múi hàng năm trên thế giới dao động vào khoảng 123 - 131 triệu tấn trong giai đoạn 5 năm từ 2011 đến 2016 (FAO, 2017), trong đó cam chiếm trên 50% tổng sản lượng. Sản xuất quả có múi vẫn đang tiếp tục tăng do thu nhập của người dân ở một số quốc gia tăng nhanh như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga, Ấn Độ, các nước Đông Âu, các nước ASEAN. Theo FAO, sản lượng quả có múi toàn cầu vào khoảng 131 triệu tấn năm 2015 và 124 triệu tấn năm 2016, bình quân đầu người khoảng 18kg năm 2016.

Tiêu thụ bình quân ở các nước phát triển Tây Âu và Bắc Mỹ đạt trên 40 kg/người (Tổng cục Thống kê: Tình hình kinh tế - xã hội năm 2017; FAO, 2017). Trong đó có Mexico là một cường quốc sản xuất và xuất khẩu quả có múi; nằm ở vĩ độ Bắc 10o - 24o, có vị trí địa lý, khí hậu thích hợp với việc trồng cây có múi. Sản lượng quả có múi của Mexico năm 2016 là 6,634 triệu tấn; với dân số xấp xỉ 130 triệu người. Bình quân sản lượng quả có múi vào khoảng 51,0 kg/người.

Diện tích trồng cam cả nước không thay đổi trong 10 năm (2000 - 2010), tổng diện tích là 342.000ha, sản xuất mỗi năm khoảng 4,1 triệu tấn cam; chỉ sau Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ và Mỹ. Niên vụ 2016/2017, Mexico sản xuất khoảng 4,3 triệu tấn cam, năng suất trung bình toàn quốc khoảng 14,3 tấn/ha. Bên cạnh cây cam, Mexico còn đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu chanh. Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ, niên vụ 2016/2017, sản xuất chanh toàn cầu đạt 7,3 triệu tấn, riêng Mexico đã chiếm 2,4 triệu tấn.

Ở Trung Quốc, diện tích và sản lượng quả có múi liên tục tăng trong suốt 40 năm qua. Năm 2008, tổng sản lượng quả có múi ở Trung Quốc lục địa là khoảng 21,7 triệu tấn, 5 năm sau (2013) sản lượng tăng lên 34,3 triệu tấn; năm 2016 đạt khoảng 32,7 triệu tấn (trong đó chủ yếu là quýt). Bình quân khoảng 23,7 kg/người với dân số 2016 vào khoảng 1,379 tỷ người (FAO, 2017). 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam Tình hình trồng các loại cây ăn quả đặc biệt là cây có múi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta nằm ở trung tâm phát sinh cây ăn quả có múi, có vị trí địa lý thuận lợi, ở vùng thích hợp cho phát sinh và phát triển của nhiều loài quả có múi. Từ Quảng Nam trở vào là diện tích vùng nóng đối với cây có múi. Bưởi, cam sành và chanh thường phát triển tốt hơn ở vùng này do chịu được nhiệt.

Khi nhiệt độ cao quanh năm, cây có múi có thể ra hoa vài lần trong năm. Cây thuộc họ cam chanh là những cây mang giá trị thương mại cao. Theo Bộ NN-PTNT, diện tích cây ăn quả nước ta tăng mạnh đặc biệt là ở các tỉnh phía bắc. Năm 2017 đã tăng 52000ha so với năm 2016, trong đó diện tích cam tăng 10000ha, diện tích bưởi tăng 13000ha.

Trong đó, phần lớn cam chiếm diện tích trồng và sản lượng thu hoạch lớn. Theo Tổng cục thống kê, năm 2017 sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%. Năm 2018, nhóm cây ăn quả nói chung và cây ăn quả có múi nói riêng đạt sản lượng thu hoạch khá do nhiều cây trồng tăng về diện tích và có thị trường tiêu thụ ổn định, tiếp tục tăng mạnh. Sản lượng cam, quýt, bưởi đạt 1697,9 nghìn tấn tăng 10,9% so với năm trước.

Tuy nhiên, cùng với sự thâm canh hóa và gia tăng về diện tích trồng họ cam chanh thì dịch bệnh đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và sự phát triển bền vững của nghề trồng. Sâu bệnh hại trên cây có múi Sâu đục cành Đặc tính sâu bệnh hại: Đây là bệnh phổ biến nhất trên nhóm cây có múi. Sâu đục cành có màu vàng dài khoảng 50mm. Chúng một khi xâm nhập được vào cây sẽ khoét lỗ và làm tổ trong cành khiến cành bị úa vàng, sinh trưởng kém rồi dần dần héo và chết.

Sâu trưởng thành đẻ trứng rải rác khắp nách lá và trên vỏ thân cây. Cứ thế khiến cây bị suy kiệt khô héo mà chết. Cách phòng và trị: tăng cường biện pháp đốn tỉa cây giúp cây được thông thoáng hơn. Để hạn chế việc xâm nhập của sâu, cần quét vôi lên trên thân cây.

Loại bỏ những cành bị sâu bệnh tấn công để chúng không lan rộng ra cả cây. Ngoài ra nếu có quá nhiều thì có thể phun xịt một số loại thuốc kháng sâu bệnh. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sâu vẽ bùa Đặc tính sâu bệnh: Loại sâu này đẻ trứng trên thân cây và khi sâu non nở chúng sẽ tấn công lá ăn hết lớp biểu bì trên bề mặt lá và khiến lá quang hợp kém. Cây từ đó mà phát triển kém hơn đồng thời làm cho cây còi cọc chậm lớn.

Loại sâu vẽ bùa này được hình thành nhiều nhất sau các đợt mưa dài ngày. Cách phòng và trị: Cần theo dõi chặt chẽ những đợt ra lộc của cây. Vì thời điểm này sâu vẽ bùa phát triển khá mạnh sau đợt mưa hoặc khi tưới nước. Cần sử dụng một số loại thuốc phun đều lên cây như Sumicidin 50EC 0,2%, Polytrin 50EC 0,2%.

Chia làm 2 lần phun mỗi lần cách nhau khoảng 10 ngày. Nếu thấy thuyên giảm thì ngừng phun. Theo cẩm nang bệnh cây Texas các nhà khoa học cũng đã lập danh sách các bệnh trên cây có múi. Bệnh thối đen Nguyên nhân: Bệnh do nấm Alternaria citri xảy ra trên trái cam.

Triệu chứng: Ban đầu xuất hiện những đốm nhỏ màu nâu, sau đó vết bệnh phát triển rất nhanh và chuyển dần sang màu đen. Quả bị nhiễm bệnh sẽ đổi màu và có thể rụng sớm. Bệnh vàng lá gân xanh Nguyên nhân: Do vi khuẩn Triệu chứng: Bệnh xảy ra trên cây còn nhỏ gây ra triệu chứng đốm vàng, loang lổ trên lá làm phiến là chuyển màu vàng chỉ còn gân lá màu xanh. Khi bệnh nặng cây không phát triển, tán lá không đều, các lá mọc thẳng đứng, cứng.

Còn cây lớn bị mắc bệnh vàng lá trái nhỏ, méo mó, khi bổ dọc trái thấy tâm trái bị lệch hẳn sang một bên và hạt bị hỏng có màu nâu. Bệnh do nấm Phytophthora Nguyên nhân: bệnh do nấm Phytophthora citrophthora, P. parasitica và các loại Phytophthora sp khác. Triệu chứng: Thối nâu: Trái cây mọc gần mặt đất bị nhiễm bệnh đầu tiên và sau đó sẽ lây đến những quả mọc cao hơn trên cây.

Xuất hiện các vết đốm nâu nhỏ trên 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] quả, sau đó lan rộng thành một vùng. Quả bị nhiễm bệnh có mùi hăng, ôi. Nếu nhiễm qua rễ cây, xâm nhập vào qua vỏ rễ, lan mạnh khắp cây.