Khóa luận tốt nghiệp: Quy trình nhân giống dâu tây in vitro tại HUTECH

Khóa luận tốt nghiệp HUTECH trình bày quy trình nhân giống dâu tây in vitro, khám phá kỹ thuật và ứng dụng trong nông nghiệp hiện đại.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Dương Tấn Nhựt
• Trường học: HUTECH
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Quy Trình Nhân Giống Dâu Tây In Vitro Tại HUTECH
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
• 1.1.1. Giới thiệu
• 1.1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
• 1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
• 1.1.4. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro
• 1.1.5. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh
• 1.1.5.1. Nuôi cấy nốt đơn thân
• 1.1.5.2. Nuôi cấy chồi bên
• 1.1.5.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
• 1.1.6. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
• 1.1.7. Một số hệ thống nuôi cấy mới
• 1.1.7.1. Nuôi cấy lỏng sục khí - Bioreactor
• 1.1.7.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng
• 1.1.8. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.1.9.1. Yếu tố vô trùng

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình nhân giống dâu tây in vitro tại HUTECH

Quy trình nhân giống dâu tây in vitro tại HUTECH là một trong những phương pháp tiên tiến nhằm cải thiện chất lượng giống và tăng năng suất cây trồng. Kỹ thuật này không chỉ giúp tạo ra giống dâu tây sạch bệnh mà còn đảm bảo nguồn cung giống ổn định cho nông dân. Việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển cây dâu tây tại Đà Lạt.

1.1. Khái niệm về nhân giống dâu tây in vitro

Nhân giống dâu tây in vitro là phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật này cho phép tạo ra nhiều cây con từ một mẫu mô nhỏ, giúp tăng cường khả năng nhân giống và đảm bảo chất lượng giống.

1.2. Lịch sử phát triển kỹ thuật nhân giống dâu tây

Kỹ thuật nhân giống dâu tây in vitro đã được nghiên cứu và phát triển từ những năm 1960. Các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để cải thiện quy trình này, từ việc chọn lựa môi trường nuôi cấy đến việc tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng.

II. Thách thức trong quy trình nhân giống dâu tây tại HUTECH

Mặc dù quy trình nhân giống dâu tây in vitro mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức cần giải quyết. Việc đảm bảo điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất. Nếu không được kiểm soát tốt, vi sinh vật có thể làm hỏng mẫu cấy và ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót của cây con.

2.1. Vấn đề về nguồn giống dâu tây

Nguồn giống dâu tây hiện tại không ổn định và thường xuyên bị thoái hóa. Điều này dẫn đến việc cần thiết phải phát triển các phương pháp nhân giống mới để đảm bảo chất lượng giống.

2.2. Khó khăn trong việc duy trì điều kiện vô trùng

Điều kiện vô trùng là yếu tố quyết định trong quy trình nhân giống in vitro. Việc duy trì môi trường sạch sẽ và không bị nhiễm khuẩn là một thách thức lớn đối với các nhà nghiên cứu.

III. Phương pháp nhân giống dâu tây in vitro hiệu quả tại HUTECH

HUTECH đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau trong quy trình nhân giống dâu tây in vitro. Các phương pháp này không chỉ giúp tăng tỷ lệ sống sót của cây mà còn cải thiện chất lượng giống. Việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phát triển của cây con.

3.1. Sử dụng môi trường nuôi cấy tối ưu

Môi trường nuôi cấy được tối ưu hóa với các thành phần dinh dưỡng cần thiết giúp cây dâu tây phát triển tốt hơn. Việc lựa chọn đúng loại môi trường là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho phép tạo ra nhiều cây con từ một mẫu mô nhỏ. Phương pháp này giúp tăng cường khả năng nhân giống và đảm bảo chất lượng giống dâu tây.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình nhân giống dâu tây in vitro

Quy trình nhân giống dâu tây in vitro tại HUTECH đã mang lại nhiều kết quả khả quan. Các mô hình nhân giống đã được triển khai thành công, giúp cung cấp giống dâu tây sạch bệnh cho nông dân. Điều này không chỉ cải thiện năng suất mà còn nâng cao chất lượng sản phẩm.

4.1. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ sống sót của cây dâu tây in vitro cao hơn so với phương pháp nhân giống truyền thống. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của kỹ thuật này trong sản xuất giống.

4.2. Tác động đến ngành nông nghiệp địa phương

Việc áp dụng quy trình nhân giống dâu tây in vitro đã giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm, từ đó tạo ra nguồn thu nhập ổn định cho nông dân tại Đà Lạt.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của quy trình nhân giống dâu tây

Quy trình nhân giống dâu tây in vitro tại HUTECH không chỉ giải quyết vấn đề về giống mà còn mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp. Với sự phát triển không ngừng của công nghệ, tương lai của quy trình này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị hơn nữa cho nông dân và ngành nông nghiệp Việt Nam.

5.1. Tương lai của quy trình nhân giống dâu tây

Với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy mô, quy trình nhân giống dâu tây in vitro sẽ ngày càng hoàn thiện và hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng giống.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải thiện quy trình nhân giống và phát triển các giống dâu tây mới, đáp ứng nhu cầu thị trường và nâng cao giá trị kinh tế cho nông dân.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây dâu tây (Fragaria sp., thuộc chi Fragaria, họ Hoa hồng - Rosaceae) là loại cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao và là nông sản đặc trưng tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, diện tích canh tác dâu tây tại địa phương có xu hướng suy giảm rõ rệt. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ tình trạng thoái hóa giống cây trồng và sự thiếu hụt nguồn cây giống sạch bệnh, ổn định để phục vụ sản xuất. Phương pháp nhân giống truyền thống bằng cách cắt cành/ngó từ cây mẹ bộc lộ nhiều hạn chế: hệ số nhân giống thấp, bộ rễ cây con yếu, cây dễ bị thoái hóa và truyền mầm bệnh (đặc biệt là virus) qua các thế hệ. Trước thực trạng đó, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) nhằm nhân giống nhanh và cung cấp nguồn giống dâu tây sạch bệnh trên quy mô lớn là yêu cầu cấp thiết.

Tại Lâm Đồng, nghiên cứu nhân giống dâu tây in vitro đã được triển khai qua nhiều chương trình khoa học tiêu biểu:

• Dự án "Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây trong tỉnh Lâm Đồng" do Phân viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì (TS. Dương Tấn Nhựt làm chủ nhiệm dự án).
• Dự án "Giữ quỹ gene giống dâu sạch bệnh tại Đà Lạt" (giai đoạn 2007–2008) tại Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam (dưới sự chỉ đạo của TS. Phạm Xuân Tùng), tập trung bảo tồn và nhân giống các dòng dâu tây như Mỹ đá, Langbiang, New Zealand.
• Các dự án "Xác lập quy trình nhân giống dâu tây mới ở Đà Lạt" và "Nâng cao tỷ lệ sống cây dâu tây giai đoạn sau ống nghiệm" tại Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng Kỹ thuật Nông nghiệp Lâm Đồng (dưới sự chỉ đạo của Giám đốc Trần Thị Kim Duyên).

Khóa luận của tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng tập trung vào các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Mục đích nghiên cứu: Tìm hiểu quy trình nhân giống cây dâu tây in vitro và khảo sát các điều kiện sinh trưởng tối ưu của cây dâu tây trong quy trình nhân giống tại phòng thí nghiệm.
2. Nội dung nghiên cứu: Khảo sát toàn diện các bước nhân giống in vitro từ khâu tiếp nhận, xử lý khử trùng mẫu ban đầu, nhân nhanh cụm chồi, tạo rễ thành cây hoàn chỉnh cho đến giai đoạn đưa cây con ra vườn ươm xuất giống.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng: Cây dâu tây nhân giống in vitro (sử dụng mẫu cấy là chồi tia khỏe mạnh).
   • Không gian và địa điểm thực hiện: Tổ nuôi cấy, Phòng Sản xuất – Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khóa luận được xây dựng dựa trên các cơ sở lý thuyết kinh điển và hiện đại về nuôi cấy mô tế bào thực vật:

• Cơ sở sinh lý phát sinh hình thái in vitro: Kỹ thuật nuôi cấy mô dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật, cho phép tái sinh chồi, rễ hoặc phôi vô tính từ các bộ phận tách rời (lá, thân, chồi đỉnh, chồi nách, đỉnh sinh trưởng) trong môi trường vô trùng giàu dinh dưỡng. Tỷ lệ phối hợp giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin đóng vai trò quyết định: tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao kích thích quá trình tạo rễ, trong khi tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp thúc đẩy quá trình tạo chồi và phá vỡ ưu thế ngọn.
• Môi trường dinh dưỡng: Ứng dụng nền môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) ở nồng độ giảm một nửa (1/2 MS), bổ sung nguồn carbon (đường sucrose 25 g/l), vitamin, chất làm đông (agar), chất hấp phụ độc tố (than hoạt tính) cùng các chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp thuộc nhóm Cytokinin (6-Benzylaminopurine - BA) và nhóm Auxin (Naphthalene acetic acid - NAA).
• Nguyên lý vô trùng: Quy trình kiểm soát tạp nhiễm đối với dụng cụ thủy tinh (sấy nhiệt khô), môi trường dinh dưỡng (hấp áp suất hơi bão hòa Autoclave ở 121°C), không gian thao tác phòng cấy (xử lý hơi formalin 40%, dung dịch amoniac 25%, cồn 70%, đèn tử ngoại UV) và khử trùng bề mặt mô thực vật sống bằng Calcium hypochlorite theo các nguyên tắc được chuẩn hóa (dẫn liệu của Street, 1974).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả triển khai qua các thí nghiệm sinh học bố trí ngẫu nhiên:

• Phương pháp khử trùng mẫu: Thí nghiệm 2 yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9 nghiệm thức, kết hợp 3 mức nồng độ Calcium hypochlorite (7%, 12%, 20%) và 3 mốc thời gian xử lý (10 phút, 15 phút, 30 phút).
• Phương pháp nhân nhanh chồi: Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, khảo sát ảnh hưởng của 3 mức nồng độ BA (0 mg/l, 0,25 mg/l, 0,5 mg/l) trên nền môi trường 1/2 MS.
• Phương pháp tạo rễ in vitro: Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, khảo sát ảnh hưởng của 3 mức nồng độ NAA (0,15 mg/l, 0,25 mg/l, 0,5 mg/l) bổ sung than hoạt tính trên nền môi trường 1/2 MS.
• Phương pháp theo dõi thích nghi ngoài vườn ươm: Khảo sát thời gian tập nắng (2–3 ngày), kỹ thuật làm sạch môi trường bám rễ, cấy chuyển vào vỉ xốp chứa giá thể phối trộn (1 phần xơ dừa : 2 phần đất mùn) và theo dõi tỷ lệ sống sót trong điều kiện nhà ươm.
• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu sơ cấp được thu thập trực tiếp từ việc ghi nhận số lượng mẫu sống, số chồi tái sinh, chiều cao chồi (cm), chiều dài rễ (mm) và tỷ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm (%) tại phòng thí nghiệm và nhà kính của Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày hệ thống hóa cơ sở khoa học và tổng quan các công trình nghiên cứu liên quan đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và cây dâu tây:

• Lịch sử phát triển vi nhân giống: Khái quát các mốc phát triển chính từ Haberlandt (1902 - khởi xướng ý tưởng nuôi cấy ngoài cơ thể), White (1934 - nuôi cấy tế bào cà chua), Ball (1964 - tái sinh rễ từ ngọn sen cạn), Skoog & Miller (1951 - cơ chế điều khiển nhân chồi bằng phytohormone), Murashige & Skoog (1962 - chuẩn hóa môi trường khoáng MS), Morel (1960–1964 - nhân giống vô tính hoa lan thương mại hóa đầu tiên).
• Ý nghĩa và ưu điểm của nuôi cấy mô: Phân tích ý nghĩa trong nghiên cứu lý thuyết sinh học (nghiên cứu phân hóa tế bào, mối quan hệ ký sinh - ký chủ, cơ chế miễn dịch thực vật) và giá trị thực tiễn (hệ số nhân giống cao, sản xuất cây giống sạch bệnh virus đồng nhất di truyền quanh năm, thu nhận sinh khối chứa các hoạt chất thứ cấp như alkaloid, glycosid).
• Trang thiết bị và hệ thống phòng nuôi cấy: Mô tả cấu trúc các phòng chức năng chuyên biệt gồm phòng rửa và cất nước, phòng hấp sấy (nồi hấp autoclave, tủ sấy 60–200°C), phòng chuẩn bị môi trường (cân phân tích, cân kỹ thuật, lò vi sóng), phòng thao tác cấy (box cấy vô trùng, đèn UV), phòng nuôi cấy và phân tích (kính hiển vi phóng đại 1000 lần, kính lúp 75 lần, hệ thống giàn đèn chiếu sáng), phòng chứa mẫu.
• Các kỹ thuật nuôi cấy cơ bản và hệ thống mới: Tổng quan kỹ thuật nuôi cấy nốt đơn thân, chồi bên (ứng dụng trên dâu tây, hoa cẩm chướng, cúc đồng tiền), nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (loại trừ virus), nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (tạo dòng đơn bội kép DH). Giới thiệu hai hệ thống nuôi cấy tiên tiến: hệ thống Bioreactor (nuôi cấy lỏng sục khí điều khiển dòng khí) và hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation do Kozai phát triển vào thập niên 1990, sử dụng bình nuôi cấy như nhà kính thu nhỏ, loại bỏ đường trong môi trường, tận dụng CO2 và ánh sáng để kích thích quang hợp tự nhiên).
• Yếu tố kỹ thuật vô trùng và thành phần môi trường:
  • Chế độ vô trùng: Dụng cụ thủy tinh sấy ở 160°C (45 phút) đến 190°C (7,5 phút); môi trường hấp ở 121°C, áp suất 1–1,5 atm từ 15 đến 30 phút theo thể tích. Phòng cấy khử trùng định kỳ bằng hơi formol 40% (24 giờ), trung hòa bằng dung dịch amoniac 25% (24 giờ) và chiếu đèn UV.
  • Tham số hóa chất khử trùng (dẫn theo Street, 1974): Calci hypochlorit (9–10%, 5–30 phút), Natri hypochlorit (2%, 5–30 phút), Hydro peroxid (10–12%, 5–15 phút), Nước Brom (1–2%, 2–10 phút), HgCl2 (0,1–1%, 2–10 phút), Kháng sinh (4–50 mg/l, 30–60 phút).
  • Môi trường nuôi cấy: Phân tích vai trò của khoáng đa lượng (N, P, K, Ca, Mg, Fe), khoáng vi lượng (Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo), nguồn carbon (sucrose, glucose), vitamin (thiamin B1, acid nicotinic, pyridoxine B6, myo-inositol), các phytohormone (Auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D; Cytokinin: kinetin, zeatin, BA) và than hoạt tính.
• Đặc điểm thực vật học cây dâu tây: Phân loại học thuộc giới Plantae, ngành Angiospermae, lớp Rosids, bộ Rosales, họ Rosaceae, chi Fragaria. Về mặt hình thái học, quả dâu tây là dạng quả giả phát triển từ mô đế hoa biến đổi (hypanthium), còn quả thực sự là các quả bế (hạt nhỏ đính trên bề mặt). Quy trình nhân giống in vitro cây dâu tây gồm 5 bước tiêu chuẩn: (1) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy; (2) Tạo thể nhân giống; (3) Nhân nhanh cụm chồi; (4) Tái sinh cây hoàn chỉnh có rễ; (5) Chuyển cây con ra vườn ươm thích nghi.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương này trình bày chi tiết về nguồn vật liệu thực nghiệm, thiết bị phòng thí nghiệm và quy trình bố trí 4 nội dung thí nghiệm:

• Thời gian, địa điểm và đối tượng: Thực hiện tại Tổ nuôi cấy, Phòng Sản xuất – Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt. Đối tượng nghiên cứu là nguồn mẫu chồi tia khỏe mạnh của cây dâu tây.
• Điều kiện môi trường phòng nuôi cây:
  • Cường độ chiếu sáng: 2000 lux.
  • Nhiệt độ phòng nuôi: 23 – 27°C.
  • Độ ẩm không khí: 60 – 80%.
  • Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
• Quy trình bố trí các thí nghiệm:
  • Thí nghiệm 1 (Xử lý vô trùng mẫu nhập): Mẫu chồi tia được rửa dưới vòi nước chảy 1 phút, ngâm rửa xà phòng 2–3 phút, sát trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1–2 phút, sau đó xử lý bằng dung dịch Calcium hypochlorite theo ma trận 9 nghiệm thức:

Nồng độ Calcium hypochlorite	Thời gian 10 phút	Thời gian 15 phút	Thời gian 30 phút
7%	Nghiệm thức 1.1	Nghiệm thức 1.2	Nghiệm thức 1.3
12%	Nghiệm thức 2.1	Nghiệm thức 2.2	Nghiệm thức 2.3
20%	Nghiệm thức 3.1	Nghiệm thức 3.2	Nghiệm thức 3.3

Mẫu sau khử trùng được tráng nước cất vô trùng 3–4 lần, bóc tách đỉnh sinh trưởng và cấy vào môi trường nền 1/2 MS bổ sung 0,4 mg/l BA và 25 g/l đường.

• Thí nghiệm 2 (Nhân nhanh chồi với BA): Sau 30 ngày nhập mẫu, các cụm chồi được phân chia (cấy 2–3 cụm/bịch ban đầu, sau đó duy trì 4–5 cụm/bịch với chu kỳ 25–30 ngày/lần). Thí nghiệm khảo sát 3 mức nồng độ BA (0 mg/l, 0,25 mg/l, 0,5 mg/l) trên nền 1/2 MS, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
• Thí nghiệm 3 (Kích thích tạo rễ với NAA): Thu nhận chồi từ bịch nhân giống sau 26 ngày (chọn chồi khỏe có 3–4 lá, chiều cao 2,5 – 3,5 cm), cấy vào môi trường 1/2 MS bổ sung than hoạt tính và khảo sát 3 mức nồng độ NAA (0,15 mg/l, 0,25 mg/l, 0,5 mg/l) với 3 lần lặp lại.
• Thí nghiệm 4 (Theo dõi sinh trưởng giai đoạn vườn ươm): Bình cây ra rễ (đạt mật độ 35–40 cây/bịch) được chuyển ra ngoài tập nắng 2–3 ngày nhằm giúp cây làm quen với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Sau đó, tiến hành rửa sạch toàn bộ lớp thạch agar bám trên rễ, cấy cây vào vỉ xốp chứa giá thể phối trộn (1 phần xơ dừa : 2 phần đất mùn), tưới ẩm, cắm ngập rễ và không lấp ngọn sinh trưởng.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các bảng số liệu thực nghiệm và phân tích kết quả sinh trưởng của cây dâu tây qua từng giai đoạn:

1. Kết quả xử lý vô trùng và nhập mẫu (Thí nghiệm 1)

Kết quả theo dõi số lượng mẫu chồi sống sót sau khử trùng được ghi nhận cụ thể như sau:

Nồng độ Calcium hypochlorite	Thời gian 10 phút (cây sống)	Thời gian 15 phút (cây sống)	Thời gian 30 phút (cây sống)	Số cây sống trung bình
7%	7	6	10	7,67
12%	10	12	6	9,33
20%	2	1	0	1,00

Thảo luận: Nồng độ Calcium hypochlorite 12% kết hợp thời gian xử lý 15 phút cho kết quả tối ưu nhất với 12 mẫu sống sót, mô sinh trưởng tốt. Ở nồng độ thấp (7%), thời gian 10–15 phút không đủ hiệu lực tiêu diệt tạp nhiễm trên bề mặt mẫu (tỷ lệ sống chỉ đạt 6–7 cây), phải kéo dài đến 30 phút mới cải thiện tỷ lệ sạch (10 cây). Ngược lại, ở nồng độ cao (20%), tính sát trùng quá mạnh gây tổn thương sâu mô tế bào thực vật, làm cháy mẫu và khiến hầu hết mẫu bị chết (tại mốc 30 phút số mẫu sống bằng 0; trung bình cả nồng độ chỉ đạt 1,00 cây sống).

2. Kết quả nhân nhanh chồi dưới ảnh hưởng của BA (Thí nghiệm 2)

Số liệu theo dõi số chồi tái sinh và chiều cao chồi dâu tây ở các mức nồng độ BA được tổng hợp:

Nồng độ BA (mg/l)	Lần lặp lại 1	Lần lặp lại 2	Lần lặp lại 3	Giá trị trung bình
Số chồi tạo thành (chồi/cụm):
0 mg/l	2	2	3	2,30 chồi
0,25 mg/l	7	9	7	7,70 chồi
0,5 mg/l	1	1	1	1,00 chồi
Chiều cao chồi (cm):
0 mg/l	1,9	2,0	2,2	1,80 cm
0,25 mg/l	3,7	3,9	3,3	3,63 cm
0,5 mg/l	1,2	2,0	1,3	1,50 cm

Thảo luận: Nồng độ BA bổ sung 0,25 mg/l vào môi trường 1/2 MS là tối ưu nhất cho giai đoạn nhân nhanh, đạt số chồi trung bình cao nhất (7,7 chồi/cụm) và chiều cao chồi vượt trội (3,63 cm). Ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung BA (0 mg/l), chồi vẫn phát sinh nhờ hormone nội sinh nhưng hệ số nhân rất thấp (2,3 chồi; chiều cao 1,8 cm). Khi tăng nồng độ BA lên 0,5 mg/l, môi trường dư thừa Cytokinin đã gây ức chế sinh trưởng, làm giảm số chồi xuống mức thấp nhất (1,0 chồi/cụm) và kìm hãm chiều cao chồi (1,50 cm).

3. Kết quả kích thích tạo rễ dưới ảnh hưởng của NAA (Thí nghiệm 3)

Số liệu đo đạc chiều dài rễ trung bình của chồi dâu tây sau khi cấy trên môi trường bổ sung NAA và than hoạt tính:

Nồng độ NAA (mg/l)	Lần lặp lại 1 (mm)	Lần lặp lại 2 (mm)	Lần lặp lại 3 (mm)	Chiều dài rễ trung bình (mm)
0,15 mg/l	0,2	0,5	0,7	0,47
0,25 mg/l	2,0	1,8	2,0	1,90
0,50 mg/l	5,0	4,0	3,0	4,00

Thảo luận: Tại nồng độ NAA 0,15 mg/l, rễ phát triển chậm và ngắn (trung bình 0,47 mm). Ở nồng độ 0,5 mg/l, rễ phát triển dài nhất (đạt trung bình 4,00 mm). Tuy nhiên, tác giả kết luận nồng độ NAA 0,25 mg/l (chiều dài rễ trung bình 1,90 mm) là ngưỡng thích hợp nhất để áp dụng vào sản xuất: bộ rễ hình thành vừa đủ độ cứng cáp cho cây con, tránh hiện tượng rễ quá dài gây dập nát khi thao tác ra ngôi, đồng thời giúp tiết kiệm chi phí hóa chất. Than hoạt tính trong môi trường đóng vai trò che tối phần gốc kích thích ra rễ và hấp phụ các hợp chất phenol độc do mô tiết ra.

4. Kết quả giai đoạn huấn luyện cây con ngoài vườn ươm (Thí nghiệm 4)

• Thời gian tập nắng thích hợp nhất cho bình cây là từ 2–3 ngày, giúp cây con thích ứng dần với điều kiện nhiệt độ và cường độ ánh sáng tự nhiên.
• Giá thể phối trộn 1 phần xơ dừa : 2 phần đất mùn đảm bảo độ tơi xốp, giữ ẩm tốt và thoát nước hiệu quả.
• Tỷ lệ sống sót của cây con chuyển giao giai đoạn vườn ươm đạt từ 80% đến 90%.
• Sau khoảng 20 ngày chăm sóc trong vỉ xốp, cây giống phát triển hoàn chỉnh bộ rễ, thân lá cứng cáp và đủ tiêu chuẩn xuất vườn phục vụ trồng trọt thương phẩm.

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả định lượng chính

Khóa luận đã xác lập được các thông số kỹ thuật cụ thể cho từng công đoạn trong quy trình vi nhân giống dâu tây:

• Công đoạn khử trùng mẫu ban đầu: Sử dụng Calcium hypochlorite ở nồng độ 12% trong thời gian 15 phút, đạt hiệu quả làm sạch tối ưu với 12 mẫu sống sót (trung bình nghiệm thức đạt 9,33 cây sống).
• Công đoạn nhân nhanh chồi: Bổ sung 0,25 mg/l BA trên nền môi trường 1/2 MS giúp cụm chồi phát triển tốt nhất, đạt số chồi trung bình 7,7 chồi/cụm và chiều cao chồi trung bình đạt 3,63 cm.
• Công đoạn tạo rễ in vitro: Bổ sung 0,25 mg/l NAA kết hợp than hoạt tính trên nền môi trường 1/2 MS cho chiều dài rễ trung bình 1,90 mm, đảm bảo cân đối sinh trưởng và hiệu quả kinh tế.
• Công đoạn vườn ươm: Huấn luyện tập nắng 2–3 ngày, cấy cây trên giá thể phối trộn (1 xơ dừa : 2 đất mùn), đạt tỷ lệ sống sót từ 80% đến 90% và có thể xuất cây sản xuất sau 20 ngày chăm sóc.

2. Giải pháp và quy trình đề xuất

Tác giả đề xuất một quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh và đồng bộ gồm 4 bước liên hoàn:

1. Tuyển chọn và xử lý mẫu: Khử trùng chồi tia dâu tây bằng cồn 70% (1–2 phút), Calcium hypochlorite 12% (15 phút), cấy mẫu trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,4 mg/l BA và 25 g/l đường.
2. Nhân cụm chồi định kỳ: Duy trì mật độ 4–5 cụm/bịch trên môi trường 1/2 MS + 0,25 mg/l BA với chu kỳ nhân chuyển từ 25–30 ngày/lần.
3. Tạo cây hoàn chỉnh: Tách các chồi đơn đạt chiều cao 2,5–3,5 cm có từ 3–4 lá chuyển sang môi trường 1/2 MS + 0,25 mg/l NAA + than hoạt tính để kích thích ra rễ trong 5–7 ngày.
4. Ra ngôi thích nghi: Tập nắng bình cây 2–3 ngày, rửa sạch thạch agar, cắm cây vào vỉ xốp chứa giá thể xơ dừa và đất mùn ẩm (tỷ lệ 1:2), chăm sóc trong 20 ngày trước khi trồng sản xuất.

3. Đóng góp thực tiễn

Khóa luận cung cấp hệ thống dẫn liệu thực nghiệm chi tiết, góp phần chuẩn hóa quy trình công nghệ nhân giống cây dâu tây in vitro tại chỗ cho Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt. Kết quả nghiên cứu hỗ trợ trực tiếp cho mục tiêu cung cấp nguồn giống dâu tây sạch bệnh, trẻ hóa nguồn giống, phục hồi và mở rộng diện tích sản xuất dâu tây thương phẩm tại tỉnh Lâm Đồng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng còn hẹp (mới khảo sát 3 mức nồng độ đơn lẻ của BA và NAA trên nền môi trường khoáng cố định 1/2 MS); chưa thử nghiệm kết hợp đa dạng các tổ hợp phytohormone khác.
• Nghiên cứu thực nghiệm dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và giai đoạn vỉ xốp 20 ngày tại vườn ươm; chưa theo dõi sinh trưởng, khả năng kháng bệnh và năng suất thu hoạch quả ở giai đoạn canh tác thương phẩm ngoài đồng ruộng.

2. Hạn chế và hướng mở rộng

• Nghiên cứu ứng dụng các công nghệ nuôi cấy mới như hệ thống Bioreactor (nuôi cấy lỏng sục khí) hoặc vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) nhằm nâng cao hệ số nhân giống và hạ giá thành sản xuất cây giống.
• Đánh giá chất lượng nông học, độ đồng đều di truyền và năng suất quả của cây dâu tây in vitro qua các vụ mùa canh tác thực tế tại các vùng trồng trọng điểm như Đà Lạt và Lạc Dương.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Đối tượng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học thực vật, Nông học, Trồng trọt và Nông nghiệp công nghệ cao; kỹ thuật viên tại các trung tâm giống và phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thương mại.
• Nội dung giá trị: Các thông số thực nghiệm chi tiết về nồng độ khử trùng mô chồi tia, công thức phytohormone tối ưu cho quá trình nhân chồi và tạo rễ, cùng hướng dẫn kỹ thuật huấn luyện cây con ra ngôi vườn ươm (chế độ tập nắng, tỷ lệ phối trộn giá thể).

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ và thời gian xử lý hóa chất khử trùng nào cho tỷ lệ chồi dâu tây sống sót cao nhất?

Theo kết quả Thí nghiệm 1, xử lý mẫu chồi tia bằng dung dịch Calcium hypochlorite ở nồng độ 12% trong thời gian 15 phút cho kết quả tối ưu nhất với 12 mẫu sống sót (trung bình nghiệm thức đạt 9,33 cây sống). Xử lý ở nồng độ 7% không diệt hết vi sinh vật, trong khi nồng độ 20% làm cháy và chết mô tế bào thực vật.

2. Nồng độ BA nào thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi dâu tây in vitro?

Nồng độ BA tối ưu được xác định là 0,25 mg/l trên nền môi trường 1/2 MS, cho số chồi trung bình đạt 7,7 chồi/cụm và chiều cao chồi trung bình đạt 3,63 cm. Nghiệm thức đối chứng không có BA chỉ đạt 2,3 chồi/cụm, còn nồng độ cao 0,5 mg/l gây ức chế sinh trưởng rõ rệt (chỉ đạt 1,0 chồi/cụm và chiều cao 1,5 cm).

3. Tại sao tác giả lựa chọn nồng độ NAA 0,25 mg/l cho giai đoạn tạo rễ thay vì nồng độ 0,5 mg/l?

Mặc dù nồng độ NAA 0,5 mg/l cho chiều dài rễ trung bình lớn nhất (4,00 mm), tác giả lựa chọn nồng độ 0,25 mg/l (chiều dài rễ trung bình 1,90 mm) vì mức phát triển rễ này đã đảm bảo đầy đủ tiêu chuẩn cho cây con xuất vườn, tránh hiện tượng rễ quá dài dễ gãy dập khi cấy chuyển, đồng thời tiết kiệm chi phí hóa chất trong sản xuất.

4. Quy trình huấn luyện cây dâu tây ra vườn ươm được thực hiện như thế nào và tỷ lệ sống đạt bao nhiêu?

Cây dâu tây sau khi tạo rễ được tập nắng 2–3 ngày để làm quen với ánh sáng tự nhiên, sau đó rửa sạch lớp thạch agar bám trên rễ và cấy vào vỉ xốp chứa giá thể phối trộn theo tỷ lệ 1 phần xơ dừa : 2 phần đất mùn. Cây con được giữ ẩm, cắm ngập rễ và không lấp ngọn. Tỷ lệ sống sót đạt từ 80% đến 90%, sau khoảng 20 ngày chăm sóc cây đạt tiêu chuẩn xuất vườn trồng sản xuất.

5. Điều kiện môi trường phòng nuôi cấy cây dâu tây in vitro trong nghiên cứu này gồm những thông số nào?

Phòng nuôi cây duy trì cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng từ 23 đến 27°C và độ ẩm không khí duy trì trong khoảng 60–80%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng đã nghiên cứu và hoàn thiện các thông số thực nghiệm quan trọng trong quy trình nhân giống cây dâu tây in vitro tại Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt. Nghiên cứu xác định được các công thức tối ưu: khử trùng bằng Calcium hypochlorite 12% trong 15 phút, nhân chồi trên môi trường 1/2 MS bổ sung 0,25 mg/l BA (đạt 7,7 chồi/cụm), tạo rễ với 0,25 mg/l NAA kết hợp than hoạt tính, và tỷ lệ sống ngoài vườn ươm đạt 80–90% trên giá thể xơ dừa - đất mùn (tỷ lệ 1:2). Kết quả cung cấp quy trình kỹ thuật thực tiễn, góp phần thúc đẩy việc cung ứng nguồn cây giống dâu tây sạch bệnh và chất lượng cao cho vùng chuyên canh Đà Lạt.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro 1.Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.

Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di truyền và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua.

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy.

Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng.

Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều và được ứng dụng thương mại hóa. -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm 1. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống.

Về mặt lý luận sinh học cơ bản. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh.

Đây là ưu thế mà các nhà khoa học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài.

Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ tốn kém hơn.

Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp.

-7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm 1. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro 1. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước một lần.

- Máy cất nước 2 lần. Phòng hấp sấy - Nồi hấp Autoclave. - Tủ sấy: 60oC-200oC. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0.

- Cân kỹ thuật (chính xác 0. -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng - Lò vi sóng. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng. - Quạt thông gió.

- Đèn tử ngọai treo trên tường. Phòng nuôi cấy mô (Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền). - Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần). - Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần).

- Hệ thống đèn chiếu. Phòng chứa mẫu - Kệ chất mẫu. - Bóng đèn, ổn áp… -9- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Phòng chất cây 1.

Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 1. Nuôi cấy nốt đơn thân 1. Phương pháp Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn.

Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn chỉnh và được chuyển ra đất trồng. Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân - Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao.

Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh. -10- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng - Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín. Nền cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn.

Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống. - Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởng nhiều hơn so với chồi trưởng thành. - Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻ hóa chồi để cảm ứng sự ra rễ. Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: cây măng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột.

Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển. Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lập trong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triển dưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển.

Các chồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra. Sau đó các chồi được đưa ra môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoàn chỉnh. -11- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên. Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền.

Hiện nay, phương pháp này được áp dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và ngay cả vô tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế bào con.

Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus. Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp.

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily. Một số -12- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho.