CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro 1.Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.
Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di truyền và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy.
Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng.
Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều và được ứng dụng thương mại hóa. -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm 1. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống.
Về mặt lý luận sinh học cơ bản. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh.
Đây là ưu thế mà các nhà khoa học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài.
Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ tốn kém hơn.
Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp.
-7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm 1. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro 1. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước một lần.
- Máy cất nước 2 lần. Phòng hấp sấy - Nồi hấp Autoclave. - Tủ sấy: 60oC-200oC. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0.
- Cân kỹ thuật (chính xác 0. -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng - Lò vi sóng. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng. - Quạt thông gió.
- Đèn tử ngọai treo trên tường. Phòng nuôi cấy mô (Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền). - Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần). - Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Hệ thống đèn chiếu. Phòng chứa mẫu - Kệ chất mẫu. - Bóng đèn, ổn áp… -9- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1. Phòng chất cây 1.
Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 1. Nuôi cấy nốt đơn thân 1. Phương pháp Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn.
Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn chỉnh và được chuyển ra đất trồng. Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân - Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao.
Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh. -10- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng - Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín. Nền cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn.
Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống. - Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởng nhiều hơn so với chồi trưởng thành. - Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻ hóa chồi để cảm ứng sự ra rễ. Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: cây măng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột.
Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển. Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lập trong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triển dưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển.
Các chồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra. Sau đó các chồi được đưa ra môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoàn chỉnh. -11- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên. Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền.
Hiện nay, phương pháp này được áp dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và ngay cả vô tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế bào con.
Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus. Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp.
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily. Một số -12- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho.