Luận văn thạc sĩ hus phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm

Luận văn thạc sĩ HUS trình bày phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để xác định dư lượng kháng sinh sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm.

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung
• Trường học: Trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)
• 1.2. Lịch sử phát hiện
• 1.3. Phân loại SAs
• 1.4. Cấu tạo của SAs
• 1.5. Tác dụng của SAs
• 1.6. Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid
• 1.7. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm
• 1.8. Các phương pháp xác định SAs
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng
• 2.4. Detector khối phổ
• 2.5. Phân tích định tính và định lượng bằng LC/MS
• 2.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 2.6.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.6.2. Hóa chất, chất chuẩn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS
• 3.2. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)
• 3.3. Lựa chọn cột tách
• 3.4. Khảo sát chương trình gradient
• 3.5. Khảo sát tốc độ pha động
• 3.6. Khảo sát thành phần acid formic trong pha động
• 3.7. Tối ưu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAs
• 3.7.1. Khảo sát qui trình chiết
• 3.7.2. Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• 3.7.3. Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết
• 3.7.4. Khảo sát khối lượng pha rắn PSA
• 3.8. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.8.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
• 3.8.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
• 3.8.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)
• 3.9. Phân tích mẫu thực
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động
• Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu
• Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết và khối lượng PSA
• Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phương pháp (độ lặp lại, độ thu hồi)
• Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp LC MS MS Trong Xác Định Kháng Sinh

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc xác định dư lượng kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn đảm bảo độ chính xác cao trong việc phân tích các hợp chất hóa học phức tạp. Việc áp dụng LC-MS/MS trong nghiên cứu này nhằm mục đích đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

1.1. Khái Niệm Về Kháng Sinh Sulfonamid

Kháng sinh sulfonamid (SAs) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp, có tác dụng kìm khuẩn mạnh mẽ. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để phòng và điều trị bệnh cho gia súc gia cầm. Tuy nhiên, việc tồn dư của chúng trong thực phẩm đang trở thành vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

1.2. Lịch Sử Phát Triển Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã được phát triển từ những năm 1980 và nhanh chóng trở thành tiêu chuẩn trong phân tích hóa học. Với khả năng phân tích đồng thời nhiều hợp chất, LC-MS/MS đã chứng minh được tính hiệu quả trong việc xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm.

II. Vấn Đề Tồn Dư Kháng Sinh Trong Thịt Gia Súc

Tồn dư kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc là một vấn đề nghiêm trọng, gây ra nhiều lo ngại về an toàn thực phẩm. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong chăn nuôi dẫn đến sự tích tụ của chúng trong cơ thể động vật, từ đó ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc tiêu thụ thực phẩm chứa dư lượng kháng sinh có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh.

2.1. Nguyên Nhân Dẫn Đến Tồn Dư Kháng Sinh

Nguyên nhân chính dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thịt gia súc bao gồm việc sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng, thời gian ngừng sử dụng trước khi giết mổ không đủ, và việc không tuân thủ quy trình kiểm tra an toàn thực phẩm.

2.2. Hệ Lụy Của Tồn Dư Kháng Sinh

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có thể gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng, bao gồm nguy cơ kháng thuốc, ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong cơ thể người, và có thể dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư và sốc phản vệ.

III. Phương Pháp LC MS MS Trong Phân Tích Dư Lượng Kháng Sinh

Phương pháp LC-MS/MS được sử dụng để xác định dư lượng kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc với độ nhạy và độ chính xác cao. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và hiệu quả, giúp phát hiện các hợp chất độc hại trong thực phẩm. Việc tối ưu hóa các điều kiện phân tích là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động dựa trên nguyên tắc sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ, cho phép tách biệt và xác định các hợp chất hóa học trong mẫu phân tích. Nguyên tắc này giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh.

3.2. Quy Trình Phân Tích Mẫu

Quy trình phân tích mẫu bằng LC-MS/MS bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, tách chiết, và phân tích. Mỗi bước đều cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao nhất trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh sulfonamid.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS không chỉ được áp dụng trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn kiểm tra an toàn thực phẩm. Việc sử dụng phương pháp này giúp các cơ quan chức năng phát hiện nhanh chóng và chính xác dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc, từ đó bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Thực Tế

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc áp dụng LC-MS/MS trong phân tích dư lượng kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc cho kết quả chính xác và đáng tin cậy. Các mẫu thực tế đã được phân tích cho thấy mức độ tồn dư kháng sinh trong giới hạn cho phép.

4.2. Vai Trò Của LC MS MS Trong Kiểm Soát An Toàn Thực Phẩm

LC-MS/MS đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời các chất độc hại trong thực phẩm, từ đó bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao chất lượng thực phẩm trên thị trường.

V. Kết Luận Về Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã chứng minh được tính hiệu quả trong việc xác định dư lượng kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích hiện đại hơn để nâng cao độ chính xác và độ nhạy trong việc kiểm tra an toàn thực phẩm.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về phương pháp LC-MS/MS cần được mở rộng để bao quát nhiều loại kháng sinh khác nhau, từ đó nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát an toàn thực phẩm.

5.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Mới

Cần nghiên cứu thêm về các phương pháp mới kết hợp với LC-MS/MS để nâng cao hiệu quả phân tích, đồng thời phát triển các tiêu chuẩn kiểm tra an toàn thực phẩm phù hợp với thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thực trạng tồn dư hóa chất và kháng sinh trong chăn nuôi đang là mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng và ngành nông nghiệp thực phẩm. Nhóm kháng sinh Sulfonamides (SAs) được sử dụng phổ biến trong thức ăn gia súc, gia cầm nhằm kích thích tăng trưởng và phòng trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột, hô hấp. Tuy nhiên, việc lạm dụng bừa bãi và không tuân thủ thời gian ngừng thuốc đã dẫn đến hiện tượng tích lũy dư lượng kháng sinh vượt ngưỡng cho phép, gây ra các nguy cơ nghiêm trọng như kháng thuốc kháng sinh ở người, rối loạn tạo máu, suy thận do kết tinh sỏi và nguy cơ gây ung thư tuyến giáp.

Theo báo cáo từ Chương trình Kiểm soát Dư lượng Quốc gia Hoa Kỳ (U.S. NRP), trong số 17.241 mẫu thịt kiểm tra, các vi phạm liên quan đến SAs chiếm tỷ lệ cao nhất với 0,24% trong tổng số 2.496 mẫu phân tích SAs; cá biệt có mẫu gan lợn nhiễm tới 2,39 ppm và gan bê nhiễm 0,50 ppm. Tại Việt Nam, các đợt kiểm tra của Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản cũng ghi nhận nhiều mẫu thực phẩm nhiễm Sulfadimidine lên tới 123,26 ppb và Sulfadiazine ở mức 15,26 ppb. Trong khi đó, các thị trường nhập khẩu lớn như Liên minh Châu Âu (EU), Hoa Kỳ và Việt Nam đều áp dụng mức giới hạn tồn dư tối đa (MRL) là 100 µg/kg (100 ppb), thậm chí Nhật Bản quy định 20 µg/kg và Hàn Quốc siết chặt ở mức 10 µg/kg.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình phân tích đồng thời 10 kháng sinh nhóm Sulfonamides (SIM, SD, STZ, SP, SM, SMM, SCP, SMX, SSA, SDM) trên nền mẫu thịt gia súc, gia cầm tại Hà Nội bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) kết hợp xử lý mẫu QuEChERS. Đề tài mang lại ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc cung cấp một công cụ phân tích siêu vết có độ chọn lọc cao, độ nhạy vượt trội với giới hạn phát hiện đạt 0,025 ppb, đáp ứng nghiêm ngặt các tiêu chuẩn kiểm soát an toàn thực phẩm trong nước và quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng của hai lý thuyết phân tích công nghệ cao kết hợp với các nguyên lý chuẩn bị mẫu tiên tiến:

• Lý thuyết sắc ký lỏng tương tác pha đảo (RP-HPLC): Dựa trên sự phân bố vi sai của các phân tử SAs giữa pha tĩnh C18 không phân cực và pha động phân cực. Các phân tử SAs có giá trị hằng số phân ly acid (pKa) dao động từ 4,83 đến 8,54; do đó, sự điều chỉnh pH bằng acid hữu cơ cho phép kiểm soát trạng thái ion hóa, tối ưu hóa thời gian lưu và độ sắc nét của pic sắc ký.
• Lý thuyết khối phổ hai lần (Tandem Mass Spectrometry - MS/MS): Ứng dụng nguồn ion hóa phun điện tử ESI ở chế độ ion dương (ESI+) để tạo ion phân tử giả định dạng [M+H]+. Tại bộ phân tích ba tứ cực (Triple Quadrupole), tứ cực thứ nhất (Q1) chọn lọc ion mẹ, buồng va chạm (Q2) kích hoạt sự phân mảnh với khí trơ (CID), và tứ cực thứ ba (Q3) quét các ion con đặc trưng (như mảnh phân tử m/z 156 [NH2C6H4SO2]+) nhằm định tính và định lượng chất phân tích với độ chọn lọc tuyệt đối.
• Khái niệm trọng tâm: Kỹ thuật chiết QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), chiết pha rắn phân tán (d-SPE), chất hấp phụ amin bậc 1 và bậc 2 (PSA), tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N), và chất nội chuẩn đồng vị Sulfadimethoxine-d4 (SDM-d4) nhằm loại trừ triệt để hiệu ứng nền mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

• Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu: Thu thập ngẫu nhiên 60 mẫu thực phẩm gồm thịt lợn, thịt bò, thịt gà và phủ tạng động vật (gan, thận) tại các chợ dân sinh và chợ đầu mối trên địa bàn nội thành Hà Nội. Mỗi mẫu lấy khối lượng từ 100 g đến 500 g, được bảo quản lạnh ở 0 - 2°C và xử lý sơ bộ trong vòng 24 giờ, mẫu lưu trữ dài hạn tại nhiệt độ -20°C.
• Quy trình chuẩn bị mẫu: Áp dụng phương pháp QuEChERS cải tiến. Mẫu đồng nhất được chiết lỏng - lỏng bằng dung môi Acetonitril (ACN) có bổ sung 1% acid acetic để tăng khả năng thu hồi, tách pha bằng muối khan, sau đó làm sạch dịch chiết bằng kỹ thuật d-SPE chứa 200 mg chất hấp phụ PSA để loại bỏ acid béo, đường và sắc tố hữu cơ. Lý do lựa chọn kỹ thuật này là giúp cắt giảm 80% lượng dung môi độc hại so với chiết lỏng - lỏng truyền thống (LLE) và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 15 phút.
• Điều kiện phân tích thiết bị: Sử dụng hệ thống HPLC Shimadzu 20 AXL ghép nối khối phổ ABI 5500 QQQ. Tách sắc ký trên cột Agilent C18 (150 mm × 2,1 mm; 3,5 µm) ở nhiệt độ 30°C. Pha động gồm kênh A (nước chứa 0,1% acid formic) và kênh B (ACN) vận hành theo chương trình gradient nồng độ trong tổng thời gian 18 phút, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µL.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Tối ưu hóa điều kiện ion hóa và sắc ký: Xác định chính xác các cặp chuyển khối MRM cho 10 chất kháng sinh SAs và nội chuẩn SDM-d4 ở chế độ ESI+. Việc khảo sát nồng độ acid formic từ 0% đến 0,2% cho thấy nồng độ 0,1% acid formic trong pha động giúp tăng diện tích pic lên từ 1,5 đến 3,0 lần đối với hầu hết các chất (chẳng hạn STZ tăng diện tích pic từ 2,94×10^5 lên 8,78×10^5, SCP tăng từ 3,21×10^5 lên 6,85×10^5). Tốc độ dòng 0,4 ml/phút đảm bảo pic sắc ký nhọn, đối xứng và duy trì áp suất hệ thống ổn định dưới 250 bar.
• Tối ưu hóa hiệu suất chiết và làm sạch QuEChERS: Sử dụng hỗn hợp ACN chứa 1% acid acetic kết hợp 200 mg PSA đem lại hiệu suất thu hồi vượt trội, loại bỏ hơn 95% tạp chất nền thịt và gan mà không làm thất thoát các kháng sinh phân cực.
• Đặc trưng kỹ thuật và độ tin cậy của phương pháp:
  • Đường chuẩn thiết lập trên khoảng nồng độ rộng từ 0,5 ng/ml đến 500 ng/ml (0,5 - 500 ppb) đạt hệ số tương quan tuyến tính tuyệt đối với R² dao động từ 0,9991 đến 1,0000 (SMM có R² = 1,0000; SIM có R² = 0,9999).
  • Giới hạn phát hiện (LOD) đạt mức siêu vết 0,025 ppb (với S/N = 3,3 - 3,5) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt 0,05 ppb (với S/N = 10,5). Mức LOQ này nhạy hơn 2000 lần so với ngưỡng quy định MRL 100 ppb của Bộ Y tế và EU.
  • Đánh giá độ chụm và độ đúng tại các mức nồng độ thêm chuẩn 5 ppb, 10 ppb và 20 ppb trên nền mẫu thịt lợn cho hiệu suất thu hồi đạt từ 82,4% đến 104,6%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đều dưới 9,8%, hoàn toàn thỏa mãn tiêu chuẩn khắt khe của Quyết định 2002/657/EC.
• Kết quả khảo sát trên mẫu thực tế: Phân tích các mẫu thịt và phủ tạng tại Hà Nội đã phát hiện dấu vết tồn dư Sulfadimethoxine (SDM) trong một số mẫu phủ tạng gà thương phẩm, trong khi các mẫu gan lợn kiểm tra đều cho kết quả âm tính hoặc nằm dưới ngưỡng LOQ.

Thảo luận kết quả

Các kết quả khảo sát cho thấy bản chất phân tử của các Sulfonamides chứa cả nhóm chức amin thơm (-NH2) và nhóm sulfonamide (-SO2NH-), khiến chúng mang tính chất lưỡng tính. Việc bổ sung 0,1% acid formic vào pha động nước thúc đẩy quá trình proton hóa [M+H]+ diễn ra triệt để trong nguồn ESI, tối đa hóa mật độ ion đi vào bộ phân tích khối phổ. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ acid formic lên 0,2%, sự dư thừa ion trong pha khí gây ra hiện tượng cạnh tranh điện tích và ức chế ion hóa (ion suppression), làm suy giảm diện tích pic của SMM từ 4,54×10^5 xuống còn 2,76×10^5.

Dữ liệu thực nghiệm được trình bày qua các đồ thị phân bố diện tích pic theo nồng độ acid hữu cơ và sắc ký đồ MRM tách biệt hoàn toàn 10 pic chất phân tích trong khoảng thời gian từ 6 đến 15 phút mà không xảy ra hiện tượng chồng chéo pic. So với phương pháp sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD) vốn đòi hỏi dẫn xuất hóa phức tạp bằng Fluorescamine và thời gian chạy kéo dài trên 60 phút, phương pháp LC-MS/MS kết hợp QuEChERS trong nghiên cứu này rút ngắn tổng chu kỳ phân tích xuống 18 phút, đồng thời loại bỏ nguy cơ dương tính giả nhờ kiểm soát đồng thời 2 mảnh ion định tính và định lượng cho mỗi hợp chất.

Đề xuất và khuyến nghị

• Chuẩn hóa và ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia: Bộ Y tế phối hợp cùng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tích hợp quy trình LC-MS/MS QuEChERS vào hệ thống Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) trong vòng 12 tháng tới, nhằm thay thế các phương pháp cũ, giúp các cơ quan kiểm nghiệm giảm 70% thời gian xử lý mẫu và tiết kiệm chi phí hóa chất.
• Hiện đại hóa năng lực phân tích tại các trạm kiểm nghiệm: Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia và các trung tâm kiểm nghiệm vùng cần triển khai chương trình tập huấn kỹ thuật vận hành LC-MS/MS và quy trình d-SPE cho 100% kỹ thuật viên phân tích trong thời hạn 6 tháng, đảm bảo tính đồng bộ của mạng lưới kiểm nghiệm trên toàn quốc.
• Tăng cường thanh tra và kiểm soát chuỗi cung ứng thịt: Chi cục Thú y và Quản lý Chất lượng Nông Lâm Thủy sản tại các địa phương cần nâng tần suất lấy mẫu ngẫu nhiên tại các chợ đầu mối và cơ sở giết mổ tập trung lên mức tối thiểu 500 mẫu/tháng, tập trung phân tích các mẫu phủ tạng và thịt gia súc có nguy cơ cao nhằm phát hiện kịp thời các lô hàng vi phạm ngưỡng MRL 100 ppb.
• Siết chặt quản lý kê đơn thuốc thú y và đào tạo hộ chăn nuôi: Các hội nông dân và chi cục chăn nuôi địa phương cần phát động chiến dịch truyền thông về thời gian ngừng thuốc bắt buộc (từ 7 đến 14 ngày trước khi xuất chuồng), đặt mục tiêu giảm 30% tỷ lệ mẫu thịt có tồn dư kháng sinh trong vòng 2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Chuyên viên phân tích và kiểm nghiệm viên thực phẩm: Nắm bắt chi tiết các thông số kỹ thuật tối ưu hóa thiết bị khối phổ ba tứ cực, chương trình rửa giải gradient và kỹ thuật QuEChERS để ứng dụng trực tiếp vào công tác kiểm nghiệm dư lượng kháng sinh hàng ngày tại phòng thí nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và thanh tra nông nghiệp: Sử dụng các dẫn chứng khoa học, mức ngưỡng MRL và dữ liệu khảo sát thực tế làm căn cứ xây dựng chính sách, quy chuẩn giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm cho thị trường tiêu thụ nội địa và xuất khẩu.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa phân tích: Tham khảo phương pháp luận khoa học, cấu trúc thẩm định phương pháp phân tích vết theo tiêu chuẩn quốc tế 2002/657/EC, cũng như cơ chế phân mảnh khối phổ của các hợp chất hữu cơ đa vòng.
• Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi và chế biến thịt xuất khẩu: Áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào và thành phẩm, đảm bảo sản phẩm đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt của các thị trường khó tính như Nhật Bản (MRL 20 ppb) và Hàn Quốc (MRL 10 ppb).

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp LC-MS/MS có ưu thế vượt trội gì so với HPLC-UV và ELISA?

LC-MS/MS cung cấp độ nhạy cao gấp hàng trăm lần với LOD đạt 0,025 ppb so với mức 1 - 5 ppb của HPLC-UV. Ngoài ra, LC-MS/MS xác nhận chất dựa trên tỷ số khối trên điện tích (m/z) của ion mẹ và các ion con đặc trưng, loại bỏ hoàn toàn các sai số dương tính hoặc âm tính giả do phản ứng chéo thường gặp ở phương pháp miễn dịch ELISA.

Vì sao nồng độ acid formic trong pha động được chọn chính xác ở mức 0,1%?

Khảo sát thực nghiệm từ 0% đến 0,2% cho thấy 0,1% acid formic cung cấp lượng proton tối ưu để ion hóa các hợp chất SAs thành dạng [M+H]+, giúp diện tích pic của hầu hết các chất (như STZ đạt 8,78×10^5) cao nhất. Nồng độ cao hơn (0,15 - 0,2%) sẽ gây ra hiện tượng cạnh tranh điện tích trong buồng ion, làm giảm độ nhạy.

Kỹ thuật QuEChERS mang lại lợi ích gì so với chiết lỏng - lỏng truyền thống?

Kỹ thuật QuEChERS sử dụng 200 mg pha rắn phân tán PSA giúp loại bỏ nhanh các acid béo và sắc tố trong thịt mà không cần qua nhiều bước rửa dung môi phức tạp. Quy trình này giảm hơn 80% thể tích dung môi hữu cơ tiêu tốn, rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 15 phút mỗi mẻ và đảm bảo độ thu hồi cao từ 82,4% đến 104,6%.

Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp có đáp ứng tiêu chuẩn xuất khẩu không?

Hoàn toàn đáp ứng vượt tiêu chuẩn. Phương pháp đạt LOQ 0,05 ppb (0,05 µg/kg), thấp hơn 2000 lần so với ngưỡng MRL của Việt Nam, EU, Hoa Kỳ (100 ppb), và thấp hơn từ 200 đến 400 lần so với các tiêu chuẩn khắt khe nhất thế giới của Nhật Bản (20 ppb) và Hàn Quốc (10 ppb).

Làm thế nào để loại trừ hiệu ứng nền mẫu (matrix effect) phức tạp từ thịt và phủ tạng?

Nghiên cứu sử dụng chất nội chuẩn đồng vị Sulfadimethoxine-d4 (SDM-d4) có tính chất hóa lý tương đồng với các chất phân tích nhưng khối lượng phân tử khác biệt (m/z 315/156). Tỷ số diện tích pic giữa chất phân tích và nội chuẩn giúp bù trừ hoàn toàn các biến động do hiệu ứng nền mẫu và sự suy giảm tín hiệu ion hóa.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời 10 kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc, gia cầm bằng hệ thống LC-MS/MS kết hợp xử lý mẫu QuEChERS.
• Tối ưu hóa toàn diện điều kiện sắc ký với cột Agilent C18, pha động chứa 0,1% acid formic, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, hoàn thành chu trình phân tích chỉ trong 18 phút.
• Phương pháp đạt độ nhạy cực cao với LOD 0,025 ppb, LOQ 0,05 ppb, khoảng tuyến tính 0,5 - 500 ppb (R² > 0,999), độ thu hồi đạt 82,4 - 104,6% và RSD < 9,8%.
• Khảo sát thực tế trên các mẫu thịt và phủ tạng tại Hà Nội đã chứng minh tính ứng dụng cao và năng lực phát hiện dư lượng kháng sinh nhanh chóng, chính xác.
• Kế hoạch tiếp theo cần chuyển giao kỹ thuật này đến các trung tâm kiểm nghiệm trên toàn quốc trong vòng 6 - 12 tháng tới nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và nâng tầm nông sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất). Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động. Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh.

Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng. Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp.

Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]. Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh. 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu.

Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs - Tối ƣu quá trình xử lý mẫu.

- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs) 1.1 Lịch sử phát hiện [6] Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide với các vị trí thế N1 và N4.

Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và 1941. Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác.

Phân loại SAs Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]. Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau: - SAs tác động toàn thân, bao gồm: + SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole. + SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine.

12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] +SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin. - SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon. - SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc. - SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin.3 Cấu tạo của SAs Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs khác nhau Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài Khối SAs Công thức lƣợng STT pKa Công thức cấu tạo phân tử phân tử (g/mol) Sulfisomidine (SIM) 1 C12H14N4O2S 278,331 7,35 4-amino-N-(2,6- dimethylpyrimidin-4-yl) benzenesulfonamid Sulfadiazine (SD) 2 C10H10N4O2S 250,278 6,5 4-amino-N-pyrimidin- 2-yl-benzenesulfonamid Sulfathiazole 3 C9H9N3O2S2 255,319 7,24 (STZ) 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4-amino-N-(1,3-thiazol- 2-yl)benzenesulfonamid Sulfapyridine (SP) 4 C11H11N3O2S 249,29 8,54 (4-amino-N-pyridin-2- ylbenzenesulfonamid) Sulfamerazine (SM) 5 C11H12N4O2S 264,305 6,98 4-amino-N-(4- methylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamid Sulfamonomethoxine (SMM) 4-Amino-N-(6- 6 C11H12N4O3S 280,30 6,05 methoxy-4- pyrimidinyl)benzenesulf onamid Sulfachloropyridazine (SCP) 7 C10H9ClN4O2S 284,72 5,90 N’-(6-Chloro-3- pyridazinyl)sulfanilamid e Sulfamethoxazole (SMX) 8 C10H11N3O3S 253,279 5,81 4-amino-N-(5- methylisoxazol-3-yl)- benzenesulfonamid 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sulfisoxazole (SSA) 9 C11H13N3O3S 267,30 4,83 4-amino-N-(3,4- dimethyl-1,2-oxazol-5- yl)benzenesulfonamid Sulfadimethoxine (SDM) 4-amino-N-(2,6- 10 dimethoxypyrimidin-4- C12H14N4O4S 310,33 6,21 yl) benzenesulfonamid đồng vị của SDM: trong phân tử có Sulfadimethoxine-d4 C12H10D4N4O4 bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế 11 314 6,21 (IS) S bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc dùng làm nội chuẩn 1.4 Tác dụng của SAs  Cơ chế tác động: SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic).

Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin.

Do đó khi thiếu 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc. Chúng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng.

Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, Protozoa [9].  Tác dụng phụ của SAs: Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích cho ngƣời chăn nuôi. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt.

Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa.sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens- Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell).

SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký tại Úc năm 1940.