Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Hoạt Chất Kháng HIV Trong Thuốc Bằng Điện Di Mao Quản

Luận văn thạc sĩ HUS trình bày phương pháp định lượng hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng điện di mao quản, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Linh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Ri
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: Năm 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV
• 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
• 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV
• 1.3.1. Các phương pháp sắc ký
• 1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Điều kiện nghiên cứu
• 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC, NVP và AZT
• 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất
• 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản
• 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu
• 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng
• 3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách
• 3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di
• 3.1.7. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm
• 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS
• 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm
• 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu
• 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di
• 3.1.12. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản
• 3.1.13. Tổng kết điều kiện tối ưu
• 3.2. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập
• 3.3. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống
• 3.3.2. Tính đặc hiệu
• 3.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
• 3.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.5. Độ lặp lại của phương pháp
• 3.3.6. Độ đúng của phương pháp
• 3.4. Kết quả định lượng trong chế phẩm
• 3.5. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)
• 3.6. Hướng phát triển của đề tài

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp định lượng hoạt chất kháng HIV

Phương pháp định lượng hoạt chất kháng HIV trong thuốc là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các loại thuốc điều trị HIV. Việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại như điện di mao quản (CE) giúp nâng cao độ chính xác và độ nhạy trong việc xác định nồng độ của các hoạt chất kháng HIV. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về các hoạt chất mà còn góp phần vào việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV tại Việt Nam.

1.1. Giới thiệu về hoạt chất kháng HIV

Hoạt chất kháng HIV bao gồm nhiều nhóm thuốc khác nhau như NRTIs, NNRTIs và PIs. Mỗi nhóm thuốc có cơ chế tác động riêng, giúp ức chế sự phát triển của virus HIV. Việc hiểu rõ về các hoạt chất này là cần thiết để phát triển các phương pháp phân tích hiệu quả.

1.2. Tình hình sử dụng thuốc kháng HIV tại Việt Nam

Tại Việt Nam, số lượng người nhiễm HIV đang gia tăng, và việc sử dụng thuốc kháng HIV ngày càng trở nên phổ biến. Các phác đồ điều trị hiện nay chủ yếu dựa trên sự kết hợp của nhiều loại thuốc để đạt hiệu quả cao nhất trong việc kiểm soát virus.

II. Vấn đề và thách thức trong định lượng hoạt chất kháng HIV

Mặc dù có nhiều phương pháp phân tích hiện đại, nhưng việc định lượng hoạt chất kháng HIV vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như độ chính xác, độ nhạy và khả năng tách biệt các chất trong mẫu phức tạp là những yếu tố cần được cải thiện. Đặc biệt, việc phát hiện các tạp chất và đồng phân trong thuốc cũng là một thách thức lớn.

2.1. Độ chính xác và độ nhạy của phương pháp phân tích

Độ chính xác và độ nhạy là hai yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích. Các nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp điện di mao quản có thể cải thiện đáng kể độ nhạy so với các phương pháp truyền thống.

2.2. Khó khăn trong việc tách biệt các hoạt chất

Việc tách biệt các hoạt chất kháng HIV trong mẫu phức tạp như huyết tương hoặc dịch cơ thể là một thách thức lớn. Các yếu tố như pH, nồng độ dung dịch đệm và điều kiện điện di cần được tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương pháp điện di mao quản trong định lượng hoạt chất kháng HIV

Phương pháp điện di mao quản (CE) đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc định lượng hoạt chất kháng HIV. CE cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác với lượng mẫu rất nhỏ. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như thời gian phân tích ngắn và khả năng tách biệt cao.

3.1. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp CE

Phương pháp CE dựa trên nguyên tắc điện di, trong đó các ion di chuyển trong một dung dịch điện li dưới tác động của điện trường. Sự khác biệt về kích thước và điện tích của các ion sẽ dẫn đến sự tách biệt của chúng.

3.2. Các điều kiện tối ưu cho phương pháp CE

Để đạt được kết quả tốt nhất, các điều kiện như pH của dung dịch đệm, nồng độ SDS và điện thế cần được tối ưu hóa. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố này có thể cải thiện đáng kể độ phân giải và độ nhạy của phương pháp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản không chỉ được ứng dụng trong nghiên cứu mà còn trong sản xuất và kiểm soát chất lượng thuốc kháng HIV. Việc áp dụng CE giúp đảm bảo rằng các sản phẩm thuốc đạt tiêu chuẩn chất lượng cao và an toàn cho người sử dụng.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng CE

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp CE có thể định lượng chính xác các hoạt chất như Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong các chế phẩm thuốc. Kết quả cho thấy CE có thể thay thế các phương pháp phân tích truyền thống.

4.2. Tương lai của phương pháp CE trong phân tích dược phẩm

Với những ưu điểm vượt trội, phương pháp CE có tiềm năng lớn trong việc phát triển các phương pháp phân tích mới cho các hoạt chất dược phẩm khác. Nghiên cứu và ứng dụng CE trong lĩnh vực dược phẩm sẽ tiếp tục được mở rộng trong tương lai.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về phương pháp định lượng hoạt chất kháng HIV bằng điện di mao quản đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc kiểm soát chất lượng thuốc. Việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và đảm bảo an toàn cho người bệnh. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành dược phẩm.

5.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu phương pháp mới

Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích mới là rất cần thiết để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong việc kiểm soát chất lượng thuốc. Các phương pháp như CE sẽ đóng vai trò quan trọng trong tương lai.

5.2. Hướng phát triển tiếp theo trong nghiên cứu

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện phân tích và mở rộng ứng dụng của CE trong các lĩnh vực khác nhau của dược phẩm. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm thuốc kháng HIV.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng đƣợc tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số ngƣời nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu ngƣời mới nhiễm HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh.

Đến tháng 12/2008 ƣớc tính khoảng 4 triệu ngƣời nhiễm HIV ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình đƣợc điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Ở nƣớc ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh,. Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho ngƣời HIV/AIDS.

Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trƣớc đây nƣớc ta chƣa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thƣờng dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trƣờng hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nƣớc ta đã sản xuất đƣợc thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg).

Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chƣơng trình quốc gia đƣợc cấp [12] Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lƣợng thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phƣơng pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lƣợng thuốc HIV. Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp phân tích hóa lý đa số đƣợc sử dụng để định lƣợng các loại thuốc. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt.

Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đƣợc tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phƣơng pháp. Tuy vậy, phƣơng pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hƣởng xấu, gây ô nhiễm môi trƣờng. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phƣơng pháp định lƣợng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15].

CE là phƣơng pháp mới đƣợc phát triển, tuy nhiên có nhiều ƣu điểm vƣợt trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu về Dƣợc. Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã đƣợc quy định trong Dƣợc điển một số nƣớc nhƣ Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chƣa đƣợc ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dƣợc phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hƣớng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lƣợng thuốc ở nƣớc ta.

Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phƣơng pháp điện di mao quản vào định lƣợng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phƣơng pháp điện di mao quản”. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngƣợc có gốc nucleosides (nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine (DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir disoproxil fumarate. Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngƣợc không có gốc nucleosides (non- nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine, Effavirenz. Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir.

Qua nghiên cứu, ngƣời ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt đƣợc hiệu quả điều trị cao. Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tƣơng tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngƣợc của virus. Hai thuốc này đƣợc sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan.

Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân đƣợc cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Ngƣời bệnh tăng cân, có số lƣợng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm3 lên 1547/mm3), số lƣợng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lƣợng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Nhƣ vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của ngƣời bệnh có số lƣợng tế bào CD4 dƣới 500 trong 1mm3.

Liệu pháp này cũng có thể dùng cho những ngƣời bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tƣơng, không phụ thuộc vào số lƣợng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lƣợng sự tiến triển của bệnh [12]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của ngƣời bệnh, bệnh lý mắc kèm. 150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho ngƣời cân nặng dƣới 60kg với ngƣời lớn và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B * Lamivudin: (3TC) Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lƣợng 229,3.

Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C. Dễ tan trong nƣớc, ít tan trong cồn, khó tan trong các dung môi hữu cơ. Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % trong methanol ) Hằng số pKa= 3,31.

Lamivudin hấp thụ UV ở bƣớc sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A1%1cm trong H+ 1M ~ 600 abs Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 150mg là khoảng 1,5μg/ml. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] *Zidovudin: (AZT) Công thức phân tử C10H13N5O4.

Phân tử lƣợng 267. Tên khoa học: 1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4- dione Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu. Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nƣớc, ít tan trong cồn.

Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 990 (C = 0,5% trong nƣớc) Hằng số pKa= 9,36 Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hƣởng khi ăn nhiều chất béo. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml. *Nevirapin (NVP) Công thức phân tử C15H14N4O.

Phân tử lƣợng 266. Tên khoa học: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6- one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần nhƣ trắng. Thực tế không tan trong nƣớc, ít tan trong CH3Cl. Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 990 (C = 0,5% trong nƣớc) Hằng số pKa= 2,42.

Sau khi uống Nevirapin khoảng 4 giờ, sinh khả dụng > 90%, không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid. Đạt Tmax khoảng 4h sau khi dùng liều duy nhất. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 ngƣời nhiễm HIV trong đó có 62.654 ngƣời lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo tại 10 tỉnh có số ngƣời đƣợc điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số ngƣời nhiễm HIV đang đƣợc điều trị trên toàn quốc.

Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nƣớc về số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang điều trị. Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 ngƣời nhiễm HIV đang điều trị, chiếm 30,9% số lƣợng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10]. Tốc độ tăng trƣởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh nhân/tháng. Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là 2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác.

- Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hƣớng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” đƣợc ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐ- BYT ngày 19/8/2009 của Bộ trƣởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã ban hành các văn bản hƣớng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa phƣơng với các nội dung chính nhƣ sau: - Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV hoặc TDF/3TC/NVP. Không sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013. Thuốc d4T chủ yếu đƣợc chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT.

Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối toàn bộ các nguồn thuốc ARV do các chƣơng trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị cho bệnh nhân trên toàn quốc. Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cƣờng sự tuân thủ điều trị ở ngƣời bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV ngày uống 1 lần.