CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người. Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P1, cephalosporin C và penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.
Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp. Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8].2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng * Công thức chung của cephalosporin: R2 H R1 S H NH H O N O R3 HO O Hình 1.1: Công thức chung của cephalosporin Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3 -cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7]. 4 * Phân loại và phổ tác dụng Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế hệ cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin Tên Tên đại Phổ tác dụng nhóm diện Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Cephalothin Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu Cephazolin kháng methicillin).
… - Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella. Thế hệ II Cephaclor - Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác Cephuroxim dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng Cefotetan… trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn. Thế hệ III Cefixim - Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β- Cefoperazon lactamase, tác dụng trên cả P.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1. Thế hệ IV Cefdinir - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3. Cefepim… Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu. - Bền vững với β-lactamase.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số cephalosporin được sử dụng nghiên cứu trong đề tài tại bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài Thế Tên chất hệ Công thức phân tử Tính chất vật lí 1.H2O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng.
monohydrat - Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%.Cefuroxim II C20H22N4O10S - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat và methanol, ít tan trong ethanol.Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7), ít tan trong nước, trong alcol và diethyl ether.5H2O - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Tan trong dung dịch kiềm, và trong dimethyl sulfoxid, ít tan trong dimethylformamid, methanol, nước, không tan trong aceton, ethanol, cloroform, dioxan, ether, ethyl acetat, toluen.Cefotaxim III C16H16N5NaO7S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng.
natri - Dễ tan trong nước, hơi tan trong methanol, thực tế không tan trong ether.Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Dễ tan trong nước, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 1.1 Công thức cấu tạo .2: Công thức cấu tạo của cefixim + Công thức phân tử:C16H15N5O7S2.3H2O + Khối lượng phân tử: 507,5 +Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo[4.0] oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6], [13], [22].2 Tính chất lí hóa Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH từ 2,6 đến 4,1 [6], [13], [22].4 Dược lí Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo đường uống.
Cefixim có độ bền vững cao với sự thủy phân của beta-lactamase mã hóa bởi gen nằm trên plasmid và chromosom. Cefixim có tác dụng cả invitro và trên lâm sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây: - Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes. 7 - Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết beta – lactamase), Moraxella catarrhalis (đa số tiết beta – lactamase), Escherichia coli, Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase). Cefixim không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa và hầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia [5], [9], [11], [12], [18].5 Chỉ định - Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính.
- Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng. - Viêm niệu đạo do lậu cầu. - Điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin thế hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết, viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5], [18].6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim Nghiên cứu định lượng cefixim rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác nhau. Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang - Định lượng cefixim trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm, mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH2PO4, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22].2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch - Cột: C18 (0,125 m x 4 mm, 5µm) - Pha động: ACN : dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5 (chỉnh pH bằng dung dịch H3PO4 1,5 M) (1:3) - Detector: UV λ = 254 nm - Tốc độ dòng: điều chỉnh cho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút [6], [13], [22].
8 Mẫu dịch sinh học Phạm Thu Trang: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng dung dịch acid HClO4 20% - Điều kiện phân tích: o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40 o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH2PO4 12,5 mM, KH2PO4 5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút o Detector: DAD λ =285nm [10]. Abbas Khan và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng acid tricloroacetic - Điều kiện phân tích: o Cột Supelco Discovery HS C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50 o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic(19:81), tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 285 nm [16]. McAteer và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng ACN - Điều kiện sắc kí: o Cột Altex Ultrasphere C8 (150 x 4,6 mm, 5 µl) o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat pH 2,6 = 20:80, tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 254 nm [19]. Emirhan Nemutlu và cộng sự: mẫu huyết tương và nước ối - Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X) - Điều kiện sắc kí: o Cột Xterra C18 (250 x 4,6 mm, 5 µl), nhiệt độ cột 32 o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40mM pH = 3,2 và MeOH, gradient, tốc độ dòng 0,85 ml/phút o Detector: DAD λ = 285 nm [20].
9 Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống đã được công bố - Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg - Điều kiện sắc kí: o Cột Luna C18 (250 x 2 mm, 5 µm) o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha động, tốc độ dòng 0.2 ml/phút o Detector: MS-MS [23]. Nhận xét Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều trường hợp.Vậy nên cefixim là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên cứu nhiều. Các nghiên cứu về cefixim rất phong phú đa dạng từ định lượng cefixim trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải. Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22].
Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định lượng cefixim đồng thời với các chất khác [16], [19], [20]. Tại Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương [10]. Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít.
Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy. Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết pha rắn. Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp.
Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam. Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.1 Khái niệm HPLC là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1].2 Nguyên tắc Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động.