CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh 1.1 Khái niệm Kháng sinh là những chất có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp [10].2 Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc 1.1 Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên Là những kháng sinh hoàn toàn do vi sinh vật tổng hợp (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn.2 Kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp Là những kháng sinh có phần cấu trúc cơ bản do vi sinh vật tổng hợp, sau đó được gắn thêm các nhóm hóa chức bằng phương pháp hóa học.3 Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hóa học Là những kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học. Ví dụ: Nhóm Sulfonamide (SAs).2 Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide Năm 1932, Domard (Đức) đã tìm ra Sulfonamide [11]. Kháng sinh Sulfonamide thường được nhận diện với tiếp đầu ngữ Sulf trong tên hoạt chất: Sulfadoxine, Sulfadiazine, Sulfamoxole, Sulfamethoxazole, Sulfaquinoxaline. - Sulfonamide thuộc họ kháng khuẩn được sử dụng phổ biến trong thú y do hiệu quả trong điều trị và giá thành thấp.
- Có dạng bột tinh thể của acid yếu, ít tan trong nước và môi trường acid yếu, tan tốt ở pH = 9. Tức là chúng có khuynh hướng kết tinh môi trường pH acid của nước tiểu. - Tính hòa tan của hỗn hợp nhiều Sulfonamide cũng có hiệu quả trị liệu tốt hơn.1 Giới thiệu 19 hoạt chất họ Sulfonamide Stt Hoạt chất Công thức hoá học CAS M (g/mol) 1 Sulfanilamide C6H8N2O2S 63-74-1 172.3 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs Hình 1.1 Công thức chung của nhóm Sulfonamide 7 Sulfanilamide Sulfacetamide Sulfachloropyridazine Sulfadimethoxine Sulfadoxin Sulfadiazine Sulfaguanidin Sulfisoxazol Sulfamonomethoxin Sulfamethoxypyridazin Sulfamerazin Sulfadimidine Sulfamethoxazole Sulfamoxol Sulfamethizole Sulfanitran Sulfapyridin Sulfaquinoxaline 8 Sulfathiazol Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs [12]. Trong 19 hợp chất Sulfonamide ta thấy Sulfisoxazole và Sulfamoxole là hai đồng phân cấu tạo của nhau có cùng công thức phân tử C11H13N3O3S và tương tự Sulfamonomethoxine và Sulfamethoxypyridazine cũng là hai đồng phân cấu tạo của nhau có công thức C11H12N4O3S.4 Phân loại thuốc SAs Các Sulfonamide kháng khuẩn và các chất chuyển hóa của chúng được coi là chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy.
Theo thời gian tác dụng và thời gian bán hủy, các Sulfonamide uống có thể hấp thụ được có thể được chia ra gồm: - Sulfonamide tác dụng ngắn (3-8 giờ): Sulfadiazine, Sulfamethoxazol, Sulfisoxazol. - Các Sulfonamide tác dụng trung gian (8-18 giờ): Sulfaguanidine, Salazosulfapyridin. - Sulfonamde tác dụng kéo dài (> 35 giờ): Sulfadoxine 1.5 Các tác dụng phụ của SAs Triệu chứng phổ biến: Phát ban da, ngứa [13]. 9 Các triệu chứng ít gặp: Da nhợt nhạt, đau các khớp và cơ, đỏ, phồng rộp, bong tróc da hoặc lỏng lẻo, khó nuốt, mệt mỏi hoặc suy nhược bất thường, chảy máu hoặc bầm tím bất thường, đau họng và sốt, mắt hoặc da vàng.
Ngoài ra, các triệu chứng hiếm sau mà người bệnh có thể gặp: Co thắt và đau bụng nghiêm trọng, tiêu chảy nhiều nước và nặng, cũng có thể có máu, cơn khát tăng dần, thay đổi tâm trạng hoặc tinh thần, xuất hiện máu trong nước tiểu, đau lưng dưới, đau hoặc rát khi đi tiểu, sưng phần trước của cổ.6 Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs SAs có thể gây ra các vấn đề liên quan đến máu, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao hơn, chảy máu nướu, vết thương chậm lành. Thuốc có thể làm da nhạy cảm với ánh nắng bất thường, gây phát ban da, đỏ, ngứa, cháy nắng nghiêm trọng hoặc đổi màu da. Thuốc cũng có thể khiến một số người bị chóng mặt [14].7 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ 1.1 Nguyên lý chung Phân tích sắc ký (Chromatography): Kỹ thuật tách riêng các hợp chất đã được Tsvett (1906) sử dụng để tách riêng các chất màu trong cây cỏ. Từ ngữ “Chromatography” xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu [15].
LC-MS/MS là hệ thống được kết hợp giữa LC với đầu dò MS, trong đó LC có nhiệm vụ tách chất phân tích (thực hiện bởi cột sắc ký). MS có nhiệm vụ phân tích khối phổ dựa vào giá trị (m/z), là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích [16].3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ [17] Chất phân tích khi vào bộ phận MS được ion hoá bằng các phương pháp khác nhau. Các ion được hình thành đi vào bộ phận đo khối phổ. Do công thức hóa học các chất khác nhau hình thành các ion mang điện tích dương hoặc âm khác nhau, ta chọn kiểu quét âm hoặc dương.2 Các nguồn ion hóa Có ba kiểu hình thành ion trong LC-MS/MS [18]: - Ion hóa phun điện tử (ESI, electrospray ionization) là một kỹ thuật ion hóa chính của LC-MS/MS.
- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, atmospheric pressure chemical ionization). - Ion hóa sử dụng photon tại áp suất khí quyển (APPI, atmospheric pressure photoionization). 11 Kỹ thuật ESI được sử dụng nhiều nhất, APCI sử dụng ít hơn và trong nghiên cứu đề tài chúng tôi sử dụng phân tích các chất bằng kỹ thuật ESI. Khi so sánh 2 kỹ thuật ion hóa APCI và ESI có thể thấy: • Giống nhau − Đều thuộc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều trường hợp còn thấy được phân tử ban đầu.
− Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng đơn giản, giúp đoán nhận cấu trúc chất ban đầu dễ dàng hơn. − Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dương tùy theo cấu trúc hợp chất khảo sát. − Khác nhau Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI): − Ion hình thành trong pha lỏng − Phân tích chất không khó bay hơi, nhiệt độ bay hơi cao. − Có thể tạo sự phân mảnh ít hơn APCI − Phân tích các chất phân cực nhiều − Các chất có khối lượng phân tử lớn − ESI hình thành các ion có nhiều điện tích khác nhau, kỹ thuật ion hóa ESI sử dụng nhiều hơn APCI.4 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI Kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường (APCI): − Ion được hình thành ở dạng hơi − Phân tích các chất dể bay hơi.
− Có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn ESI − Phân tích các chất phân cực kém − Phân tích các chất có khối lượng phân tử nhỏ Hình 1.5 Sự ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI) 13 Về nguyên tắc của APCI và ESI có thể thấy: APCI: Phân tử phân tích và dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử bay hơi được khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện. Hiện tượng ion hóa xảy ra: Cơ chế hình thành ion dương: N2 + e- → N2+ + 2e- H2O + e- → H2O+ +2e- H2O + H2O+ → H3O+ + OH. (phản ứng ion – phân tử) M + H3O+ → MH+ + H2O (phản ứng ion – phân tử) Cơ chế tạo ion âm: Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion: OH. + M → (M - H)- + H2O ESI: Các chất phân tích và dung môi ra khỏi cột sắc ký tới đầu vào LC/MS được đưa vào ống mao quản bằng kim loại có đường kính rất nhỏ và với áp suất của khí N2 hình thành chùm tia dạng sương.
Dưới tác dụng của dòng điện cao thế, những giọt sương mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Sau đó dung môi bốc hơi bởi dòng khí N2 thổi ngược dòng. Các hạt mang điện có kích thước nhỏ dần và do lực đẩy giữa các điện tích cùng dấu, chúng vỡ ra thành những ion mang điện tích dương hoặc âm. Sau đó các ion này được đưa vào bộ phận đưa ion qua một bộ phận rất nhỏ để đi vào tứ cực thứ nhất Q1.
Dung môi được bơm hút ra ngoài. Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm thì tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo sát.3 Các loại đầu dò khối phổ Hiện nay, có các kiểu đầu dò khối phổ đang được sử dụng: • Đầu dò khối phổ kiểu bẫy ion tứ cực tuyến tính (Linear quadrupole ion trap: LIT) • Cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Fourier-transform mass spectrometry hay Fourier-transform ion cyclotron resonance, FTMS) 14 • Đầu dò khối phổ phân tích thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) • Đầu dò khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole: QQQ) Kiểu đầu dò LIT và QQQ được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm độ nhạy cao, có tính chọn lọc và ứng dụng rộng rãi nên được sử dụng nhiều. Tùy mục đích sử dụng người ta lựa chọn thiết bị phù hợp. Các bộ phân tích khối thường được sử dụng để xác định kháng sinh hiện nay là Linear quadrupole ion trap (LIT), Triple Quadrupole (QQQ) (một cải tiến của Quadrupole) và Q-TOF (một cải tiến của TOF).6 Cấu tạo của đầu dò khối phổ Triple quadrupole QQQ Thành phần phân tích khối QQQ là sự kết nối giữa ba tứ cực.
Trong đó, Q1 dùng để lọc các ion chính có thông số m/z cần nghiên cứu (trong đó m: khối lượng phân tử, z: số điện tích). Q2 là nơi phân mãnh của các ion, khí trơ Ar hay N2 sẽ va chạm với các mảnh ion mẹ tạo ra các ion con và được đưa vào Q3 phân tích những mảnh ion con cần quan tâm.4 Các kỹ thuật ghi phổ Hiện nay, có 4 kiểu ghi phổ được dùng phồ biến: Selected Ion Monitoring (SIM), Full Scan, MRM (Multiple Reaction Monitoring) và SRM (Selected Reaction Monitoring) [19]. Selected Ion Monitoring (SIM) Chế độ SIM, đầu dò MS chọn chính xác một mảnh đặc trưng cho chất cần khảo sát. Ví dụ trong khoảng khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ chọn riêng m/z 150 ra để định lượng.
Full scan Ở kĩ thuật này, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Ví dụ: chọn chế độ scan m/z 50 - 300 có nghĩa là quét tất cả các khối từ 50 - 300. Để tìm ion mẹ người ta chọn chế độ SCAN quét các ion trong vùng khảo sát để tìm ra ion mẹ.
Trong khối phổ ba tứ cực (MS/MS), 2 kỹ thuật thường được sử dụng phổ biến là MRM và SRM. MRM: Kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM bởi do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con mục tiêu thường từ hai trở lên.
