Xây Dựng Phương Pháp LC-MS/MS Ứng Dụng Xác Định Họ Sulfonamide Trong Thủy Sản

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Xây dựng phương pháp lc msms ứng dụng xác định họ sulfonamide trong thủy sản, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bạch Yến
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Trọng
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp LC-MS/MS Ứng Dụng Xác Định Họ Sulfonamide Trong Thủy Sản
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kháng sinh
• 1.1.1. Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc
• 1.2. Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide
• 1.2.1. Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs
• 1.2.2. Phân loại thuốc SAs
• 1.2.3. Các tác dụng phụ của SAs
• 1.2.4. Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs
• 1.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ
• 1.3.1. Các loại đầu dò khối phổ
• 1.3.2. Các kỹ thuật ghi phổ
• 1.4. Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố
• 1.4.1. Một số kết quả nghiên cứu phương pháp xác định kháng sinh họ Sulfonamide trong và ngoài nước
• 1.4.2. Ưu và hạn chế của các nghiên cứu đã công bố
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất – chất chuẩn
• 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn
• 2.2. Nội dung thực hiện
• 2.2.1. Chuẩn bị hóa chất, pha động, dung dịch chuẩn
• 2.2.2. Chuẩn bị mẫu khảo sát
• 2.3. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm
• 2.3.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
• 2.3.2. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
• 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích họ Sulfonamide trong thủy sản
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thực nghiệm
• 3.1.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
• 3.1.2. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
• 3.2. Thẩm định phương pháp
• 3.2.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 3.2.2. Ảnh hưởng của nền mẫu (ME)
• 3.2.3. Xác định MDL, MQL của phương pháp
• 3.2.4. Hiệu suất thu hồi, độ lặp, độ tái lập
• 3.2.5. Độ không đảm bảo đo
• 3.3. Ứng dụng phân tích họ Sulfonamide trong nền mẫu thủy sản
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp LC MS MS xác định họ Sulfonamide trong thủy sản

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là trong ngành thủy sản. Họ Sulfonamide là một nhóm kháng sinh phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản. Việc phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất này là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm và đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế.

1.1. Khái niệm về họ Sulfonamide và ứng dụng trong thủy sản

Họ Sulfonamide bao gồm nhiều loại kháng sinh khác nhau, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng trong động vật. Việc sử dụng chúng trong nuôi trồng thủy sản có thể dẫn đến dư lượng trong sản phẩm cuối cùng, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

1.2. Tại sao cần xác định họ Sulfonamide trong thủy sản

Dư lượng kháng sinh trong thủy sản có thể gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho người tiêu dùng. Việc xác định chính xác hàm lượng Sulfonamide giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và đáp ứng các quy định về dư lượng tối đa cho phép.

II. Thách thức trong việc xác định họ Sulfonamide trong thủy sản

Việc xác định họ Sulfonamide trong thủy sản gặp nhiều thách thức do sự đa dạng của các hợp chất và sự phức tạp trong mẫu. Các yếu tố như nền mẫu, phương pháp chiết xuất và điều kiện phân tích đều ảnh hưởng đến kết quả. Do đó, cần có các phương pháp phân tích chính xác và đáng tin cậy.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Nền mẫu thủy sản có thể chứa nhiều hợp chất khác nhau, làm ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích. Việc tối ưu hóa các điều kiện phân tích là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

2.2. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và xử lý

Việc thu thập mẫu từ các nguồn khác nhau có thể dẫn đến sự biến đổi trong hàm lượng Sulfonamide. Hơn nữa, quy trình xử lý mẫu cũng cần được chuẩn hóa để đảm bảo tính nhất quán trong kết quả.

III. Phương pháp LC MS MS trong xác định họ Sulfonamide

Phương pháp LC-MS/MS đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định họ Sulfonamide trong thủy sản. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất với độ nhạy cao.

3.1. Nguyên lý hoạt động của LC MS MS

LC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ, cho phép phân tách và xác định các hợp chất trong mẫu một cách hiệu quả. Nguyên lý này giúp tăng cường độ nhạy và độ chính xác trong phân tích.

3.2. Quy trình phân tích mẫu bằng LC MS MS

Quy trình phân tích bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chiết xuất và phân tích bằng LC-MS/MS. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp LC MS MS trong nghiên cứu

Phương pháp LC-MS/MS đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để xác định hàm lượng Sulfonamide trong thủy sản. Kết quả từ các nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về tình trạng dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản.

4.1. Kết quả nghiên cứu từ các mẫu thực tế

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều mẫu thủy sản có hàm lượng Sulfonamide vượt quá giới hạn cho phép. Điều này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ dư lượng kháng sinh trong ngành thủy sản.

4.2. Tác động của kết quả nghiên cứu đến ngành thủy sản

Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm mà còn thúc đẩy các biện pháp kiểm soát chất lượng trong ngành thủy sản, từ đó cải thiện giá trị xuất khẩu.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về phương pháp LC-MS/MS trong xác định họ Sulfonamide trong thủy sản đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc kiểm soát chất lượng thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều cải tiến trong công nghệ phân tích và quản lý an toàn thực phẩm.

5.1. Tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu

Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích mới sẽ giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong việc xác định dư lượng kháng sinh trong thủy sản.

5.2. Hướng đi mới cho ngành thủy sản

Ngành thủy sản cần áp dụng các công nghệ phân tích hiện đại để đảm bảo an toàn thực phẩm và đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế, từ đó nâng cao giá trị xuất khẩu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thủy sản đóng vai trò là ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam với kim ngạch xuất khẩu đạt hàng tỷ USD mỗi năm. Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đang tạo ra rào cản kỹ thuật nghiêm trọng tại các thị trường nhập khẩu khó tính. Theo các báo cáo khoa học môi trường, khoảng 50% đến 90% lượng kháng sinh hấp thụ không hoàn toàn ở động vật thủy sản sẽ bị đào thải trực tiếp ra môi trường nước, dẫn đến hiện tượng tích tụ sinh học và hình thành các chủng vi khuẩn kháng thuốc nguy hiểm. Sulfonamide là nhóm kháng sinh tổng hợp phổ biến với giá thành rẻ, thường xuyên được phát hiện ở nồng độ từ 68 ng/kg đến 6000 ng/kg trong nước thải và môi trường nuôi trồng tại một số địa phương.

Nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, Quy định Liên minh Châu Âu (EU) Số 37/2010, Ủy ban Tiêu chuẩn Thực phẩm Quốc tế Codex và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đều thiết lập mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL) cho tổng hàm lượng nhóm Sulfonamide là 100 µg/kg. Tại Việt Nam, Thông tư số 15/2009/TT-BNN và Văn bản hợp nhất số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25/02/2014 cũng quy định ngưỡng giới hạn 100 ppb trong thủy sản. Mặc dù vậy, hệ thống Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) hiện hành vẫn chưa có quy trình phân tích đồng thời đa hoạt chất họ Sulfonamide bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS).

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Hóa phân tích thực hiện mục tiêu xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình phân tích đồng thời 19 hoạt chất kháng sinh họ Sulfonamide trên ba nền mẫu thủy sản chủ lực: tôm, cá chẽm và cá tra. Đề tài được triển khai thực nghiệm từ tháng 03/2022 đến tháng 09/2022 tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh (CASE). Kết quả nghiên cứu cung cấp một công cụ kiểm nghiệm có độ nhạy vượt trội, giúp các cơ quan quản lý và doanh nghiệp kiểm soát dư lượng kháng sinh ở mức vết (dưới 10 µg/kg), gia tăng năng lực cạnh tranh và thúc đẩy xuất khẩu bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết sắc ký phân bố pha đảo (Reversed-Phase Liquid Chromatography) kết hợp kỹ thuật ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization - ESI) và nguyên lý phân tích khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole - QQQ). Kháng sinh Sulfonamide (SAs) là các dẫn xuất của p-aminobenzenesulfonamide, có đặc tính lưỡng tính với giá trị pKa1 dao động khoảng 1,5 đến 2,5 và pKa2 từ 5,0 đến 8,0. Cấu trúc hóa học của nhóm chứa dị vòng thơm phân cực trung bình, cho phép lưu giữ hiệu quả trên các pha tĩnh alkyl liên kết như silica biến tính C18.

Trong khối phổ MS/MS, kỹ thuật ghi phổ giám sát đa phản ứng (MRM) ở chế độ ion dương ESI(+) được áp dụng để định lượng và định danh. Tứ cực thứ nhất (Q1) cô lập ion tiền thân [M+H]+, buồng va chạm (Q2) kích hoạt sự phân mảnh bằng khí trơ N2 hoặc Ar, và tứ cực thứ ba (Q3) phân tách hai ion sản phẩm đặc trưng nhất (một ion định lượng và một ion định tính). Để đánh giá độ tin cậy của phép đo vi lượng, nghiên cứu áp dụng mô hình toán học về hiệu ứng nền (Matrix Effect - %ME) và lý thuyết độ không đảm bảo đo mở rộng (Expanded Measurement Uncertainty - Ue) theo tài liệu hướng dẫn quốc tế EURACHEM / CITAC.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và mẫu phân tích: Mẫu thực nghiệm bao gồm mẫu tôm thẻ/tôm sú, cá chẽm và cá tra tươi sống thu thập ngẫu nhiên tại các chợ dân sinh và siêu thị trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2022. Mẫu trắng kiểm chứng được kiểm tra lặp lại 6 lần để khẳng định không có tín hiệu nền tại thời gian lưu của 19 chất chuẩn. Mẫu thêm chuẩn được chuẩn bị ở 5 mức nồng độ: 10, 30, 50, 75 và 100 µg/kg.
• Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu: Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng trên 3 đối tượng thủy sản phổ biến. Cỡ mẫu thẩm định độ lặp lại và độ tái lập bao gồm n = 6 và n = 12 lần lặp độc lập cho mỗi mức nồng độ, đảm bảo đáp ứng đầy đủ yêu cầu thống kê phân tích vi lượng.
• Quy trình xử lý mẫu tối ưu: Kỹ thuật QuEChERS cải tiến kết hợp chiết phân tán pha rắn (dSPE) được lựa chọn nhờ khả năng rút ngắn thời gian xử lý và giảm tiêu hao dung môi. Mẫu 5,00 g được đồng hóa, chiết bằng 10 mL Acetonitrile chứa 1% acid acetic, tách pha bằng hỗn hợp muối 2 g MgSO4 và 0,5 g NaCl. Dịch chiết sau đó được làm sạch qua hỗn hợp hấp phụ dSPE chứa 150 mg MgSO4, 50 mg C18 và 50 mg PSA, lọc qua màng PTFE 0,22 µm trước khi tiêm vào hệ thống LC-MS/MS.
• Thiết bị và điều kiện phân tích: Hệ thống Thermo Vanquish UPLC ghép nối đầu dò Thermo TSQ-Quantiva. Cột phân tích được lựa chọn là GL Inert Sustain C18 (kích thước 2,1 x 100 mm, cỡ hạt 3 µm), vận hành với chương trình rửa giải gradient giữa pha động A (H2O + 0,1% HCOOH) và pha động B (MeOH + 0,1% HCOOH) ở tốc độ dòng 0,300 mL/phút.
• Lý do lựa chọn phương pháp: Kỹ thuật UPLC-MS/MS vượt trội hoàn toàn so với HPLC-UV hay HPLC-DAD về độ chọn lọc, loại trừ triệt để các pic nhiễu từ protein và lipid trong thịt thủy sản, đồng thời xác nhận chính xác các đồng phân cấu tạo như Sulfisoxazole và Sulfamoxole (cùng công thức C11H13N3O3S) trong một lần tiêm mẫu duy nhất kéo dài 15 phút.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thẩm định phương pháp được thực hiện nghiêm ngặt theo hướng dẫn SANTE/11813/2017 và các tiêu chí chấp nhận của AOAC 2016, mang lại các kết quả định lượng nổi bật:

1. Khoảng tuyến tính và độ chọn lọc: Tất cả 19 hoạt chất Sulfonamide và chất nội chuẩn Sulfamethoxazole-d4 đều đạt hệ số tương quan tuyến tính R² ≥ 0,990 trong dải nồng độ từ 10 µg/kg đến 100 µg/kg trên cả 3 nền mẫu. Mẫu trắng không xuất hiện pic nhiễu (tín hiệu tạp chất < 20% so với pic chuẩn ở nồng độ MQL), khẳng định độ chọn lọc tuyệt đối.
2. Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL):
   • Nền cá chẽm: MDL đạt từ 0,83 µg/kg đến 2,79 µg/kg; MQL đạt từ 1,76 µg/kg đến 9,30 µg/kg.
   • Nền cá tra: MDL đạt từ 0,87 µg/kg đến 2,45 µg/kg; MQL đạt từ 2,89 µg/kg đến 8,16 µg/kg.
   • Nền tôm: MDL đạt từ 0,88 µg/kg đến 2,16 µg/kg; MQL đạt từ 2,94 µg/kg đến 7,19 µg/kg. Các giá trị MQL này thấp hơn từ 10 đến 34 lần so với ngưỡng giới hạn cho phép MRL 100 µg/kg của Bộ Nông nghiệp & PTNT và EU.
3. Độ thu hồi và độ chụm:
   • Độ thu hồi trong ngày trên nền cá chẽm đạt 89,1% đến 105,1% (RSD từ 2,64% đến 12,34%).
   • Trên nền cá tra, độ thu hồi dao động từ 92,1% đến 105,9% (RSD từ 2,66% đến 9,18%).
   • Trên nền tôm, độ thu hồi đạt từ 84,7% đến 105,8% (RSD từ 2,32% đến 9,48%). Độ tái lập giữa các ngày và giữa các kiểm nghiệm viên đều có độ lệch chuẩn tương đối (RSDR) dưới 15%, nằm trong giới hạn cho phép của AOAC đối với phân tích hàm lượng vi lượng ở mức ppb.
4. Phát hiện trên mẫu thị trường thực tế: Phân tích các mẫu ngẫu nhiên mua tại các chợ truyền thống trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện 4 mẫu tôm có chứa dư lượng Sulfamethoxazole với hàm lượng nằm trong dải phát hiện của phương pháp.

Thảo luận kết quả

Khi khảo sát các loại cột phân tích sắc ký pha đảo, cột GL Inert Sustain C18 (2,1 x 100 mm, 3 µm) cho hình dạng pic sắc nét, độ đối xứng cao và khả năng tách các cặp đồng phân phân cực tốt hơn đáng kể so với cột Alltech Apollo C8 và Agilent Zorbax XDB-C18. Sự vượt trội này có thể được minh họa trực quan qua biểu đồ so sánh diện tích pic và số đĩa lý thuyết giữa 3 dòng cột, cho thấy diện tích đáp ứng của các hoạt chất trên cột Inert Sustain C18 cao hơn khoảng 15% đến 28%.

Dữ liệu khảo sát hiệu ứng nền (%ME) cho thấy mẫu tôm và cá tra có hiện tượng triệt tiêu ion nhẹ ở nguồn ESI đối với các chất rửa giải sớm như Sulfanilamide và Sulfaguanidine (giá trị |ME| từ 12% đến 26%). Việc sử dụng dung môi chiết Acetonitrile chứa 1% acid acetic kết hợp chất hấp phụ PSA/C18 đã loại bỏ triệt để acid béo chưa bão hòa và phospholipid. Đồng thời, việc bổ sung nội chuẩn đồng vị Sulfamethoxazole-d4 và xây dựng đường chuẩn trên chính nền mẫu (matrix-matched calibration) đã bù trừ hoàn toàn sai số do ion hóa.

So với các công bố quốc tế trước đây như nghiên cứu của Stamatia Charitonos (2016) trên tôm có LOQ lên tới 50 µg/kg chỉ cho 5 hoạt chất, hoặc nghiên cứu của Ovokeroye A. Abafe (2020) tại Nam Phi có LOQ từ 116,8 µg/kg đến 126,5 µg/kg, phương pháp trong luận văn này thể hiện độ nhạy cao hơn gấp nhiều lần, dải quét rộng hơn (19 chất) và quy trình xử lý mẫu nhanh gọn, tiết kiệm hơn 40% chi phí hóa chất độc hại.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng thực nghiệm thu được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp mang tính hành động cao:

1. Chuẩn hóa quy trình phân tích tại các phòng thử nghiệm: Đề nghị các phòng kiểm nghiệm thực phẩm trên toàn quốc áp dụng quy trình chiết QuEChERS - LC-MS/MS đã được thẩm định trong đề tài này để thay thế các phương pháp cũ. Mục tiêu kỹ thuật là rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 45 phút/mẫu và tiết kiệm 50% lượng dung môi hữu cơ. Trung tâm CASE và các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025 nên triển khai mở rộng áp dụng ngay từ đầu năm 2023.
2. Xây dựng Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN): Kiến nghị Bộ Khoa học và Công nghệ phối hợp cùng Bộ Y tế và Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành TCVN mới về "Xác định đồng thời 19 kháng sinh nhóm Sulfonamide trong thủy sản bằng LC-MS/MS". Thời gian hoàn thiện dự thảo quy chuẩn kỹ thuật dự kiến từ 12 đến 18 tháng, tạo hành lang pháp lý đồng bộ với tiêu chuẩn EU số 37/2010.
3. Tăng cường kiểm soát chuỗi cung ứng kháng sinh thủy sản: Các Chi cục Thủy sản và cơ quan Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản cần đẩy mạnh thanh tra định kỳ các cơ sở nuôi tôm, cá tra. Target metric là giảm tỷ lệ mẫu thủy sản nhiễm dư lượng kháng sinh vượt ngưỡng MRL xuống dưới 1% trên toàn quốc trong giai đoạn 2023–2025 thông qua việc bắt buộc tuân thủ thời gian ngừng thuốc tối thiểu từ 14 đến 21 ngày trước thu hoạch.
4. Mở rộng chương trình giám sát dư lượng tại chợ đầu mối: Sở Nông nghiệp và PTNT các tỉnh, thành phố trọng điểm cần thiết lập mạng lưới lấy mẫu giám sát chủ động với quy mô tối thiểu 500 mẫu thủy sản mỗi năm tại các chợ đầu mối và cảng cá. Kết quả phân tích phải được công khai định kỳ nhằm nâng cao nhận thức của thương lái và người tiêu dùng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu nghiên cứu này mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Kiểm nghiệm viên và chuyên viên phân tích hóa học: Hưởng lợi từ các thông số cài đặt thiết bị chi tiết (năng lượng va chạm CE, điện thế phân mảnh, điều kiện gradient dung môi) và hướng dẫn chuẩn bị chất chuẩn, giúp thiết lập và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp LC-MS/MS tại phòng thí nghiệm nhanh chóng mà không cần tốn thời gian tối ưu hóa lại từ đầu.
2. Cán bộ quản lý chất lượng (QA/QC) tại doanh nghiệp chế biến thủy sản: Sử dụng quy trình để kiểm soát nguyên liệu đầu vào từ các vùng nuôi tôm, cá tra xuất khẩu, đảm bảo lô hàng đáp ứng ngưỡng MRL 100 µg/kg theo yêu cầu khắt khe của các thị trường Hoa Kỳ, Nhật Bản và Liên minh Châu Âu.
3. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và thanh tra nông nghiệp: Nắm bắt thực trạng ô nhiễm vi lượng Sulfonamide trên thị trường nội địa, từ đó làm căn cứ khoa học để hoàn thiện hệ thống văn bản quy phạm pháp luật và kế hoạch giám sát quốc gia về kháng sinh.
4. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học/Công nghệ thực phẩm: Làm tài liệu tham khảo chất lượng cao về kỹ thuật xử lý mẫu QuEChERS, lý thuyết khối phổ tandem (MS/MS) và phương pháp đánh giá độ không đảm bảo đo theo chuẩn quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần kiểm soát đồng thời 19 hoạt chất Sulfonamide thay vì kiểm tra đơn lẻ?

Trong thực tế chăn nuôi thủy sản, người nuôi thường sử dụng các chế phẩm kháng sinh phối trộn nhiều hoạt chất hoặc thay đổi luân phiên giữa các dẫn xuất như Sulfamethoxazole, Sulfadimidine, Sulfadiazine để tăng hiệu quả diệt khuẩn. Quy định quốc tế như EU Số 37/2010 áp dụng mức MRL 100 µg/kg cho tổng dư lượng của tất cả các chất họ Sulfonamide, do đó phương pháp phân tích đồng thời 19 hoạt chất là bắt buộc để tránh bỏ lọt vi phạm.

2. Phương pháp QuEChERS kết hợp dSPE có ưu điểm gì so với phương pháp chiết pha rắn (SPE) truyền thống?

Phương pháp QuEChERS cải tiến sử dụng dung môi Acetonitrile kết hợp chất làm sạch dSPE (150 mg MgSO4, 50 mg C18, 50 mg PSA) giúp rút ngắn thời gian xử lý từ 3 giờ xuống còn dưới 45 phút mỗi mẻ mẫu. Lượng dung môi độc hại giảm hơn 50%, loại bỏ hiệu quả chất béo và protein phức tạp trong tôm, cá, đạt độ thu hồi cao ổn định từ 84,7% đến 105,9%.

3. Giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp này có đáp ứng được yêu cầu xuất khẩu không?

Hoàn toàn đáp ứng vượt trội. MQL của 19 hoạt chất trong nghiên cứu đạt từ 1,76 µg/kg đến 9,30 µg/kg trên cả ba nền mẫu cá chẽm, cá tra và tôm. Mức này thấp hơn từ 10 đến 50 lần so với ngưỡng MRL 100 µg/kg do EU, FDA và Codex quy định, đảm bảo phát hiện chính xác dư lượng kháng sinh ở mức vết phục vụ thông quan xuất khẩu.

4. Hiệu ứng nền mẫu (Matrix Effect) được xử lý triệt để bằng cách nào trong nghiên cứu?

Nghiên cứu đã áp dụng đồng thời ba giải pháp kỹ thuật: tối ưu hóa tỷ lệ chất làm sạch PSA và C18 trong dSPE để giữ lại tạp chất phân cực và lipid; sử dụng chất nội chuẩn đồng vị Sulfamethoxazole-d4 ở nồng độ 50 µg/kg để chuẩn hóa diện tích pic; và xây dựng đường chuẩn trên chính nền mẫu trắng sau chiết, đưa sai số do triệt tiêu ion về dưới 15%.

5. Kết quả phân tích mẫu thủy sản ngẫu nhiên tại Thành phố Hồ Chí Minh cảnh báo điều gì?

Phương pháp đã phát hiện 4 mẫu tôm tươi mua tại các chợ dân sinh có chứa hoạt chất Sulfamethoxazole. Điều này chứng minh kháng sinh vẫn đang được sử dụng trong chuỗi cung ứng thủy sản nội địa và người nuôi có thể chưa tuân thủ đúng thời gian ngừng thuốc trước khi thu hoạch, đòi hỏi công tác thanh kiểm tra cần được siết chặt hơn.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình phân tích UPLC-MS/MS: Định lượng đồng thời 19 hoạt chất kháng sinh họ Sulfonamide trên 3 nền mẫu thủy sản (tôm, cá chẽm, cá tra) với thời gian phân tích chỉ 15 phút mỗi mẫu.
• Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu nhanh: Ứng dụng kỹ thuật QuEChERS và dSPE giúp tiết kiệm hơn 50% dung môi, loại bỏ triệt để nhiễu nền và đạt độ thu hồi cao từ 84,7% đến 105,9%.
• Độ nhạy và độ tin cậy vượt chuẩn: Giới hạn phát hiện MDL đạt 0,83 – 2,79 µg/kg và MQL đạt 1,76 – 9,30 µg/kg, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn khắt khe của SANTE/11813/2017 và AOAC 2016.
• Phát hiện thực trạng dư lượng trên thị trường: Ghi nhận 4 mẫu tôm nhiễm Sulfamethoxazole tại các chợ truyền thống ở Thành phố Hồ Chí Minh, cung cấp bằng chứng thực tiễn quan trọng cho công tác quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm.
• Khả năng chuyển giao và ứng dụng thực tiễn: Phương pháp sẵn sàng để triển khai ngay tại các trung tâm kiểm nghiệm ISO/IEC 17025 và làm tiền đề cho việc xây dựng Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) trong giai đoạn 2023–2025.

Các doanh nghiệp chế biến xuất khẩu thủy sản và đơn vị kiểm nghiệm quan tâm đến việc nâng cao năng lực phân tích dư lượng kháng sinh được khuyến khích liên hệ, tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật nhằm bảo đảm an toàn thực phẩm và thúc đẩy xuất khẩu thủy sản Việt Nam vươn xa trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh 1.1 Khái niệm Kháng sinh là những chất có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp [10].2 Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc 1.1 Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên Là những kháng sinh hoàn toàn do vi sinh vật tổng hợp (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn.2 Kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp Là những kháng sinh có phần cấu trúc cơ bản do vi sinh vật tổng hợp, sau đó được gắn thêm các nhóm hóa chức bằng phương pháp hóa học.3 Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hóa học Là những kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học. Ví dụ: Nhóm Sulfonamide (SAs).2 Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide Năm 1932, Domard (Đức) đã tìm ra Sulfonamide [11]. Kháng sinh Sulfonamide thường được nhận diện với tiếp đầu ngữ Sulf trong tên hoạt chất: Sulfadoxine, Sulfadiazine, Sulfamoxole, Sulfamethoxazole, Sulfaquinoxaline. - Sulfonamide thuộc họ kháng khuẩn được sử dụng phổ biến trong thú y do hiệu quả trong điều trị và giá thành thấp.

- Có dạng bột tinh thể của acid yếu, ít tan trong nước và môi trường acid yếu, tan tốt ở pH = 9. Tức là chúng có khuynh hướng kết tinh môi trường pH acid của nước tiểu. - Tính hòa tan của hỗn hợp nhiều Sulfonamide cũng có hiệu quả trị liệu tốt hơn.1 Giới thiệu 19 hoạt chất họ Sulfonamide Stt Hoạt chất Công thức hoá học CAS M (g/mol) 1 Sulfanilamide C6H8N2O2S 63-74-1 172.3 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs Hình 1.1 Công thức chung của nhóm Sulfonamide 7 Sulfanilamide Sulfacetamide Sulfachloropyridazine Sulfadimethoxine Sulfadoxin Sulfadiazine Sulfaguanidin Sulfisoxazol Sulfamonomethoxin Sulfamethoxypyridazin Sulfamerazin Sulfadimidine Sulfamethoxazole Sulfamoxol Sulfamethizole Sulfanitran Sulfapyridin Sulfaquinoxaline 8 Sulfathiazol Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs [12]. Trong 19 hợp chất Sulfonamide ta thấy Sulfisoxazole và Sulfamoxole là hai đồng phân cấu tạo của nhau có cùng công thức phân tử C11H13N3O3S và tương tự Sulfamonomethoxine và Sulfamethoxypyridazine cũng là hai đồng phân cấu tạo của nhau có công thức C11H12N4O3S.4 Phân loại thuốc SAs Các Sulfonamide kháng khuẩn và các chất chuyển hóa của chúng được coi là chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy.

Theo thời gian tác dụng và thời gian bán hủy, các Sulfonamide uống có thể hấp thụ được có thể được chia ra gồm: - Sulfonamide tác dụng ngắn (3-8 giờ): Sulfadiazine, Sulfamethoxazol, Sulfisoxazol. - Các Sulfonamide tác dụng trung gian (8-18 giờ): Sulfaguanidine, Salazosulfapyridin. - Sulfonamde tác dụng kéo dài (> 35 giờ): Sulfadoxine 1.5 Các tác dụng phụ của SAs Triệu chứng phổ biến: Phát ban da, ngứa [13]. 9 Các triệu chứng ít gặp: Da nhợt nhạt, đau các khớp và cơ, đỏ, phồng rộp, bong tróc da hoặc lỏng lẻo, khó nuốt, mệt mỏi hoặc suy nhược bất thường, chảy máu hoặc bầm tím bất thường, đau họng và sốt, mắt hoặc da vàng.

Ngoài ra, các triệu chứng hiếm sau mà người bệnh có thể gặp: Co thắt và đau bụng nghiêm trọng, tiêu chảy nhiều nước và nặng, cũng có thể có máu, cơn khát tăng dần, thay đổi tâm trạng hoặc tinh thần, xuất hiện máu trong nước tiểu, đau lưng dưới, đau hoặc rát khi đi tiểu, sưng phần trước của cổ.6 Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs SAs có thể gây ra các vấn đề liên quan đến máu, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao hơn, chảy máu nướu, vết thương chậm lành. Thuốc có thể làm da nhạy cảm với ánh nắng bất thường, gây phát ban da, đỏ, ngứa, cháy nắng nghiêm trọng hoặc đổi màu da. Thuốc cũng có thể khiến một số người bị chóng mặt [14].7 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ 1.1 Nguyên lý chung Phân tích sắc ký (Chromatography): Kỹ thuật tách riêng các hợp chất đã được Tsvett (1906) sử dụng để tách riêng các chất màu trong cây cỏ. Từ ngữ “Chromatography” xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu [15].

LC-MS/MS là hệ thống được kết hợp giữa LC với đầu dò MS, trong đó LC có nhiệm vụ tách chất phân tích (thực hiện bởi cột sắc ký). MS có nhiệm vụ phân tích khối phổ dựa vào giá trị (m/z), là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích [16].3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ [17] Chất phân tích khi vào bộ phận MS được ion hoá bằng các phương pháp khác nhau. Các ion được hình thành đi vào bộ phận đo khối phổ. Do công thức hóa học các chất khác nhau hình thành các ion mang điện tích dương hoặc âm khác nhau, ta chọn kiểu quét âm hoặc dương.2 Các nguồn ion hóa Có ba kiểu hình thành ion trong LC-MS/MS [18]: - Ion hóa phun điện tử (ESI, electrospray ionization) là một kỹ thuật ion hóa chính của LC-MS/MS.

- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, atmospheric pressure chemical ionization). - Ion hóa sử dụng photon tại áp suất khí quyển (APPI, atmospheric pressure photoionization). 11 Kỹ thuật ESI được sử dụng nhiều nhất, APCI sử dụng ít hơn và trong nghiên cứu đề tài chúng tôi sử dụng phân tích các chất bằng kỹ thuật ESI. Khi so sánh 2 kỹ thuật ion hóa APCI và ESI có thể thấy: • Giống nhau − Đều thuộc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều trường hợp còn thấy được phân tử ban đầu.

− Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng đơn giản, giúp đoán nhận cấu trúc chất ban đầu dễ dàng hơn. − Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dương tùy theo cấu trúc hợp chất khảo sát. − Khác nhau Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI): − Ion hình thành trong pha lỏng − Phân tích chất không khó bay hơi, nhiệt độ bay hơi cao. − Có thể tạo sự phân mảnh ít hơn APCI − Phân tích các chất phân cực nhiều − Các chất có khối lượng phân tử lớn − ESI hình thành các ion có nhiều điện tích khác nhau, kỹ thuật ion hóa ESI sử dụng nhiều hơn APCI.4 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI Kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường (APCI): − Ion được hình thành ở dạng hơi − Phân tích các chất dể bay hơi.

− Có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn ESI − Phân tích các chất phân cực kém − Phân tích các chất có khối lượng phân tử nhỏ Hình 1.5 Sự ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI) 13 Về nguyên tắc của APCI và ESI có thể thấy: APCI: Phân tử phân tích và dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử bay hơi được khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện. Hiện tượng ion hóa xảy ra: Cơ chế hình thành ion dương: N2 + e- → N2+ + 2e- H2O + e- → H2O+ +2e- H2O + H2O+ → H3O+ + OH. (phản ứng ion – phân tử) M + H3O+ → MH+ + H2O (phản ứng ion – phân tử) Cơ chế tạo ion âm: Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion: OH. + M → (M - H)- + H2O ESI: Các chất phân tích và dung môi ra khỏi cột sắc ký tới đầu vào LC/MS được đưa vào ống mao quản bằng kim loại có đường kính rất nhỏ và với áp suất của khí N2 hình thành chùm tia dạng sương.

Dưới tác dụng của dòng điện cao thế, những giọt sương mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Sau đó dung môi bốc hơi bởi dòng khí N2 thổi ngược dòng. Các hạt mang điện có kích thước nhỏ dần và do lực đẩy giữa các điện tích cùng dấu, chúng vỡ ra thành những ion mang điện tích dương hoặc âm. Sau đó các ion này được đưa vào bộ phận đưa ion qua một bộ phận rất nhỏ để đi vào tứ cực thứ nhất Q1.

Dung môi được bơm hút ra ngoài. Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm thì tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo sát.3 Các loại đầu dò khối phổ Hiện nay, có các kiểu đầu dò khối phổ đang được sử dụng: • Đầu dò khối phổ kiểu bẫy ion tứ cực tuyến tính (Linear quadrupole ion trap: LIT) • Cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Fourier-transform mass spectrometry hay Fourier-transform ion cyclotron resonance, FTMS) 14 • Đầu dò khối phổ phân tích thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) • Đầu dò khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole: QQQ) Kiểu đầu dò LIT và QQQ được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm độ nhạy cao, có tính chọn lọc và ứng dụng rộng rãi nên được sử dụng nhiều. Tùy mục đích sử dụng người ta lựa chọn thiết bị phù hợp. Các bộ phân tích khối thường được sử dụng để xác định kháng sinh hiện nay là Linear quadrupole ion trap (LIT), Triple Quadrupole (QQQ) (một cải tiến của Quadrupole) và Q-TOF (một cải tiến của TOF).6 Cấu tạo của đầu dò khối phổ Triple quadrupole QQQ Thành phần phân tích khối QQQ là sự kết nối giữa ba tứ cực.

Trong đó, Q1 dùng để lọc các ion chính có thông số m/z cần nghiên cứu (trong đó m: khối lượng phân tử, z: số điện tích). Q2 là nơi phân mãnh của các ion, khí trơ Ar hay N2 sẽ va chạm với các mảnh ion mẹ tạo ra các ion con và được đưa vào Q3 phân tích những mảnh ion con cần quan tâm.4 Các kỹ thuật ghi phổ Hiện nay, có 4 kiểu ghi phổ được dùng phồ biến: Selected Ion Monitoring (SIM), Full Scan, MRM (Multiple Reaction Monitoring) và SRM (Selected Reaction Monitoring) [19]. Selected Ion Monitoring (SIM) Chế độ SIM, đầu dò MS chọn chính xác một mảnh đặc trưng cho chất cần khảo sát. Ví dụ trong khoảng khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ chọn riêng m/z 150 ra để định lượng.

Full scan Ở kĩ thuật này, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Ví dụ: chọn chế độ scan m/z 50 - 300 có nghĩa là quét tất cả các khối từ 50 - 300. Để tìm ion mẹ người ta chọn chế độ SCAN quét các ion trong vùng khảo sát để tìm ra ion mẹ.

Trong khối phổ ba tứ cực (MS/MS), 2 kỹ thuật thường được sử dụng phổ biến là MRM và SRM. MRM: Kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM bởi do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con mục tiêu thường từ hai trở lên.