Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây diêm mạch (Chenopodium quinoa) là loài thực vật hai lá mầm thuộc họ Rau Muối (Chenopodiaceae), có nguồn gốc lịch sử từ vùng núi Andes thuộc Nam Mỹ (Bolivia, Peru, Ecuador). Đây là loại cây lương thực có giá trị dinh dưỡng vượt trội với hàm lượng protein hạt cao (đạt khoảng 15–16,5%), cân đối các axit amin thiết yếu, giàu chất béo không bão hòa, khoáng chất (canxi, magie, sắt, phốt pho, kali) và vitamin (nhóm B, vitamin E), đồng thời hoàn toàn không chứa gluten. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, diêm mạch thể hiện khả năng thích ứng sinh thái rộng và chống chịu tốt trước các điều kiện môi trường bất thuận như khô hạn, đất nhiễm mặn và nhiệt độ thấp.
Trong cơ chế phản ứng sinh học của thực vật trước các stress ngoại cảnh (bao gồm cả bất lợi sinh học và phi sinh học), sự vận chuyển và tái phân bố đường sucrose đến các vị trí mô bị tổn thương đóng vai trò trọng yếu trong việc cung cấp năng lượng và duy trì cân bằng nội môi. Quá trình vận chuyển đường qua màng tế bào thực vật được điều hòa bởi họ protein vận chuyển đường SWEET (Sugar Will Eventually be Exported Transporter). Mặc dù họ gene SWEET đã được nghiên cứu và định danh trên nhiều đối tượng cây trồng quan trọng như lúa gạo (Oryza sativa), đậu tương (Glycine max), sắn (Manihot esculenta), lúa mì (Triticum aestivum), cải dầu (Brassica napus), chuối (Musa acuminata), vải (Litchi chinensis), ca cao (Theobroma cacao) hay lạc (Arachis hypogaea), thông tin về họ gene này trên cây diêm mạch vẫn chưa được công bố do bộ gene tham chiếu của loài mới chỉ được giải mã hoàn chỉnh trong thời gian gần đây (Jarvis et al., 2017).
Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận "Chú giải và đánh giá mức độ phiên mã của nhóm gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose trên cây diêm mạch (Chenopodium quinoa)" được thực hiện nhằm cung cấp các dẫn liệu khoa học về đặc tính cấu trúc và tiềm năng chức năng của họ gene này.
Mục tiêu tổng quát của đề tài là xác định, chú giải và phân tích đặc điểm phân tử của họ gene CqSWEET trên hệ gene diêm mạch, đồng thời đánh giá sơ bộ mức độ biểu hiện phiên mã của chúng trên các cơ quan sinh sản, làm cơ sở định hướng cho công tác chọn tạo giống diêm mạch thích ứng với biến đổi khí hậu.
Để đạt được mục tiêu nêu trên, đề tài thực hiện 05 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:
- Xác định và định danh các thành viên thuộc nhóm gene CqSWEET trong genome diêm mạch.
- Xây dựng sơ đồ hình cây (cây phát sinh loài) phân tích mối quan hệ tiến hóa của nhóm protein CqSWEET ở diêm mạch.
- Phân tích cấu trúc bậc hai, mô hình không gian bậc ba và cấu trúc xuyên màng đặc trưng của các protein CqSWEET.
- Phân tích đặc tính cấu trúc gene CqSWEET (chiều dài gDNA, kích thước CDS, tỷ lệ GC, trọng lượng phân tử và cấu trúc exon/intron).
- Khai thác và đánh giá dữ liệu biểu hiện phiên mã (RNA-Seq) của nhóm gene CqSWEET tại các cơ quan, bộ phận chính (hoa và quả) trên hai giống diêm mạch hoa trắng và hoa vàng.
Phạm vi nghiên cứu:
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 7 năm 2020 đến tháng 2 năm 2021.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ sinh học (Học viện Nông nghiệp Việt Nam), phối hợp cùng Bộ môn Sinh học phân tử (Viện Di truyền Nông nghiệp), Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp (Đại học Sư phạm Hà Nội 2) và Bộ môn Công nghệ Sinh học - Khoa Hóa và Môi trường (Đại học Thủy lợi).
- Đối tượng và phạm vi dữ liệu: Dữ liệu hệ gene (genome), hệ protein (proteome), hệ phiên mã (transcriptome) tham chiếu của giống diêm mạch C. quinoa (mã định danh accession PI614886, BioProject: PRJNA394242) cùng dữ liệu biểu hiện RNA-Seq (mã truy cập GEO: GSE139174).
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và mô hình sinh học
Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc và chức năng sinh học của họ protein vận chuyển đường SWEET ở sinh vật nhân thực. SWEET là nhóm protein vận chuyển xuyên màng trung gian, đảm nhận các chức năng thiết yếu như vận chuyển sucrose và hexose (glucose, fructose, galactose) qua màng tế bào, điều hòa dinh dưỡng hạt phấn, tiết mật hoa, tích lũy chất khô trong quá trình làm đầy hạt và điều hòa tính kháng bệnh. Về mặt cấu trúc, một đơn vị protein SWEET điển hình ở thực vật gồm 7 đoạn xoắn xuyên màng (Transmembrane helices - TM helix), được tạo thành bởi hai bó ba xoắn (triple-helix-bundle - THB) liên kết với nhau qua một vòng xoắn đảo ngược, tương ứng với miền bảo thủ đặc trưng PF03083 trên cơ sở dữ liệu Pfam.
Phương pháp nghiên cứu và công cụ tin sinh học
Nghiên cứu ứng dụng phương pháp tiếp cận tin sinh học dữ liệu lớn (in silico) kết hợp khai thác dữ liệu omics thông qua các quy trình và công cụ chuyên dụng:
-
Thu thập dữ liệu và sàng lọc tương đồng chuỗi:
- Dữ liệu trình tự protein SWEET đã công bố ở các loài đối chứng gồm lúa gạo (OsSWEET), đậu tương (GmSWEET), sắn (MeSWEET), đậu gà (CaSWEET) và lúa mì (TaSWEET) được sử dụng làm trình tự truy vấn.
- Sàng lọc trên proteome tham chiếu của diêm mạch (BioProject: PRJNA394242) trên giao diện Phytozome và NCBI bằng thuật toán BlastP (Protein-protein BLAST).
- Kiểm tra miền bảo thủ đặc trưng PF03083 bằng công cụ Pfam nhằm xác nhận các ứng viên protein SWEET thực sự.
-
Chú giải thông tin di truyền và định danh gene:
- Truy vấn trình tự protein lên cơ sở dữ liệu NCBI để trích xuất mã định danh protein (Protein Accession), mã bản phiên mã RNA, mã gene (Gene ID), vị trí locus trên nhiễm sắc thể/scaffold và trình tự vùng mã hóa (Coding DNA sequence - CDS).
-
Phân tích phát sinh loài (Phylogenetic analysis):
- Căn chỉnh đa trình tự protein bằng thuật toán ClustalW trên phần mềm MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0).
- Xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp gia nhập láng giềng (Neighbor-Joining - NJ) với giá trị lặp lại kiểm định bootstrap 1.000 lần.
-
Phân tích đặc tính cấu trúc protein:
- Dự đoán số lượng và topo các đoạn xoắn xuyên màng (TM helices) bằng mô hình Markov ẩn trên máy chủ TMHMM Server v.2.0 với ngưỡng tin cậy > 0,5.
- Dự đoán tỷ lệ cấu trúc bậc hai (chuỗi xoắn $\alpha$, phiến gấp $\beta$, TM helix, vùng cuộn ngẫu nhiên không xác định) và mô hình hóa không gian 3D cấu trúc bậc ba bằng máy chủ Phyre2.
-
Phân tích đặc tính hóa lý và cấu trúc gene:
- Phân tích độ dài trình tự CDS (bp), tỷ lệ Guanine - Cytosine (GC%) và trọng lượng phân tử lý thuyết (mW, tính bằng kDa) thông qua phần mềm BioEdit.
- Xác định kích thước DNA hệ gene (gDNA) và mô hình hóa sơ đồ cấu trúc vị trí sắp xếp exon/intron của từng gene bằng máy chủ GSDS (Gene Structure Display Server 2.0).
-
Phân tích dữ liệu biểu hiện phiên mã (In silico expression profiling):
- Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự RNA-Seq từ cơ sở dữ liệu GEO NCBI với mã định danh GSE139174, bao gồm các mẫu mô hoa và quả của hai giống diêm mạch (hoa trắng và hoa vàng).
- Chuẩn hóa mức độ biểu hiện theo chỉ số FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads), áp dụng thuật toán trung bình nhân (GEOMEAN) và biểu diễn cấu hình biểu hiện bằng biểu đồ nhiệt (heatmap) thông qua ngôn ngữ lập trình R.
Nội dung chính theo từng chương
Phần I: Mở đầu
Trình bày tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu trong bối cảnh biến đổi khí hậu và nhu cầu an ninh lương thực toàn cầu. Nhấn mạnh khoảng trống nghiên cứu về họ protein vận chuyển đường SWEET trên cây diêm mạch dù loài cây này sở hữu khả năng chống chịu stress phi sinh học nổi trội và bộ gene đã được giải trình tự. Xác lập mục đích, 05 yêu cầu nghiên cứu và hệ thống hóa các bước triển khai của đề tài.
Phần II: Tổng quan tài liệu
Tổng hợp toàn diện các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng diêm mạch và họ protein SWEET:
- Khái quát về cây diêm mạch: Nguồn gốc tiến hóa, đặc điểm phân loại học (chi Chenopodium, họ Chenopodiaceae), đặc điểm hình thái học các cơ quan (rễ cọc ăn sâu 1,2–1,5 m; thân thảo cao 1,7–2 m chứa nhiều sắc tố; phiến lá phủ tinh thể canxi oxalat chống thoát hơi nước; hoa lưỡng tính vô cánh dạng chùy; hạt đa màu sắc kích thước 1,8–2,6 mm chứa lớp saponin ngoài vỏ).
- Giá trị dinh dưỡng và kinh tế: Thống kê thành phần dưỡng chất trong 100g hạt khô so sánh với ngô, gạo, đậu và lúa mì; khẳng định ưu thế về protein không chứa gluten, khoáng chất và chất chống oxy hóa polyphenol.
- Tình hình sản xuất diêm mạch: Diễn biến sản lượng toàn cầu giai đoạn 2010–2018 (đạt đỉnh gần 200 nghìn tấn vào năm 2015) với các quốc gia dẫn đầu gồm Bolivia, Peru, Ecuador; lịch sử khảo nghiệm tại Việt Nam từ giống HV1 (năm 1986) đến các mô hình thử nghiệm tại Hà Giang, Thanh Hóa từ năm 2013–2015.
- Tổng quan họ protein SWEET: Cơ chế vận chuyển đường khuếch tán thuận hóa qua màng, cấu tạo 7 đoạn xoắn xuyên màng, vai trò sinh lý trong nốt sần cố định đạm ở cây họ đậu (MtSWEET11, LjSWEET3), quá trình làm đầy hạt ở ngũ cốc (OsSWEET4, ZmSWEET4c, SWEET11, SWEET15).
- Thống kê số lượng thành viên họ SWEET đã công bố: Cải dầu (68 BnSWEET), đậu tương (52 GmSWEET), lạc (43 AhSWEET), thực vật ký sinh vùng rễ (29 PrSWEET), sắn (28 MeSWEET), chuối (25 MaSWEET), Medicago truncatula (25 MtSWEET), óc chó (25 JrSWEET), ca cao (21 TcSWEET), đậu gà (21 CaSWEET) và vải (16 LcSWEET).
Phần III: Phạm vi, nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chi tiết hóa địa điểm, mốc thời gian thực hiện đề tài; mô tả nguồn gốc tập dữ liệu tham chiếu (Phytozome, NCBI, GEO GSE139174) và các trình tự đối chứng; thiết lập sơ đồ quy trình từng bước cho 5 nội dung thao tác tin sinh học: xác định - định danh gene, xây dựng cây phát sinh loài, phân tích cấu trúc protein (TMHMM, Phyre2), phân tích cấu trúc gene (BioEdit, GSDS) và phân tích dữ liệu RNA-Seq bằng thuật toán GEOMEAN trên nền tảng R.
Phần IV: Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả xác định họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose trên cây diêm mạch
Từ kết quả BlastP trên proteome diêm mạch và xác nhận miền bảo thủ PF03083, nghiên cứu đã định danh thành công 29 gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose, đặt tên quy chuẩn từ CqSWEET01 đến CqSWEET29 theo thứ tự sắp xếp locus trên genome. Độ tương đồng chuỗi (% xác định) dao động từ 49,34% đến 100%, trong đó 25/29 protein đạt mức xác định trên 90%.
| STT |
Tên gene |
Mã định danh bản phiên mã |
% xác định |
Mã protein NCBI |
Mã gene (Gene ID) |
Vị trí Locus |
| 1 |
CqSWEET01 |
AUR62028877-RA |
100,00% |
XP_021723039.1 |
110690498 |
LOC110690498 |
| 2 |
CqSWEET02 |
AUR62021497-RA |
100,00% |
XP_021723658.1 |
110691029 |
LOC110691029 |
| 3 |
CqSWEET03 |
AUR62013947-RA |
99,57% |
XP_021726932.1 |
110694081 |
LOC110694081 |
| 4 |
CqSWEET04 |
AUR62019341-RA |
100,00% |
XP_021729029.1 |
110696068 |
LOC110696068 |
| 5 |
CqSWEET05 |
AUR62034634-RA |
100,00% |
XP_021730927.1 |
110697836 |
LOC110697836 |
| 6 |
CqSWEET06 |
AUR62008229-RA |
100,00% |
XP_021734143.1 |
110700868 |
LOC110700868 |
| 7 |
CqSWEET07 |
AUR62034815-RA |
100,00% |
XP_021737428.1 |
110703936 |
LOC110703936 |
| 8 |
CqSWEET08 |
AUR62034816-RA |
85,20% |
XP_021737431.1 |
110703940 |
LOC110703940 |
| 9 |
CqSWEET09 |
AUR62022713-RA |
67,21% |
XP_021740123.1 |
110706483 |
LOC110706483 |
| 10 |
CqSWEET10 |
AUR62032012-RA |
100,00% |
XP_021741201.1 |
110707497 |
LOC110707497 |
| 11 |
CqSWEET11 |
AUR62005221-RA |
100,00% |
XP_021742590.1 |
110708701 |
LOC110708701 |
| 12 |
CqSWEET12 |
AUR62005295-RA |
100,00% |
XP_021742684.1 |
110708776 |
LOC110708776 |
| 13 |
CqSWEET13 |
AUR62036636-RA |
92,19% |
XP_021743963.1 |
110710007 |
LOC110710007 |
| 14 |
CqSWEET14 |
AUR62005678-RA |
100,00% |
XP_021745670.1 |
110711565 |
LOC110711565 |
| 15 |
CqSWEET15 |
AUR62004237-RA |
100,00% |
XP_021748429.1 |
110714244 |
LOC110714244 |
| 16 |
CqSWEET16 |
AUR62014003-RA |
49,34% |
XP_021748430.1 |
110714245 |
LOC110714245 |
| 17 |
CqSWEET17 |
AUR62013611-RA |
100,00% |
XP_021756228.1 |
110721400 |
LOC110721400 |
| 18 |
CqSWEET18 |
AUR62019880-RA |
99,49% |
XP_021757527.1 |
110722571 |
LOC110722571 |
| 19 |
CqSWEET19 |
AUR62019881-RA |
92,36% |
XP_021757713.1 |
110722735 |
LOC110722735 |
| 20 |
CqSWEET20 |
AUR62013480-RA |
100,00% |
XP_021760946.1 |
110725786 |
LOC110725786 |
| 21 |
CqSWEET21 |
AUR62006148-RA |
100,00% |
XP_021764612.1 |
110729202 |
LOC110729202 |
| 22 |
CqSWEET22 |
AUR62022657-RA |
80,75% |
XP_021767191.1 |
110731629 |
LOC110731629 |
| 23 |
CqSWEET23 |
AUR62007017-RA |
100,00% |
XP_021767871.1 |
110732264 |
LOC110732264 |
| 24 |
CqSWEET24 |
AUR62018089-RA |
100,00% |
XP_021770832.1 |
110735017 |
LOC110735017 |
| 25 |
CqSWEET25 |
AUR62000659-RA |
100,00% |
XP_021772751.1 |
110736758 |
LOC110736758 |
| 26 |
CqSWEET26 |
AUR62000743-RA |
100,00% |
XP_021772842.1 |
110736832 |
LOC110736832 |
| 27 |
CqSWEET27 |
AUR62019664-RA |
100,00% |
XP_021773915.1 |
110737873 |
LOC110737873 |
| 28 |
CqSWEET28 |
AUR62029550-RA |
100,00% |
XP_021775814.1 |
110739666 |
LOC110739666 |
| 29 |
CqSWEET29 |
AUR62029552-RA |
100,00% |
XP_021775815.1 |
110739667 |
LOC110739667 |
4.2. Mối quan hệ phát sinh loài của các CqSWEET ở cây diêm mạch
Cây phát sinh loài phân chia 29 protein CqSWEET thành 02 nhóm chính (nhóm I và nhóm II) với 04 phân nhóm phụ:
- Phân nhóm phụ IA (12 protein): CqSWEET01, 04, 05, 07, 08, 12, 13, 14, 21, 25, 28, 29.
- Phân nhóm phụ IB (03 protein): CqSWEET03, 20, 27.
- Phân nhóm phụ IIA (05 protein): CqSWEET06, 10, 11, 24, 26.
- Phân nhóm phụ IIB (08 protein): CqSWEET02, 09, 15, 17, 18, 19, 22, 23.
Phân tích ghi nhận 11 nút nhánh đạt chỉ số tin cậy bootstrap tuyệt đối (100%), bao gồm các cặp chị em có độ tương đồng cấu trúc cao: CqSWEET01/14, CqSWEET08/29, CqSWEET05/13, CqSWEET12/25, CqSWEET07/28, CqSWEET04/21, CqSWEET03/27, CqSWEET11/26, CqSWEET10/24, CqSWEET19/23 và CqSWEET15/17.
4.3. Cấu trúc đặc trưng của nhóm protein CqSWEET
- Cấu trúc xuyên màng (TMHMM): Đa số các protein sở hữu 7 đoạn TM helix điển hình (16/29 protein). Các dạng biến đổi số đoạn xuyên màng khác gồm có: 6 đoạn TM helix (8/29 protein: CqSWEET01, 03, 08, 11, 14, 15, 22, 29); 5 đoạn TM helix (3/29 protein: CqSWEET09, 17); 3 đoạn TM helix (1 protein: CqSWEET07); 9 đoạn TM helix (1 protein: CqSWEET27).
- Cấu trúc phân tử bậc hai và bậc ba (Phyre2): Độ tin cậy dự đoán đều đạt 100%; 19/29 protein có độ bao phủ cấu trúc trên 90% (thấp nhất là CqSWEET18 đạt 49%, CqSWEET03 đạt 53%). Chuỗi xoắn $\alpha$ chiếm ưu thế chủ đạo với tỷ lệ trung bình 75% (dao động từ 60% đến 85%); cấu trúc phiến $\beta$ chỉ xuất hiện ở 12/29 protein với tỷ lệ rất thấp (cao nhất là 12% ở CqSWEET03); thành phần TM helix trung bình chiếm 53% (từ 30% ở CqSWEET07 đến 65% ở CqSWEET09); vùng không xác định trung bình chiếm 19% (dao động 6%–43%).
4.4. Đặc tính cấu trúc gene SWEET ở cây diêm mạch
- Kích thước CDS: Dao động từ 486 bp (CqSWEET09) đến 1.287 bp (CqSWEET18), giá trị trung bình là 782 bp.
- Trọng lượng phân tử lý thuyết (mW): Dao động từ 146,736 kDa (CqSWEET09) đến 387,471 kDa (CqSWEET18), trung bình đạt 237,718 kDa.
- Tỷ lệ GC: Dao động từ 38,23% (CqSWEET18) đến 45,16% (CqSWEET17), trung bình đạt 40,94%.
- Chiều dài gDNA: Dao động từ 729 bp (CqSWEET02) đến 14.707 bp (CqSWEET03), trung bình đạt 3.460 bp.
- Cấu trúc exon/intron (GSDS): Số lượng exon dao động từ 1 (CqSWEET17) đến 9 exon (CqSWEET27). Phần lớn họ gene có 6 exon (12/29 gene: CqSWEET04, 06, 07, 08, 10, 11, 12, 15, 20, 21, 26, 28) hoặc 5 exon (8/29 gene: CqSWEET01, 02, 05, 14, 16, 18, 23, 24). Các trường hợp còn lại gồm 7 exon (3 gene: CqSWEET03, 13, 19), 4 exon (3 gene: CqSWEET02, 22, 29) và 3 exon (1 gene: CqSWEET25).
| Tên gene |
Chiều dài CDS (bp) |
Chiều dài gDNA (bp) |
Tỷ lệ GC (%) |
Trọng lượng phân tử mW (kDa) |
Số lượng Exon |
| CqSWEET01 |
741 |
1.162 |
39,14 |
224,363 |
5 |
| CqSWEET02 |
729 |
729 |
40,19 |
220,780 |
4 |
| CqSWEET03 |
1.203 |
14.707 |
38,57 |
361,804 |
7 |
| CqSWEET04 |
753 |
1.612 |
41,70 |
228,129 |
6 |
| CqSWEET05 |
960 |
2.153 |
38,44 |
289,679 |
5 |
| CqSWEET06 |
729 |
1.396 |
39,37 |
220,314 |
6 |
| CqSWEET07 |
618 |
3.290 |
42,07 |
186,838 |
6 |
| CqSWEET08 |
711 |
1.290 |
41,49 |
216,162 |
6 |
| CqSWEET09 |
486 |
1.738 |
41,98 |
146,736 |
- |
| CqSWEET10 |
738 |
4.175 |
39,57 |
223,514 |
6 |
| CqSWEET11 |
618 |
7.616 |
40,45 |
186,458 |
6 |
| CqSWEET12 |
762 |
1.852 |
39,90 |
321,108 |
6 |
| CqSWEET13 |
999 |
7.994 |
41,84 |
301,779 |
7 |
| CqSWEET14 |
741 |
1.227 |
39,95 |
224,194 |
5 |
| CqSWEET15 |
648 |
948 |
43,52 |
195,876 |
6 |
| CqSWEET16 |
567 |
1.538 |
40,39 |
170,534 |
5 |
| CqSWEET17 |
558 |
868 |
45,16 |
169,053 |
1 |
| CqSWEET18 |
1.287 |
9.666 |
38,23 |
387,471 |
5 |
| CqSWEET19 |
801 |
3.193 |
43,32 |
243,027 |
7 |
| CqSWEET20 |
783 |
3.140 |
41,63 |
237,232 |
6 |
| CqSWEET21 |
753 |
1.926 |
41,70 |
228,474 |
6 |
| CqSWEET22 |
744 |
4.125 |
41,26 |
225,177 |
4 |
| CqSWEET23 |
864 |
3.251 |
42,71 |
261,953 |
5 |
| CqSWEET24 |
738 |
4.353 |
39,84 |
223,051 |
5 |
| CqSWEET25 |
762 |
1.852 |
40,68 |
231,179 |
3 |
| CqSWEET26 |
681 |
3.306 |
39,79 |
205,282 |
6 |
| CqSWEET27 |
957 |
3.262 |
40,65 |
228,097 |
9 |
| CqSWEET28 |
930 |
3.434 |
41,29 |
281,323 |
6 |
| CqSWEET29 |
834 |
2.065 |
42,45 |
254,232 |
4 |
4.5. Sự biểu hiện phiên mã của gene CqSWEET ở hai giống diêm mạch hoa trắng và hoa vàng
Phân tích biểu hiện dựa trên giá trị FPKM từ tập dữ liệu RNA-Seq (GSE139174) cho thấy các gene CqSWEET biểu hiện đa dạng tại hoa và quả. Đáng chú ý, hai gene CqSWEET09 và CqSWEET20 thể hiện mức độ tích lũy bản phiên mã đặc thù và vượt trội tại các cơ quan sinh sản (hoa và quả) ở cả hai giống diêm mạch, gợi ý vai trò then chốt của chúng trong việc vận chuyển đường phục vụ phát triển cơ quan sinh sản và tích lũy chất khô vào hạt.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xác định và chú giải toàn diện 29 gene thuộc họ CqSWEET (CqSWEET01–CqSWEET29) trên hệ gene cây diêm mạch (Chenopodium quinoa).
- Phân loại phát sinh loài họ CqSWEET thành 2 nhóm lớn (I, II) và 4 phân nhóm phụ (IA, IB, IIA, IIB), làm rõ 11 cặp gene phân kỳ gần với chỉ số bootstrap đạt 100%.
- Thiết lập hồ sơ cấu trúc phân tử hoàn chỉnh: 16/29 protein mang 7 đoạn xoắn xuyên màng kinh điển; cấu trúc bậc hai ưu thế chuỗi xoắn $\alpha$ (trung bình 75%); 68,9% số gene (20/29 gene) duy trì cấu trúc bảo thủ chứa 5 hoặc 6 exon.
- Định vị hai gene ứng viên tiềm năng (CqSWEET09 và CqSWEET20) có mức biểu hiện chuyên biệt tại mô hoa và quả của hai giống diêm mạch hoa trắng và hoa vàng.
Đóng góp khoa học
- Đây là công trình đầu tiên thực hiện chú giải hệ thống và phân tích đặc tính cấu trúc, tiến hóa của họ gene vận chuyển đường sucrose SWEET trên cây diêm mạch tại Việt Nam.
- Cung cấp cơ sở dữ liệu trình tự chuẩn hóa (mã locus, mã protein, mã RNA, kích thước phân tử, cấu trúc exon/intron) phục vụ cho các nghiên cứu di truyền chức năng tiếp theo.
- Xác lập các dẫn liệu khoa học về tính bảo thủ phân tử của họ gene SWEET ở thực vật, hỗ trợ công tác định hướng chọn tạo giống diêm mạch có khả năng chống chịu điều kiện bất lợi và năng suất cao trong bối cảnh biến đổi khí hậu.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Các kết quả định danh, mô hình hóa cấu trúc protein và cấu trúc gene hoàn toàn dựa trên các công cụ phân tích tin sinh học (in silico) từ dữ liệu tham chiếu công cộng.
- Dữ liệu biểu hiện phiên mã mới chỉ được khai thác thứ cấp từ bộ dữ liệu RNA-Seq sẵn có (GSE139174) trên hai cơ quan hoa và quả, chưa có dữ liệu biểu hiện trên các cơ quan sinh dưỡng khác (rễ, thân, lá) cũng như trong các điều kiện xử lý stress cụ thể.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Tiến hành thẩm định mức độ biểu hiện thực tế của các gene ứng viên (đặc biệt là CqSWEET09 và CqSWEET20) bằng kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm (RT-qPCR) trên các cơ quan khác nhau của cây diêm mạch trồng tại Việt Nam.
- Thiết kế các thí nghiệm đánh giá động thái biểu hiện phiên mã của họ gene CqSWEET dưới các tác động bất lợi phi sinh học mô phỏng (hạn, mặn, nhiệt độ thấp) và bất lợi sinh học (nhiễm nấm/vi khuẩn).
- Thực hiện nhân dòng (cloning) và phân tích chức năng chuyển dịch đường thực nghiệm thông qua hệ thống biểu hiện dị thể (như tế bào nấm men khuyết dưỡng đường) để chứng minh cơ chế vận chuyển cơ chất của từng protein CqSWEET.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:
- Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học và Chọn giống cây trồng; cung cấp tài liệu mẫu về quy trình nghiên cứu tin sinh học giải mã một họ gene (genome-wide identification and characterization).
- Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp phối hợp các công cụ BlastP, Pfam, MEGA7, TMHMM, Phyre2, GSDS, BioEdit và xử lý dữ liệu biểu hiện RNA-Seq bằng thuật toán GEOMEAN trên ngôn ngữ R.
- Nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp: Bảng số liệu định danh 29 gene CqSWEET cùng thông tin về hai gene chỉ thị CqSWEET09 và CqSWEET20 là dữ liệu khởi đầu cho các đề tài phát triển chỉ thị phân tử và kỹ thuật chỉnh sửa gene cải thiện năng suất hạt diêm mạch.
Câu hỏi thường gặp
1. Khóa luận đã xác định được bao nhiêu gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose ở cây diêm mạch?
Nghiên cứu đã xác định và chú giải thành công 29 gene thuộc họ SWEET trên hệ gene diêm mạch, được đặt tên thứ tự từ CqSWEET01 đến CqSWEET29 dựa trên vị trí locus phân bố.
2. Họ protein CqSWEET ở diêm mạch được phân chia thành mấy nhóm trong cây phát sinh loài?
Dựa trên thuật toán Neighbor-Joining (kiểm định bootstrap 1.000 lần trên MEGA7), họ CqSWEET được chia thành 02 nhóm lớn (nhóm I và nhóm II) với 04 phân nhóm phụ: phân nhóm IA (12 protein), IB (3 protein), IIA (5 protein) và IIB (8 protein).
3. Đa số các protein CqSWEET có bao nhiêu đoạn xoắn xuyên màng (TM helix)?
Theo kết quả phân tích trên TMHMM Server v.2.0, phần lớn protein CqSWEET (16/29 protein) mang cấu trúc đặc trưng gồm 7 đoạn xoắn xuyên màng (TM helix). Các protein còn lại có 6 đoạn (8 protein), 5 đoạn (3 protein), 3 đoạn (1 protein: CqSWEET07) và 9 đoạn (1 protein: CqSWEET27).
4. Đặc điểm số lượng exon phổ biến trong cấu trúc gene CqSWEET là gì?
Phần lớn các gene CqSWEET có cấu trúc bảo thủ gồm 6 exon (12/29 gene) hoặc 5 exon (8/29 gene). Số lượng exon ở các gene còn lại dao động từ 1 exon (CqSWEET17) đến 9 exon (CqSWEET27).
5. Những gene CqSWEET nào được ghi nhận có mức độ biểu hiện phiên mã đặc thù cao ở hoa và quả diêm mạch?
Từ dữ liệu RNA-Seq (mã truy cập GSE139174) của hai giống diêm mạch hoa trắng và hoa vàng, hai gene CqSWEET09 và CqSWEET20 được xác định có mức độ tích lũy bản phiên mã nổi trội và đặc thù tại các cơ quan hoa và quả.
Kết luận
Khóa luận đã định danh và chú giải hoàn chỉnh 29 gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose (CqSWEET01–CqSWEET29) trên hệ gene cây diêm mạch (Chenopodium quinoa). Kết quả phân tích tin sinh học đã làm rõ cấu trúc phân tử bảo thủ của họ protein với ưu thế 7 đoạn xoắn xuyên màng, cấu trúc bậc hai chủ đạo dạng xoắn $\alpha$ và trật tự gene phổ biến gồm 5–6 exon. Dữ liệu transcriptome bước đầu chỉ ra hai gene tiềm năng CqSWEET09 và CqSWEET20 biểu hiện đặc thù tại hoa và quả, đặt nền tảng khoa học vững chắc cho các nghiên cứu thực nghiệm chức năng gene phục vụ công tác chọn tạo giống diêm mạch thích ứng với biến đổi khí hậu.
