Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus

Nghiên cứu phân lập, tinh chế hợp chất kháng khuẩn từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus), hướng tới giải pháp mới cho vi khuẩn gram âm kháng thuốc.

• Tác giả: Đặng Thị Sen
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tấn Phát
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập Và Tinh Chế Hợp Chất Có Hoạt Tính Kháng Vi Khuẩn Gram Âm Kháng Thuốc Từ Cao Chiết Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus Amarus)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về nguyên liệu
• 1.1.1. Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
• 1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
• 1.1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.1.4. Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P. amarus)
• 1.1.5. Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P. amarus)
• 1.2. Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh ở người
• 1.2.1. Vi khuẩn sinh enzym ESBL
• 1.2.2. Vi khuẩn sinh carbapenemase
• 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 1.4. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu
• 1.4.1. Phân loại cao dược liệu
• 1.4.2. Các kỹ thuật chiết dược liệu
• 1.4.3. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
• 1.4.4. Phương pháp sắc ký cột
• 1.4.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 1.4.6. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất
• 1.5. Vật liệu – phương pháp
• 1.5.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.5.2. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 1.5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.4.1. Bố trí thí nghiệm
• 1.5.4.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
• 1.5.4.3. Xác định tên khoa học của cây thuốc
• 1.5.4.4. Quy trình chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P.)
• 1.5.4.5. Khảo sát giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 1.5.4.6. Phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 1.5.4.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh
• 1.5.4.8. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột
• 1.5.4.9. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ
• 1.5.4.10. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 2. KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
• 2.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 2.2. Kết quả chiết cao dược liệu
• 2.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng (P.)
• 2.2.2. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 2.3. Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn
• 2.4. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
• 2.5. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate
• 2.6. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn ethyl acetate
• 2.7. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ
• 2.8. Xác định cấu trúc của hợp chất PA01
• 3. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Diệp Hạ Châu Đắng Tổng Quan và Tiềm Năng Kháng Khuẩn

Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus) là một loại cây thuốc nam quý giá, từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau. Ngày nay, khi tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng, việc nghiên cứu và khai thác tiềm năng kháng khuẩn của Diệp Hạ Châu Đắng trở nên vô cùng cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào quá trình phân lập và tinh chế hợp chất kháng khuẩn từ cây thuốc này, nhằm tìm ra những giải pháp mới để đối phó với các vi khuẩn kháng thuốc nguy hiểm. Theo Đỗ Huy Bích và cs. (2004), Diệp Hạ Châu Đắng còn có tác dụng lợi tiểu, trị sỏi mật và sỏi thận, chống oxy hóa, mở ra nhiều hướng nghiên cứu và ứng dụng tiềm năng.

1.1. Nguồn Gốc Phân Bố và Đặc Điểm Nhận Dạng Của Cây

Diệp Hạ Châu Đắng có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nam Mỹ và phân bố rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Việt Nam. Tại Việt Nam, cây mọc hoang ở nhiều nơi, từ đồng bằng ven biển đến trung du miền núi. Cây thảo này thường cao 20-30cm, thân nhẵn, lá mọc so le hình bầu dục, xếp sít nhau tạo thành hình lông chim đặc trưng. Việc nhận biết chính xác Diệp Hạ Châu Đắng là bước quan trọng để đảm bảo nguồn nguyên liệu chất lượng cho nghiên cứu và ứng dụng. Đỗ Huy Bích và cs. cũng mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái giúp phân biệt cây với các loài khác.

1.2. Thành Phần Hóa Học Tiềm Năng Dược Lý và Kháng Khuẩn

Diệp Hạ Châu Đắng chứa nhiều hợp chất quý như alkaloids, saponins, tannins, flavonoids, glycosides, lignans, và steroids. Trong đó, các hợp chất lignans như phyllanthin và hypophyllanthin được xem là có vai trò quan trọng trong việc mang lại hoạt tính kháng khuẩn của cây. Các nghiên cứu của Sharma và cs. (1993) và Somanabandhu và cs. (1993) đã xác định một số hợp chất flavonoids có tiềm năng kháng khuẩn. Việc phân lập và tinh chế các hợp chất này sẽ giúp xác định chính xác vai trò của chúng trong việc chống lại vi khuẩn.

II. Thách Thức Vi Khuẩn Kháng Thuốc và Nhu Cầu Tìm Kiếm Kháng Sinh Tự Nhiên

Sự gia tăng của vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là các chủng Gram âm kháng carbapenem, đang đặt ra một thách thức lớn cho ngành y tế toàn cầu. Các vi khuẩn như E. coli và Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) gây ra nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng trong bệnh viện và cộng đồng. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xếp các vi khuẩn kháng kháng sinh vào danh sách ưu tiên hàng đầu, thúc đẩy việc tìm kiếm các nguồn thuốc mới. Diệp Hạ Châu Đắng, với tiềm năng kháng khuẩn tự nhiên, đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học như một giải pháp thay thế tiềm năng cho các kháng sinh truyền thống.

2.1. Cơ Chế Kháng Thuốc ESBL và Carbapenemase ở Vi Khuẩn

Vi khuẩn kháng thuốc phát triển các cơ chế phức tạp để chống lại tác dụng của kháng sinh. Một trong những cơ chế phổ biến là sản xuất enzym ESBL (Extended-spectrum β-lactamase) và carbapenemase. Enzym ESBL phá hủy cấu trúc của nhiều loại kháng sinh β-lactam, làm mất tác dụng của chúng. Carbapenemase còn nguy hiểm hơn, vì nó có thể phá hủy cả carbapenem, một trong những loại kháng sinh mạnh nhất hiện có. Việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc là cần thiết để tìm ra các hợp chất có khả năng vượt qua các cơ chế này.

2.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Tìm Kiếm Nguồn Kháng Sinh Mới

Trước tình trạng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng lan rộng, việc nghiên cứu tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới là vô cùng quan trọng. Các nguồn kháng sinh tự nhiên, như Diệp Hạ Châu Đắng, có thể cung cấp các hợp chất có cấu trúc và cơ chế tác dụng khác biệt so với các kháng sinh hiện có, giúp vượt qua các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn. Nghiên cứu này góp phần vào nỗ lực chung của cộng đồng khoa học trong việc tìm ra các giải pháp mới để chống lại vi khuẩn kháng thuốc.

III. Hướng Dẫn Phân Lập Hợp Chất Kháng Khuẩn từ Diệp Hạ Châu Đắng

Việc phân lập hợp chất kháng khuẩn từ Diệp Hạ Châu Đắng đòi hỏi một quy trình chi tiết và cẩn thận, bao gồm nhiều bước từ chiết xuất đến tinh chế và xác định cấu trúc. Bắt đầu từ việc lựa chọn dung môi thích hợp, áp dụng các kỹ thuật sắc ký khác nhau, và cuối cùng là xác định cấu trúc bằng các phương pháp hiện đại. Mục tiêu là thu được các hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng khuẩn cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và ứng dụng trong điều trị.

3.1. Chiết Xuất Cao Dược Liệu Phương Pháp và Tối Ưu Hóa Quy Trình

Bước đầu tiên trong quá trình phân lập hợp chất kháng khuẩn là chiết xuất cao dược liệu từ Diệp Hạ Châu Đắng. Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau, như chiết nóng, chiết lạnh, và chiết siêu âm. Việc lựa chọn dung môi thích hợp là rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất và thành phần các hợp chất thu được. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng, một kỹ thuật hiệu quả để tách các hợp chất dựa trên độ hòa tan khác nhau của chúng trong các dung môi khác nhau.

3.2. Sắc Ký Cột và Sắc Ký Lớp Mỏng Tinh Chế và Phân Tách Hợp Chất

Sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng là hai kỹ thuật quan trọng trong quá trình tinh chế và phân tách hợp chất. Sắc ký cột được sử dụng để tách các hợp chất dựa trên ái lực khác nhau của chúng với pha tĩnh và pha động. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn thu được từ sắc ký cột và để xác định các hợp chất có mặt trong mẫu. Bằng cách kết hợp hai kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu có thể thu được các hợp chất tinh khiết với hoạt tính kháng khuẩn cao.

3.3. Xác Định Cấu Trúc Hóa Học HPLC MS và NMR

Sau khi phân lập và tinh chế các hợp chất, bước tiếp theo là xác định cấu trúc hóa học của chúng. Các phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao), MS (khối phổ), và NMR (cộng hưởng từ hạt nhân) được sử dụng để xác định thành phần, khối lượng phân tử và cấu trúc của các hợp chất. Thông tin này rất quan trọng để hiểu rõ cơ chế tác dụng của các hợp chất và để phát triển các ứng dụng tiềm năng của chúng trong điều trị bệnh.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Khám Phá Hoạt Tính Kháng Khuẩn và Hợp Chất PA01

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phân lập và tinh chế một số hợp chất từ Diệp Hạ Châu Đắng có hoạt tính kháng khuẩn. Trong đó, hợp chất PA01 cho thấy tiềm năng lớn trong việc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc Gram âm. Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các kháng sinh tự nhiên từ Diệp Hạ Châu Đắng, góp phần giải quyết vấn đề kháng kháng sinh đang ngày càng trở nên nghiêm trọng.

4.1. Giám Định Tên Khoa Học và Chiết Xuất Cao Dược Liệu

Việc giám định chính xác tên khoa học của cây thuốc là bước quan trọng để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của nghiên cứu. Nghiên cứu này đã sử dụng các phương pháp giám định thực vật học để xác nhận rằng mẫu cây được sử dụng là Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus). Sau khi giám định, cao dược liệu được chiết xuất từ cây bằng các phương pháp thích hợp.

4.2. Khảo Sát Khả Năng Kháng Khuẩn và Xác Định MIC

Cao chiết và các phân đoạn của nó đã được kiểm tra khả năng kháng khuẩn đối với một số chủng vi khuẩn kháng thuốc. Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethyl acetate đối với vi khuẩn kháng thuốc được xác định để đánh giá mức độ hiệu quả của nó.

4.3. Xác Định Cấu Trúc Hợp Chất PA01 và Tiềm Năng Ứng Dụng

Hợp chất PA01 được phân lập và tinh chế từ cao chiết, sau đó cấu trúc của nó được xác định bằng các phương pháp HPLC, MS và NMR. Kết quả cho thấy PA01 có cấu trúc độc đáo và hoạt tính kháng khuẩn hứa hẹn. Nghiên cứu sâu hơn về PA01 có thể dẫn đến việc phát triển các loại thuốc mới để chống lại vi khuẩn kháng thuốc.

V. Ứng Dụng Diệp Hạ Châu Đắng Dược Liệu Tiềm Năng và Phát Triển Bền Vững

Kết quả nghiên cứu này khẳng định tiềm năng của Diệp Hạ Châu Đắng như một nguồn dược liệu quý giá. Tuy nhiên, để khai thác và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên này, cần có các biện pháp bảo tồn và phát triển thích hợp. Ngoài ra, cần có thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn của Diệp Hạ Châu Đắng trong điều trị bệnh.

5.1. Ứng Dụng trong Y Học Cổ Truyền và Hiện Đại

Diệp Hạ Châu Đắng từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học cho hoạt tính kháng khuẩn của cây, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học hiện đại. Các hợp chất phân lập từ cây có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới hoặc bổ sung vào các liệu pháp điều trị hiện có.

5.2. Bảo Tồn và Phát Triển Bền Vững Nguồn Dược Liệu

Việc khai thác và sử dụng Diệp Hạ Châu Đắng cần đi đôi với các biện pháp bảo tồn và phát triển bền vững. Cần có các quy định chặt chẽ về việc thu hái cây, đồng thời khuyến khích việc trồng và nhân giống cây để đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định trong tương lai.

5.3. Nghiên Cứu Lâm Sàng và Đánh Giá An Toàn

Để đưa Diệp Hạ Châu Đắng vào sử dụng rộng rãi trong y học, cần có thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn của cây trong điều trị bệnh. Các nghiên cứu này cần được thực hiện trên quy mô lớn và tuân thủ các tiêu chuẩn khoa học nghiêm ngặt.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Lớn từ Diệp Hạ Châu Đắng Kháng Khuẩn

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phân lập và tinh chế các hợp chất kháng khuẩn từ Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus), khẳng định tiềm năng to lớn của cây thuốc nam này trong việc chống lại vi khuẩn kháng thuốc. Kết quả nghiên cứu là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và ứng dụng lâm sàng của các hợp chất này.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Chính

Nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Diệp Hạ Châu Đắng đối với các chủng vi khuẩn kháng thuốc Gram âm. Hợp chất PA01 đã được phân lập và tinh chế, cấu trúc của nó được xác định và cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của hợp chất PA01, đánh giá hiệu quả của nó trên mô hình động vật và tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn trên người.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi sinh vật kháng thuốc đang trở thành một trong những thách thức y tế nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu, làm thu hẹp đáng kể các phương án sử dụng kháng sinh hiệu quả trong điều trị lâm sàng. Tình trạng này xuất hiện phổ biến ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, trong đó các tác nhân như Escherichia coli hay tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus - MRSA) là nguyên nhân hàng đầu gây bùng phát nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn cộng đồng.

Đặc biệt đáng báo động trong những năm gần đây là sự lan rộng của các chủng trực khuẩn Gram âm mang enzym beta-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum $\beta$-lactamase - ESBL), có khả năng bất hoạt hầu hết các kháng sinh cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactam. Nghiêm trọng hơn, theo phân loại ưu tiên của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các chủng vi khuẩn Gram âm kháng kháng sinh carbapenem như Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và nhóm Enterobacteriaceae sản xuất carbapenemase (CPE) được xếp vào mức độ đe dọa cao nhất vì carbapenem vốn là tuyến phòng thủ kháng sinh mạnh cuối cùng trong điều trị. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc nghiên cứu, tìm kiếm các hoạt chất kháng sinh mới từ nguồn tài nguyên thực vật tự nhiên.

Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới phong phú với nhiều loài cây thuốc có tiềm năng dược học cao. Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) là loài cây thảo mọc hoang dã rộng rãi, từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để thanh nhiệt, sát khuẩn, hỗ trợ chức năng gan, điều trị sỏi thận và các bệnh đường niệu - sinh dục. Các công trình công bố trên thế giới đã bước đầu chứng minh chiết xuất Phyllanthus amarus chứa các nhóm hợp chất lignan, flavonoid, tannin, alkaloid có hoạt tính sinh học đa dạng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công bố chuyên sâu về việc phân lập, tinh chế các hợp chất đơn lẻ từ loài cây này nhằm đối kháng trực tiếp trên các chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng thuốc vẫn còn rất hạn chế.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)" được thực hiện với mục tiêu tổng quát là phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc từ cao chiết của loài cây này.

Khóa luận xác định và triển khai 6 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus).
2. Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của các cao chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus).
3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethyl acetate diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn kháng thuốc.
4. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột.
5. Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của các cao phân đoạn ethyl acetate.
6. Phân lập, tinh chế hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp sắc ký cột và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất thu được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Mẫu thực vật: Toàn cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) thu hái tại tỉnh Tây Ninh, Việt Nam.
  • Chủng vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc được cung cấp bởi Khoa Y - Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm chủng sinh ESBL (Escherichia coli 128a) và các chủng sinh carbapenemase (Klebsiella 26k, Acinetobacter 77a, Escherichia coli 443a).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Dầu Một, Bình Dương) và Phòng Hợp chất có hoạt tính sinh học (Phòng 19 và Phòng 24, Viện Công nghệ Hóa học, Thành phố Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành thực hiện từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 08 năm 2020.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và tiêu chuẩn áp dụng

• Cơ sở phân loại thực vật học và hóa thực vật: Vị trí phân loại học của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., họ Thầu dầu Euphorbiaceae). Nghiên cứu kế thừa các tư liệu về thành phần hóa học đặc trưng của chi Phyllanthus, bao gồm các lignan chính (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin, filtetralin), các flavonoid (quercetin, rutin, isoquercitrin, quercitrin, astragalin), tannin thủy phân (phyllanthusiin D, amariin, amarulone, amarinic acid, geraniin) và các alkaloid (ent-norsecurinine, sobubbialine, epibubbialine).
• Cơ chế đề kháng kháng sinh: Lý thuyết về các chủng vi khuẩn Gram âm sinh men $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL bắt nguồn từ đột biến của các enzym TEM-1, TEM-2, SHV-1) và các chủng sinh enzym carbapenemase (như metallo-$\beta$-lactamase NDM-1 hoặc KPC mang gen trên plasmid/integron) làm bất hoạt cấu trúc vòng $\beta$-lactam của kháng sinh.
• Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: Áp dụng các quy định của Dược điển Việt Nam IV (2009) về tiêu chuẩn chất lượng cao dược liệu, phương pháp chiết xuất và quy trình thử giới hạn nhiễm khuẩn.
• Tiêu chuẩn đánh giá vi sinh: Áp dụng hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI, 2010) trong việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Phương pháp thu nhận và chiết xuất dược liệu:
  • Mẫu cây sau khi thu hái được rửa sạch đất, sấy khô ở nhiệt độ 50°C trong 72 giờ và xay thành bột thô.
  • Sử dụng phương pháp ngâm chiết bột dược liệu với dung môi ethanol 96° theo tỷ lệ khối lượng/thể tích là 1:5 trong thời gian 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được lọc chân không và cô quay chân không ở nhiệt độ 50–60°C để thu hồi cao cồn thô.
  • Áp dụng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng: Cao thô được hòa tan trong nước (tỷ lệ 1:10) rồi chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane và ethyl acetate. Sau khi cô đuổi dung môi, thu được cao phân đoạn n-hexane và cao phân đoạn ethyl acetate.
• Phương pháp kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Đánh giá số lượng vi sinh vật sống lại được theo Dược điển Việt Nam IV; đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trên môi trường Nutrient Agar (NA) ủ ở 37°C trong 24–48 giờ và đếm tổng số nấm men - nấm mốc trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar ủ ở 28–30°C trong 5 ngày.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (Khuếch tán qua giếng thạch):
  • Thử nghiệm trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) với độ dày thạch 5 mm.
  • Chuẩn hóa huyền dịch vi khuẩn theo thang chuẩn độ đục 0,5 McFarland (tương đương $1–2 \times 10^8$ CFU/mL), trải đều vi khuẩn lên mặt thạch và đục lỗ thạch đường kính 6 mm.
  • Nạp 70 $\mu$L mẫu cao chiết (hòa tan trong DMSO 10% ở nồng độ thử nghiệm) vào mỗi giếng thạch; đối chứng âm sử dụng 70 $\mu$L dung dịch DMSO 10%. Đĩa thạch được ủ ở 37°C trong 18–24 giờ và tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn (vòng kháng khuẩn).
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Sử dụng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch theo chuẩn CLSI (2010). Pha loãng cao chiết từ nồng độ gốc 1000 $\mu$g/mL theo cấp số nhân ($1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64$), trộn vào môi trường thạch MHA và chấm dịch vi khuẩn nồng độ $10^6$ tế bào/mL, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ để ghi nhận nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của khuẩn lạc.
• Phương pháp sắc ký cột (Column Chromatography - SKC) và sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC):
  • Sắc ký cột pha thường sử dụng chất hấp phụ silica gel Merck cỡ hạt 0,040–0,063 mm (240–430 mesh).
  • Tách phân đoạn cao ethyl acetate bằng các hệ dung môi giải ly với độ phân cực tăng dần gồm: n-hexane : ethyl acetate (75:25), n-hexane : ethyl acetate (50:50), n-hexane : ethyl acetate (25:75), n-hexane : ethyl acetate (0:100) và ethyl acetate : methanol (90:10).
  • Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng trên bản nhôm tráng sẵn DC-Alufolien 60 $F_{254}$ và $RP18$ $F_{254}$, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc hiện màu bằng thuốc thử $H_2SO_4$ 10% kết hợp gia nhiệt.
  • Phân đoạn hoạt tính cao nhất tiếp tục được tinh chế qua các hệ sắc ký cột bổ sung gồm: n-hexane : ethyl acetate (95:5), chloroform : methanol (99:1) và chloroform 100%.
• Phương pháp tự sinh đồ (Bioautography): Phun trực tiếp huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm (Acinetobacter 77a ở nồng độ $1–2 \times 10^6$ CFU/mL) lên bản mỏng sắc ký đã được giải ly và làm khô dung môi; ủ mẫu để phát hiện các vết hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn (thể hiện qua vùng ức chế màu trắng trên nền màu của bản mỏng).
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H$-NMR tần số 500 MHz và $^{13}C$-NMR tần số 125 MHz) trên máy Bruker AM500 FT-NMR với chất nội chuẩn Tetramethylsilane (TMS) tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học liên quan đến đề tài:

• Nguyên liệu thực vật: Hệ thống hóa đặc điểm thực vật học, nguồn gốc địa lý (Nam Mỹ và phân bố tại các vùng nhiệt đới châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam dưới độ cao 800 m), đặc tính sinh thái ưa sáng, ưa ẩm, vòng đời 3–5 tháng của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Phân tích chi tiết các nhóm hoạt chất tự nhiên phân lập được từ loài cây này gồm 7 hợp chất lignan chính (trong đó chủ yếu là phyllanthin và hypophyllanthin), flavonoid (quercetin, rutin...), tannin thủy phân và alkaloid. Tác giả cũng tổng hợp các công dụng y học cổ truyền và các bài thuốc dân gian sử dụng P. amarus để chữa viêm gan B, xơ gan cổ trướng, sốt rét.
• Tác nhân vi khuẩn kháng thuốc: Trình bày cấu trúc và cơ chế kháng thuốc của các enzym ESBL sinh bởi trực khuẩn Gram âm và enzym carbapenemase (như các biến thể blaKPC và NDM-1). Cập nhật số liệu dịch tễ học về tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc tại các bệnh viện lớn ở Việt Nam (Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Việt Đức) và trên thế giới.
• Tình hình nghiên cứu thực nghiệm: Điểm luận các công trình chiết xuất và kháng khuẩn từ Phyllanthus amarus của các tác giả quốc tế (Aliyu và cs., 2008; Akinjogunla và cs., 2010; Valle và cs., 2015; Senjobi và cs., 2017; Ribeiro và cs., 2019) và trong nước (Huỳnh Kim Diệu và cs., 2011; Nguyen và cs., 2017).
• Cơ sở phương pháp chiết tách và phân tích: Khái quát các kỹ thuật chiết dược liệu (ngâm chiết, ngấm kiệt, chiết Soxhlet, chiết phân bố lỏng - lỏng), nguyên lý tách chất bằng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong xác định cấu trúc hóa học.

Phần II. Vật liệu – Phương pháp

Chương này trình bày chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm và bố trí thí nghiệm:

• Mô tả nguồn gốc đối tượng nghiên cứu (nguyên liệu cây tại Tây Ninh và các chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc từ Đại học Y Dược TP.HCM), thời gian và địa điểm thực hiện.
• Thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm toàn diện từ các bước: giám định tên khoa học mẫu thực vật $\rightarrow$ xử lý sơ bộ $\rightarrow$ chiết xuất cao thô $\rightarrow$ chiết phân bố lỏng - lỏng $\rightarrow$ kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn $\rightarrow$ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng khuếch tán giếng thạch $\rightarrow$ xác định MIC $\rightarrow$ sắc ký cột phân đoạn cao ethyl acetate $\rightarrow$ đánh giá hoạt tính từng phân đoạn $\rightarrow$ chạy cột tinh chế hợp chất $\rightarrow$ thử nghiệm tự sinh đồ $\rightarrow$ đo phổ NMR xác định cấu trúc.
• Quy định cụ thể các thông số kỹ thuật thực nghiệm: nồng độ vi khuẩn theo thang McFarland, tỷ lệ pha loãng mẫu, thể tích nạp mẫu vào giếng thạch (70 $\mu$L), điều kiện ủ vi sinh ($37^\circ\text{C}$/18–24 giờ), hệ dung môi chạy sắc ký cột (từ hệ n-hexane : ethyl acetate đến chloroform : methanol) và công thức tính toán toán học (công thức hiệu suất chiết $H%$, công thức đếm vi sinh vật sống $N$, công thức tính hệ số dịch chuyển $R_f$).

Phần III. Kết quả – Thảo luận

Chương này tập trung trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu nhận được:

• Kết quả giám định thực vật: Mẫu thực vật thu hái tại Tây Ninh được Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên định danh chính xác là Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., thuộc chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae, bộ Tubiflorae, lớp Dicotyledoneae, ngành Angiospermae, giới Plantae.
• Kết quả chiết xuất cao dược liệu: Từ 3 kg bột dược liệu khô, quá trình ngâm chiết với ethanol 96° (tỷ lệ 1:5 trong 72 giờ) sau khi cô quay chân không ở 50°C thu được 360 g cao cồn thô, tương ứng với hiệu suất chiết đạt 12%. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân tách thành công cao phân đoạn n-hexane và cao phân đoạn ethyl acetate.
• Giới hạn nhiễm khuẩn: Kết quả kiểm tra mẫu cao chiết cho thấy các chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí và nấm mốc đều nằm trong giới hạn cho phép của Dược điển Việt Nam IV, đảm bảo điều kiện vô trùng cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo.
• Hoạt tính kháng khuẩn và xác định MIC của các loại cao chiết: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch cho thấy cao phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc rõ rệt so với các phân đoạn khác. Tiếp tục xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethyl acetate trên các chủng thử nghiệm.
• Phân tách sắc ký cột và đánh giá hoạt tính các phân đoạn: Từ cao ethyl acetate, quá trình sắc ký cột pha thường thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ PA-E1 đến PA-E5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc cho thấy phân đoạn PA-E3 thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất.
• Tinh chế hợp chất và thử nghiệm tự sinh đồ: Phân đoạn PA-E3 tiếp tục được đưa vào hệ sắc ký cột lặp lại với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate (95:5), chloroform : methanol (99:1) và chloroform (100%), thu được hợp chất sạch ký hiệu là PA01. Thử nghiệm tự sinh đồ bằng phương pháp phun dịch vi khuẩn trực tiếp lên bản mỏng TLC xác nhận hợp chất PA01 tạo vòng ức chế rõ rệt chống lại chủng vi khuẩn Acinetobacter 77a.
• Xác định cấu trúc hóa học hợp chất PA01: Dữ liệu phổ $^1H$-NMR (500 MHz) và $^{13}C$-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo cho phép xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết PA01 phân lập từ cây diệp hạ châu đắng.

Phần IV. Kết luận – Đề nghị

Chương này tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được đối chiếu với mục tiêu ban đầu và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp nối về mở rộng chủng vi khuẩn thử nghiệm và khảo sát độc tính sinh học.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Các kết quả định lượng và phát hiện thực nghiệm được tổng hợp trong bảng số liệu dưới đây:

Hạng mục thực nghiệm	Thông số và kết quả ghi nhận trong văn bản
Giám định thực vật	Xác nhận loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. (họ Euphorbiaceae)
Khối lượng nguyên liệu khô	3 kg bột dược liệu khô
Dung môi chiết xuất thô	Ethanol 96° (tỷ lệ 1:5, thời gian 72 giờ, nhiệt độ phòng)
Khối lượng cao thô thu được	360 g
Hiệu suất chiết cao thô ($H%$)	12%
Cao phân đoạn hoạt tính cao nhất	Cao phân đoạn ethyl acetate
Phân đoạn sắc ký cột từ cao ethyl acetate	Thu được 5 phân đoạn: PA-E1, PA-E2, PA-E3, PA-E4, PA-E5
Phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất	Phân đoạn PA-E3
Hợp chất tinh chế thu được	Hợp chất PA01 (tinh chế từ phân đoạn PA-E3 qua sắc ký cột)
Hoạt tính trên tự sinh đồ của PA01	Tạo vùng ức chế kháng khuẩn rõ rệt trên chủng Acinetobacter 77a
Phương pháp xác định cấu trúc PA01	Phổ $^1H$-NMR (500 MHz) và $^{13}C$-NMR (125 MHz) trên Bruker AM500 FT-NMR

Đóng góp của đề tài

• Đóng góp khoa học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm mới tại Việt Nam về khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng sinh (đặc biệt là các chủng sinh ESBL và carbapenemase) của các phân đoạn chiết xuất từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) thu hái tại Tây Ninh.
• Đóng góp phương pháp: Thiết lập quy trình chiết xuất, phân đoạn và tinh chế hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học kết hợp đồng bộ giữa sắc ký cột pha thường, sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật tự sinh đồ (bioautography) định hướng hoạt tính và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

Giải pháp và kiến nghị

Tác giả đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng khuẩn của hợp chất PA01 trên các chủng vi khuẩn kháng thuốc khác, đồng thời khảo sát thêm các hợp chất còn lại trong các phân đoạn sắc ký khác của cây diệp hạ châu đắng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi thử nghiệm sinh học tập trung vào một số chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc đại diện do Trường Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp (E. coli 128a, Klebsiella 26k, Acinetobacter 77a, E. coli 443a).
• Nghiên cứu chỉ tập trung phân lập, tinh chế sâu và xác định cấu trúc một hợp chất chính (PA01) từ phân đoạn hoạt tính PA-E3 mà chưa tinh chế toàn bộ các hợp chất thứ cấp trong các phân đoạn còn lại.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng khảo sát phổ kháng khuẩn của hợp chất PA01 và các phân đoạn cao chiết trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh lâm sàng khác, bao gồm cả vi khuẩn Gram dương kháng thuốc (như MRSA) và các loài nấm gây bệnh.
• Tiến hành các thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào (cytotoxicity) và độc tính cấp/bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm để kiểm chứng độ an toàn.
• Nghiên cứu cơ chế tác động ở mức độ phân tử của hợp chất PA01 đối với enzym ESBL và carbapenemase nhằm phục vụ định hướng phát triển chế phẩm kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các đối tượng và nội dung sau:

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học, giảng viên và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Vi sinh y học.
• Nội dung tham khảo chuyên sâu:
  • Quy trình chiết xuất ngâm chiết ethanol và chiết phân bố lỏng - lỏng để thu các phân đoạn cao dược liệu theo độ phân cực.
  • Kỹ thuật kết hợp giữa sắc ký cột pha thường và sắc ký lớp mỏng trong phân tách các nhóm hợp chất thực vật.
  • Phương pháp tự sinh đồ (bioautography) phun dịch vi khuẩn trực tiếp lên bản mỏng sắc ký để định vị nhanh các vết chất có hoạt tính kháng sinh.
  • Phương pháp luận và cách thức thu nhận dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H$-NMR và $^{13}C$-NMR) trong việc xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Mục tiêu cốt lõi của khóa luận tốt nghiệp này là gì?
Khóa luận tập trung vào việc chiết xuất, sàng lọc hoạt tính, phân lập và tinh chế hợp chất tự nhiên có hoạt tính ức chế các chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc (sinh ESBL và carbapenemase) từ nguồn nguyên liệu cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus), sau đó xác định cấu trúc hóa học của hợp chất thu được.

2. Mẫu thực vật được thu thập ở đâu và hiệu suất thu nhận cao thô ban đầu là bao nhiêu?
Mẫu cây diệp hạ châu đắng được thu hái tại tỉnh Tây Ninh và được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM là Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. Quá trình ngâm chiết 3 kg bột dược liệu khô với ethanol 96° trong 72 giờ đã thu được 360 g cao thô, tương ứng với hiệu suất chiết đạt 12%.

3. Khóa luận đã thử nghiệm hoạt tính trên các chủng vi khuẩn cụ thể nào?
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm do Khoa Y - Trường Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp, gồm chủng sinh enzym ESBL (Escherichia coli 128a) và các chủng sinh enzym carbapenemase (Klebsiella 26k, Acinetobacter 77a, Escherichia coli 443a).

4. Phân đoạn sắc ký nào thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và hợp chất nào đã được tinh chế?
Từ cao phân đoạn ethyl acetate, qua sắc ký cột pha thường đã tách được 5 phân đoạn (PA-E1 đến PA-E5), trong đó phân đoạn PA-E3 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Từ phân đoạn PA-E3, tác giả tiếp tục chạy sắc ký cột lặp lại để phân lập được hợp chất tinh khiết PA01 có khả năng ức chế chủng vi khuẩn Acinetobacter 77a trên thử nghiệm tự sinh đồ.

5. Cấu trúc của hợp chất PA01 được phân tích bằng thiết bị và phương pháp nào?
Cấu trúc hóa học của hợp chất PA01 được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, đo phổ $^1H$-NMR (500 MHz) và $^{13}C$-NMR (125 MHz) trên máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đặng Thị Sen đã hoàn thành đầy đủ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm về chiết xuất, sàng lọc hoạt tính sinh học và tinh chế hợp chất từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Đề tài đã chứng minh cao phân đoạn ethyl acetate và đặc biệt là phân đoạn PA-E3 có khả năng ức chế rõ rệt các chủng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc sinh ESBL và carbapenemase. Việc phân lập thành công hợp chất tinh khiết PA01 có hoạt tính kháng vi khuẩn Acinetobacter 77a và giải mã cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR đã đóng góp nguồn dẫn liệu thực nghiệm có giá trị cho hướng nghiên cứu phát triển các hoạt chất kháng khuẩn mới từ dược liệu thiên nhiên tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 2 TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trên thế giới, sự xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+). Trong đó có các chủng kháng kháng sinh phổ biến nhất E.

coli, Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới. Trong thập kỷ qua, đáng báo động là sự bùng nổ của vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL. Extended–spectrum β– lactamase (ESBL) chỉ định chung cho trực khuẩn Gram (-) sản xuất β–lactamase phổ rộng, enzym này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh tiêu diệt chúng (Horie và cs. Bên cạnh đó, theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) các vi khuẩn kháng kháng sinh được xếp vào mức độ ưu tiên hàng đầu là các loại A.

aeruginosa có khả năng kháng Carbapenem – là một trong những loại kháng sinh mạnh nhất của con người. Theo đó, sự lan truyền của vi khuẩn kháng carbapenem là một cuộc khủng hoảng sức khỏe toàn cầu (Nicolau và cs. Vì vậy việc tìm được nguồn thuốc mới thay thế các thuốc đang sử dụng hiện tại trở thành một vấn đề vô cùng cấp thiết, trong đó thực vật là dược liệu đầy tiềm năng. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm vì vậy có hệ thực vật được dùng làm dược liệu vô cùng phong phú và đa dạng.

Đây chính là tài nguyên hết sức quý giá. Hiện nay, việc sử dụng các bài thuốc từ tự nhiên để hỗ trợ điều trị bệnh đang ngày càng phát triển, trong đó đáng kể đến là diệp hạ châu đắng (P. Diệp hạ châu đắng (P. amarus) được dân gian sử dụng để sát khuẩn, các bệnh của hệ niệu – sinh dục, đái tháo đường, lợi tiểu trị sỏi mật và sỏi thận, chống oxy hóa (Đỗ Huy Bích và cs., 2004), chống viêm (Harikrishnan và cs., 2018), chống lại virus viêm gan B (Thyagarajan và cs., 1988; Wang và cs., 1995), chống ung thư (Joy và cs.

Năm 2010 theo nghiên cứu của Adegoke và cộng sự, cho thấy cao chiết ethanol của lá cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có sự hiện diện của alkaloid, tannin và flavonoid và có tác dụng kháng lại các vi khuẩn S. coli và Klebsiella spp. (Adegoke và cs.

SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 3 TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Dhandapani và cộng sự (2017) đã nghiên cứu sàng lọc sơ bộ hợp chất tự nhiên của cao chiết từ lá và rễ diệp hạ châu đắng (P. amarus) cho thấy có sự hiện diện của các alkaloid, phytosterol, hợp chất phenolic và tannin, protein và amino acid, lignin và saponin.

Các hợp chất này đều cho thấy khả năng kháng khuẩn chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh như các vi khuẩn Gram (+) S. subtilis và vi khuẩn Gram (-) như E. coli (Dhandapani và cs. Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu được công bố về việc sử dụng các hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P.

amarus) để kháng lại với các vi khuẩn kháng thuốc. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN GRAM ÂM KHÁNG THUỐC TỪ CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)”. Mục tiêu: Phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt chất kháng vi khuẩn Gram âm kháng thuốc từ cao chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Nội dung thực hiện bao gồm: - Chiết xuất cao dược liệu từ cây diệp hạ châu đắng (P.

- Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao chiết diệp hạ châu đắng (P. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethyl acetate diệp hạ châu đắng (P. amarus) với vi khuẩn kháng thuốc. - Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột.

- Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao phân đoạn ethyl acetate. - Phân lập hợp chất tự nhiên trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp sắc ký cột. SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 4 TS. NGUYỄN TẤN PHÁT PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 5 TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT 1. Tổng quan về nguyên liệu 1. Sơ lược về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Tên khoa học: Phyllanthus amarus, thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae), tên thường gọi: chó đẻ thân xanh, chó đẻ răng cưa, cam kiềm, rút đất, kham ham.

Vị trí phân loại: Giới: Plantae Ngành: Angiospermae Lớp: Dicotyledoneae Bộ: Tubiflorae Họ: Euphorbiaceae Chi: Phyllanthus Loài: Amarus Schum.et Thonn Hình 1. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) (Hemant Dhongade và cs. Nguồn gốc và sự phân bố Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là loài cây nhiệt đới, có nguồn gốc xa xưa ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ và hiện nay phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới cổ.

Ở Châu Á gồm các nước Ấn Độ, Malaysia, Phillippin, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Nam Trung Quốc và cả ở vùng đảo Salawesi (Đỗ Huy Bích và cs. Ở Việt Nam, diệp hạ châu đắng (P. amarus) mọc rải rác khắp nơi, từ các tỉnh ở vùng đồng bằng, ven biển, các đảo lớn đến các tỉnh ở trung du và miền núi, có độ cao dưới 800 m. Ở các nước Đông Nam Á, độ cao phân bố của diệp hạ châu đắng (P.

amarus) có thể lên tới 1. có nhiều loài, gồm những cây thảo đến các cây bụi hay gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 6 TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài. Trên thế giới, các loài này cũng có phân bố rộng rãi ở một số nước nhiệt đới Châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào và ở cả Nam Trung Quốc. Diệp hạ châu đắng (P. amarus) là cây ưa ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở ruộng cao, nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi không chịu được ngập úng.

Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa…) pH từ 5,0 đến 6,5. Cây con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân; sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25–30oC. Do khả năng ra hoa kết quả nhiều, hạt giống phát tán gần nên cây thường mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả các loại cỏ dại và cây trồng khác, vòng đời kéo dài 3–5 tháng (Đỗ Huy Bích và cs.

Đặc điểm hình thái Cây thảo, sống hằng năm hay sống dai, cao khoảng 20–30 cm, có thể đến 60–70 cm. Thân nhẵn, mọc thẳng đứng, lá mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy như một lá kép hình lông chim. Phiến lá thuôn, dài 1–1,5 cm, rộng 3– 4 mm, đầu lá nhọn hay hơi tù, mép có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới lá màu xanh lơ; cuống lá rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực ở đầu cành có 6 lá dài, 3 nhị, chỉ nhị ngắn; hoa cái ở cuối cành, 6 lá dài, bầu hình trứng.

Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Mùa hoa: tháng 4–6; mùa quả: tháng 7–9 (Đỗ Huy Bích và cs. Thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng (P. amarus) Diệp hạ châu đắng (P.

amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen, lignan và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích. Diệp hạ châu đắng (P. amarus) có các hợp chất chủ yếu như lignans, geraniin và 5 hợp chất của flavonoids như quercertin, astralgin, quercertrin, isoquercitrin và rutin (Sharma và cs., 1993; Somanabandhu và cs. Theo SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 7 TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Pereira và cộng sự (2016) đã xác định trong toàn cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) có 7 hợp chất lignan là 5–demethoxy–niranthin, phyllanthin, filtetralin, 5–demethox nirtetralin, nirtetralin, hipophyllanthin và niranthin, trong đó chiếm chủ yếu là phyllanthin và hipophyllanthin (Pereira và cs. Đồng thời trong cây diệp hạ châu đắng (P.

amarus) cũng chứa những hợp chất nhỏ như hydrolysable tannin là phyllanthusiin D (Houghton và cs., 1996), amariin (Foo, 1993), amarulone (Rao và Bramley, 1971), amarinic acid, alkaloid như ent–norsecurinine, sobubbialine, epibubbialine, diarylbutane, nyrphyllin và neolignan, phyllnirurin. Phyllanthin Hipophyllanthin Quercertin Isoquercitrin Rutin Hình 1. Cấu trúc các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 8 TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Phyllanthusiin D Amariin Amarulone Amarinic acid Ent-norsecurinine Sobubbialine Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) (tiếp theo) SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 9 TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT Epibubbialine Neolignan Phyllnirurin Epibubbialine Neolignan Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cây diệp hạ châu đắng (P. Giá trị dược liệu của cây diệp hạ châu đắng (P. Diệp hạ châu đắng (P.

amarus) là loại cây thân thảo chứa nhiều hợp chất như alkaloids, saponin, tannin, flavonoid, glycoside cyanogen và steroid mang lại nhiều tác dụng hữu ích. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, tất cả bộ phận cây diệp hạ châu đắng (P. amarus) được phơi khô, sắc uống dùng chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhót, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, SVTH: ĐẶNG THỊ SEN GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trang 10 TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT chàm má. Người Ấn Độ sử dụng diệp hạ châu đắng (P. amarus) để trị ho, viêm phế quản, hen phế quản, lao,… Ngoài ra diệp hạ châu đắng (P. amarus) còn có khả năng làm hạ men gan, tăng cường chức năng gan và ức chế sự phát triển của virus viêm gan siêu vi B (Break Stone và cs.

Năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá được tác dụng ức chế sự phát triển HIV–1 từ cao chiết diệp hạ châu đắng (P. Theo nghiên cứu của Trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil, 1984) đã phát hiện alkaloid có trong diệp hạ châu đắng (P. amarus) có tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật. Theo Thyagarajan và cộng sự (1988) đã nghiên cứu cho thấy cao chiết từ bột của cây P.