Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Ung thư biểu mô phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) là một trong những bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trên thế giới. Sự phát triển của các liệu pháp nhắm trúng đích phân tử, đặc biệt là các chất ức chế tyrosine kinase (TKI) tác động lên thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), đã mở ra bước tiến quan trọng trong điều trị bệnh nhân mang đột biến gen EGFR. Dacomitinib (tên thương mại Vizimpro®, do hãng dược phẩm Pfizer phát triển và được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ - FDA phê duyệt vào tháng 8 năm 2018) là hoạt chất ức chế chọn lọc và không thuận nghịch thế hệ mới đối với miền xúc tác của toàn bộ thụ thể họ HER (bao gồm EGFR/HER1, HER2 và HER4) cũng như các đột biến kháng thuốc như T790M, với hoạt tính ức chế mạnh ở nồng độ ức chế một nửa $\text{IC}_{50} = 6\text{ nmol/L}$.
Trong cấu trúc của Dacomitinib, khung quinazolin giữ vai trò cốt lõi và được gắn tuần tự các nhóm chức: chuỗi amid chứa liên kết đôi trans ở vị trí số 6, nhóm ether methoxy ở vị trí số 7, và nhóm amin thơm mang hai nhóm thế halogen (3-chloro-4-fluoroanilin) ở vị trí số 4. Các nghiên cứu tổng hợp hóa dược trên thế giới cho thấy thứ tự và phương pháp gắn các nhóm thế quyết định trực tiếp đến hiệu suất tổng thể của toàn bộ quy trình. Trong đó, chất trung gian $N$-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-nitroquinazolin-4-amin (kí hiệu là DF4) là chặng then chốt không chỉ trong quy trình điều chế Dacomitinib mà còn có giá trị ứng dụng cao trong tổng hợp các thuốc TKI tương tự như Afatinib.
Tuy nhiên, các quy trình kinh điển đã công bố thường tồn tại nhiều bất cập: sử dụng tác nhân đắt tiền và khó kiếm như formamidin acetat; phản ứng nitro hóa dùng acid nitric bốc khói ở nhiệt độ cao ($100^\circ\text{C}$) dễ gây phân hủy tác nhân, sinh tạp dinitro và làm giảm hiệu suất; việc sử dụng các dung môi có nhiệt độ sôi cao như $N,N$-dimethylformamid (DMF) hay dimethylacetamid (DMAc) gây trở ngại lớn cho quá trình cất thu hồi và tinh chế.
Xuất phát từ thực tế đó, đề tài khóa luận tập trung giải quyết các nhiệm vụ và mục tiêu cụ thể:
- Tổng hợp thành công chất trung gian $N$-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-nitroquinazolin-4-amin (DF4) từ nguyên liệu ban đầu là acid 2-amino-4-fluorobenzoic (DF0) ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Khảo sát, so sánh và lựa chọn các dung môi thích hợp cho quá trình kết tinh và tinh chế từng chất trung gian nhằm nâng cao độ tinh khiết.
- Khảo sát các thông số công nghệ (tỷ lệ mol phản ứng, thiết bị phản ứng, tác nhân phản ứng) nhằm tối ưu hóa hiệu suất từng giai đoạn chuyển hóa.
- Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), đo nhiệt độ nóng chảy và xác định sáng tỏ cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được thông qua hệ thống phổ nghiệm hiện đại (IR, MS, $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất trung gian $N$-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-nitroquinazolin-4-amin (DF4) và các chất trung gian hình thành trong các bước chuyển hóa gồm 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (DF1), 7-fluoro-6-nitroquinazolin-4(3H)-on (DF2), 7-methoxy-6-nitroquinazolin-4(3H)-on (DF3).
- Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu - Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội; phân tích cấu trúc phối hợp tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội).
- Thời gian hoàn thành: Khóa luận tốt nghiệp được nghiệm thu vào tháng 06 năm 2024.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết hóa học và dược lý
Khóa luận vận dụng hệ thống lý thuyết về cấu trúc phân tử, cơ chế phản ứng hữu cơ tổng hợp và các đặc tính hóa lý, dược động học của hoạt chất:
- Dược chất Dacomitinib: Công thức phân tử $\text{C}{24}\text{H}{25}\text{ClFN}{5}\text{O}{2}$, phân tử khối $469{,}9\text{ đvC}$. Độ tan phụ thuộc vào pH ($<1\text{ mg/mL}$, giảm mạnh khi $\text{pH} > 4{,}5$). Giá trị $\text{p}K_a$ của khung quinazolin là $8{,}5$ và của nhân piperidin là $5{,}0$. Thuốc có sinh khả dụng đường uống đạt $80{,}01%$, tỷ lệ liên kết protein huyết tương $98%$, thời gian bán thải $t_{1/2} \approx 70\text{ giờ}$, chuyển hóa chính qua hệ enzym CYP2D6 và CYP2C9 thành dạng chất chuyển hóa $O$-desmethyl dacomitinib.
- Cơ chế phản ứng ngưng tụ đóng vòng Quinazolin (DF0 $\rightarrow$ DF1): Phản ứng cộng ái nhân ($\text{A}_\text{N}$) giữa nhóm amin thơm ($\text{-NH}_2$) của acid 2-amino-4-fluorobenzoic vào nhóm carbonyl ($\text{-C=O}$) của formamid tạo hemiaminal trung gian, sau đó nhóm amin của formamid tiếp tục tấn công nhóm carboxyl ($\text{-COOH}$) để đóng vòng và tách loại hai phân tử nước tạo khung pyrimidinon.
- Cơ chế phản ứng nitro hóa (DF1 $\rightarrow$ DF2): Phản ứng thế ái điện tử vòng thơm ($\text{S}_\text{E}\text{Ar}$) với tác nhân ion nitroni ($\text{NO}_2^+$). Nhóm thế fluor có hiệu ứng cộng hưởng $+M$ đẩy điện tử định hướng thế vào vị trí ortho (C6 hoặc C8). Trạng thái chuyển tiếp tại vị trí C6 tạo phức $\sigma$ bền vững hơn vị trí C8 do không chịu ảnh hưởng bất lợi của cặp điện tử trên dị tố nitơ của vòng bên cạnh.
- Cơ chế phản ứng methoxy hóa (DF2 $\rightarrow$ DF3): Phản ứng thế ái nhân vòng thơm ($\text{S}_\text{N}\text{Ar}$) theo cơ chế cộng - tách. Nhóm nucleophil methoxid ($\text{CH}_3\text{O}^-$) tấn công trực tiếp vào carbon C7 mang nhóm thế fluor tạo phức Meisenheimer mang điện tích âm (phenyl carbanion). Nhóm nitro ($\text{-NO}_2$) hút điện tử mạnh ở vị trí ortho (C6) đóng vai trò giải tỏa điện tích âm, làm bền hóa trạng thái trung gian trước khi ion $\text{F}^-$ tách ra.
- Cơ chế phản ứng "One-pot" Clo hóa và $N$-alkyl hóa (DF3 $\rightarrow$ DF4):
- Giai đoạn 1: Clo hóa nhóm hydroxyl (hỗ biến lactim) ở vị trí C4 bằng thionyl clorid ($\text{SOCl}_2$) với xúc tác $N,N$-dimethylformamid (DMF) tạo trung gian 4-chloroquinazolin.
- Giai đoạn 2: Thế ái nhân $\text{S}_\text{N}\text{Ar}$ giữa amin thơm bậc một (3-chloro-4-fluoroanilin) vào carbon C4 mang clo. Xúc tác base hữu cơ triethylamin (TEA) đóng vai trò trung hòa acid $\text{HCl}$ sinh ra, thúc đẩy cân bằng phản ứng dịch chuyển theo chiều tạo thành sản phẩm.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp tổng hợp và tối ưu hóa: Tiến hành phản ứng trong các điều kiện cải tiến (ủ nhiệt bếp cát cho phản ứng đóng vòng, phản ứng methoxy hóa trong bình áp suất kín chịu nhiệt, phản ứng one-pot liên tục hai giai đoạn clo hóa - amin hóa để hạn chế phân hủy sản phẩm trung gian).
- Phương pháp tinh chế: Sử dụng kỹ thuật hòa tan nóng - kết tinh phân đoạn bằng dung môi chọn lọc hoặc kỹ thuật điều chỉnh pH môi trường để kết tủa và loại tạp vô cơ/hữu cơ.
- Phương pháp kiểm soát độ tinh khiết:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng pha tĩnh silicagel $60\text{ F}_{254}$, theo dõi dưới đèn tử ngoại $\lambda = 254\text{ nm}$ với 3 hệ dung môi: Hệ A (DCM : MeOH = 5 : 1), Hệ B (DCM : MeOH = 20 : 1), Hệ C ($n$-Hexan : EA = 1 : 2).
- Xác định khoảng nóng chảy bằng máy đo nhiệt điện EZ-Melt (Stanford Research Systems).
- Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc:
- Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR): Đo trên thiết bị FTIR Affinity-1S (Shimadzu), dải quét $4000 - 400\text{ cm}^{-1}$, độ phân giải $4\text{ cm}^{-1}$ bằng kỹ thuật viên nén KBr (tỷ lệ mẫu : KBr = 1 : 200).
- Phổ khối lượng (ESI-MS): Ghi trên máy Mass/Charge, chế độ ion hóa phun điện tử dương $\text{ESI}(+)$.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$): Đo trên thiết bị Bruker AV (tần số $600\text{ MHz}$ với $^{1}\text{H}$ và $125 - 150\text{ MHz}$ với $^{13}\text{C}$), dung môi DMSO-$d_6$, chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) ở nhiệt độ $300\text{ K}$. Xử lý và giãn phổ chuyên sâu bằng phần mềm ACD/Labs.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương Tổng quan hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu khoa học về thuốc Dacomitinib và chất trung gian DF4:
- Thông số hóa lý và phân tích nguyên tố Dacomitinib: Phân tử lượng $469{,}9\text{ đvC}$, nhiệt độ nóng chảy $184 - 187^\circ\text{C}$, bột màu trắng đến vàng nhạt. Thành phần phần trăm khối lượng các nguyên tố trong phân tử gồm: Carbon ($59{,}02%$), Hydro ($5{,}53%$), Nitơ ($14{,}35%$), Oxy ($9{,}93%$), Clo ($7{,}28%$) và Fluor ($3{,}89%$).
- Đặc điểm chất trung gian DF4: Bột màu vàng cam, công thức phân tử $\text{C}{15}\text{H}{10}\text{ClFN}{4}\text{O}{3}$, khối lượng phân tử $348{,}04\text{ g/mol}$, điểm nóng chảy $265{,}6^\circ\text{C}$.
- Đánh giá các quy trình tổng hợp trên thế giới:
- Phương pháp của Smaill J. và cộng sự (Pfizer/Warner Lambert): Quy trình gồm 7 giai đoạn, sử dụng formamidin acetat trong 2-methoxyethanol (hiệu suất $90%$), nitro hóa trong DMF, clo hóa bằng $\text{POCl}_3$, methoxy hóa bằng $\text{CH}_3\text{ONa}/\text{MeOH}$ ($90%$), khử hóa $\text{Pd/C}$ ($85%$) và ngưng tụ với acid alkyl hóa thu Dacomitinib ($56%$). Hạn chế là dung môi DMAc khó loại bỏ, đóng vòng sớm làm tốn lượng lớn dung môi hữu cơ.
- Phương pháp của Fakhoury và cộng sự: Quy trình gồm 8 bước từ acid 4-fluoro-2-aminobenzoic, phản ứng nitro hóa ở $100^\circ\text{C}$ dùng $\text{HNO}_3$ bốc khói/$\text{H}_2\text{SO}_4$, hiệu suất chung $44{,}3%$. Nhược điểm là nhiệt độ cao dễ gây oxy hóa và tạo tạp polynitro, tác nhân formamidin acetat đắt tiền.
- Phương pháp của Pfizer (không qua trung gian DF4): Khử nhóm nitro bảo toàn nhóm nitrile ($\text{-CN}$), gắn mạch amid rồi mới đóng vòng quinazolin ở bước cuối với hiệu suất $82%$, hiệu suất toàn quy trình đạt $58%$. Dù ngắn gọn nhưng sử dụng nguyên liệu đầu vào khó kiếm và đắt đỏ.
- Phương pháp của W. Wang (2014) và A. Slassi: Khẳng định tính khả thi của việc thay thế formamidin acetat bằng formamid và phản ứng methoxy hóa trực tiếp trên dẫn xuất fluor bằng natri methoxid trong bình kín.
- Lựa chọn hướng tổng hợp: Lựa chọn quy trình 4 giai đoạn xuất phát từ acid 2-amino-4-fluorobenzoic, dùng formamid tạo vòng quinazolin, nitro hóa có kiểm soát nhiệt độ, methoxy hóa trong bình áp suất và "one-pot" kết hợp clo hóa với amin hóa.
Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích (AR) và các quy trình thao tác chuẩn:
- Danh mục hóa chất gồm 21 loại chính: acid 2-amino-4-fluorobenzoic, 3-chloro-4-fluoroanilin ($98%$), formamid, $\text{H}_2\text{SO}_4$ ($98%$), $\text{SOCl}_2$, triethylamin (TEA), natri kim loại, $\text{NaNO}_3$, các dung môi tinh khiết (DCM, EA, IPA, MeOH, DMF, $n$-hexan).
- Danh mục thiết bị gồm 32 mục, bao gồm bình áp suất chịu nhiệt, máy cất quay chân không IKA, cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, tủ hút Unilab B1200, máy khuấy từ DaiHan MSH-20D và hệ thống các máy đo phổ nghiệm FTIR, MS, NMR.
- Quy trình chuẩn bị tác nhân: Tự điều chế acid nitric bốc khói tinh khiết trong phòng thí nghiệm bằng phản ứng chưng cất hồi lưu giữa $\text{NaNO}_3$ ($200\text{ g}$) và $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$ ($300\text{ mL}$) ở $83^\circ\text{C}$, thu hơi ngưng tụ trong bình làm lạnh bằng đá tuyết; điều chế natri methoxid ($\text{CH}_3\text{ONa}$) từ natri kim loại hòa tan trong methanol tuyệt đối.
Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận
Chương 3 tập trung phân tích kết quả thực nghiệm của 4 bước tổng hợp và bàn luận chi tiết về phổ nghiệm cấu trúc:
1. Tổng hợp 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (DF1)
- Phản ứng ngưng tụ giữa $3{,}1\text{ g}$ DF0 ($0{,}02\text{ mol}$) và $6{,}4\text{ mL}$ Formamid ($0{,}16\text{ mol}$) trong môi trường sục khí nitơ, ủ nhiệt bếp cát $160 \pm 5^\circ\text{C}$ trong $1{,}5\text{ giờ}$.
- Kết quả thu được $2{,}97\text{ g}$ sản phẩm bột mịn màu trắng ngà, hiệu suất đạt $89{,}10%$, $t^\circ_\text{nc} = 249{,}0 - 250{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}71$ (Hệ A: DCM : MeOH = 5 : 1).
- Khảo sát tỷ lệ mol DF0 : Formamid:
| STT |
Tỷ lệ mol DF0 : Formamid |
Thời gian phản ứng |
Khối lượng DF0 (g) |
Khối lượng DF1 (g) |
Hiệu suất (%) |
Khoảng $t^\circ_\text{nc}$ ($^\circ\text{C}$) |
| 1 |
1 : 4 |
3,0 giờ |
3,10 |
2,68 |
67,83 |
246,0 – 248,5 |
| 2 |
1 : 6 |
2,0 giờ |
3,12 |
3,24 |
81,61 |
247,0 – 248,2 |
| 3 |
1 : 8 |
1,5 giờ |
3,10 |
3,52 |
89,10 |
249,0 – 250,0 |
| 4 |
1 : 10 |
1,5 giờ |
3,09 |
3,15 |
80,00 |
249,1 – 250,0 |
| 5 |
1 : 12 |
1,5 giờ |
3,11 |
3,02 |
76,20 |
248,5 – 249,8 |
| 6 |
1 : 14 |
1,5 giờ |
3,10 |
2,60 |
65,81 |
249,5 – 250,0 |
- Nâng cấp quy mô phản ứng tạo DF1 ($10\text{ g}$ nguyên liệu DF0): Phản ứng kết thúc sau $1\text{ giờ}$, hiệu suất 3 lần lặp lại lần lượt đạt $91{,}11%$, $89{,}62%$ và $89{,}60%$ (hiệu suất trung bình $90{,}11%$).
2. Tổng hợp 7-fluoro-6-nitroquinazolin-4(3H)-on (DF2)
- Phản ứng nitro hóa $3{,}28\text{ g}$ DF1 ($0{,}02\text{ mol}$) với $10\text{ mL } \text{HNO}_3$ bốc khói và $12{,}8\text{ mL } \text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$ ở $0^\circ\text{C}$ sau đó duy trì ở nhiệt độ phòng trong $12\text{ giờ}$.
- Tinh chế sản phẩm thô bằng ethyl acetat (EA) nóng ($50 - 60^\circ\text{C}$), thu được $3{,}18\text{ g}$ tinh thể mịn màu vàng, hiệu suất tinh chế đạt $88{,}86%$, hiệu suất tổng phản ứng đạt $81{,}20%$, $t^\circ_\text{nc} = 285{,}7 - 287{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}47$ (Hệ B: DCM : MeOH = 20 : 1).
- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tinh chế DF2:
| STT |
Dung môi tinh chế |
Nhiệt độ nóng chảy ($^\circ\text{C}$) |
Hiệu suất tinh chế (%) |
Ghi chú độ tinh khiết |
| 1 |
Ethyl acetat (EA) |
285,7 – 286,8 |
88,86 |
Sạch hoàn toàn trên TLC |
| 2 |
Methanol |
283,2 – 287,6 |
- |
Vết tạp vẫn còn rõ |
| 3 |
Ethanol |
286,0 – 287,0 |
86,20 |
Tương đối sạch |
| 4 |
Acetonitril |
285,0 – 287,2 |
76,60 |
Sạch nhưng tổn thất nhiều |
- Khảo sát tác nhân nitro hóa đối với DF1 ($3{,}2\text{ g}$ nguyên liệu):
- $\text{HNO}_3$ bốc khói / $\text{H}_2\text{SO}4\text{ }98%$ (tỷ lệ 1 : 12): Hiệu suất đạt $81{,}20%$, $t^\circ\text{nc} = 285{,}0 - 287{,}0^\circ\text{C}$.
- $\text{NaNO}_3$ / $\text{H}_2\text{SO}4\text{ }98%$ (tỷ lệ 1 : 1,4): Hiệu suất đạt $72{,}20%$, $t^\circ\text{nc} = 284{,}8 - 286{,}6^\circ\text{C}$.
- $\text{KNO}_3$ / $\text{H}_2\text{SO}4\text{ }98%$ (tỷ lệ 1 : 1,4): Hiệu suất đạt $60{,}00%$, $t^\circ\text{nc} = 284{,}8 - 286{,}2^\circ\text{C}$.
- $\text{HNO}_3\text{ }63%$ / $\text{H}_2\text{SO}4\text{ }98%$ (tỷ lệ 1 : 12): Hiệu suất chỉ đạt $42{,}50%$, $t^\circ\text{nc} = 248{,}8 - 260{,}2^\circ\text{C}$.
3. Tổng hợp 7-methoxy-6-nitroquinazolin-4(3H)-on (DF3)
- Phản ứng methoxy hóa giữa $2{,}09\text{ g}$ DF2 ($10\text{ mmol}$) và $2{,}16\text{ g } \text{CH}_3\text{ONa}$ ($40\text{ mmol}$) trong $60\text{ mL}$ methanol tuyệt đối bên trong bình áp suất kín, gia nhiệt ở $90^\circ\text{C}$ trong $48\text{ giờ}$.
- Trung hòa bằng acid acetic ($\text{pH} = 3 - 4$), thu được $2{,}16\text{ g}$ chất rắn xốp màu vàng, hiệu suất đạt $97{,}73%$, $t^\circ_\text{nc} = 280{,}0 - 282{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}36$ (Hệ C: $n$-Hexan : EA = 1 : 2).
- Khảo sát thiết bị và tỷ lệ mol: Phản ứng trong bình áp suất kín ($48\text{ giờ}$, hiệu suất $97{,}73%$) vượt trội hoàn toàn so với đun hồi lưu ở áp suất thường trong bình cầu ($70\text{ giờ}$, hiệu suất $80{,}54%$). Tỷ lệ mol DF2 : $\text{CH}_3\text{ONa}$ tối ưu được xác định là 1 : 4.
4. Tổng hợp $N$-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-nitroquinazolin-4-amin (DF4)
- Quy trình "One-pot" gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: $0{,}442\text{ g}$ DF3 ($2\text{ mmol}$) phản ứng với $8\text{ mL } \text{SOCl}_2$ và 1 giọt xúc tác DMF ở $75^\circ\text{C}$ trong $1{,}5\text{ giờ}$ khan. Cô quay loại $\text{SOCl}_2$, đuổi vết bằng $10\text{ mL}$ DCM ($R_f = 0{,}63$).
- Giai đoạn 2: Cho trực tiếp vào bình cầu hỗn hợp gồm $1{,}5\text{ mL}$ TEA trong $6\text{ mL}$ IPA và $0{,}8\text{ g}$ 3-chloro-4-fluoroanilin ($5{,}5\text{ mmol}$), hồi lưu ở $80^\circ\text{C}$ trong $1{,}5\text{ giờ}$.
- Tinh chế trong IPA nóng và kết tinh lại bằng nước lạnh, thu được $0{,}41\text{ g}$ bột màu vàng cam, hiệu suất phản ứng đạt $58{,}91%$, hiệu suất tinh chế $82{,}00%$ (hiệu suất bước 4 đạt $48{,}31%$), $t^\circ_\text{nc} = 273{,}2 - 274{,}6^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}76$ (Hệ B: DCM : MeOH = 20 : 1).
5. Dữ liệu phổ nghiệm xác định cấu trúc
- DF1: IR có đỉnh $3171\text{ cm}^{-1}$ ($\text{N-H}$ quinazolin), $1684\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C=O}$ lactam), $1617\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C=N}$); $\text{ESI-MS}$ cho pic $[\text{M-H}]^+$ tại $m/z = 165{,}1$ (khối lượng lý thuyết $164{,}14$); $^{1}\text{H-NMR}$ ($\text{DMSO-}d_6$) thể hiện $\delta = 12{,}35\text{ ppm}$ ($\text{br s}, 1\text{H}, \text{NH}$), $\delta = 8{,}207 - 8{,}182\text{ ppm}$ ($\text{dd}, 1\text{H}, \text{H-5}, ^4J_{\text{H-F}} = 9\text{ Hz}, ^3J_{\text{H-H}} = 6\text{ Hz}$), $\delta = 8{,}14\text{ ppm}$ ($\text{s}, 1\text{H}, \text{H-2}$); $^{13}\text{C-NMR}$ xuất hiện đủ 8 tín hiệu carbon với carbon C-7 tách đôi do tương tác ghép spin $^1J_{\text{C-F}} = 250{,}5\text{ Hz}$ tại $\delta = 166{,}39 - 164{,}72\text{ ppm}$.
- DF2: IR xuất hiện thêm các đỉnh dao động mạnh của nhóm nitro tại $1520$, $1341$, $1326\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C-NO}_2$); $\text{ESI-MS}$ có $m/z = 210{,}1\text{ }[\text{M-H}]^+$; $^{1}\text{H-NMR}$ mất hoàn toàn tín hiệu của proton tại C6 và tín hiệu $\text{H-5}$ dịch chuyển về vùng trường thấp $\delta = 8{,}74 - 8{,}76\text{ ppm}$ do ảnh hưởng hút điện tử của nhóm $\text{-NO}_2$.
- DF3: IR xuất hiện vân hấp thụ liên kết ether tại $1280$ và $1264\text{ cm}^{-1}$ ($\text{H}_3\text{C-O-C=}$); $\text{ESI-MS}$ ghi nhận pic $m/z = 222{,}3\text{ }[\text{M-H}]^+$; $^{1}\text{H-NMR}$ xuất hiện mũi đơn sắc nét cường độ $3\text{H}$ tại $\delta = 4{,}05\text{ ppm}$ ($\text{-OCH}_3$), đồng thời không còn hiện tượng tách vạch do tương tác spin-spin với fluor.
- DF4: IR xác nhận sự hình thành nhóm amin bậc 2 với hai dải hấp thụ tại $3417$ và $3363\text{ cm}^{-1}$ ($\text{N-H}$), đỉnh liên kết ether $1233\text{ cm}^{-1}$ và liên kết $\text{C-F}$ tại $1103\text{ cm}^{-1}$; $\text{ESI-MS}$ cho pic ion phân tử $m/z = 349{,}1\text{ }[\text{M-H}]^+$ (lý thuyết $348{,}04$); $^{13}\text{C-NMR}$ kết hợp xử lý phần mềm ACD/Labs xác nhận đầy đủ 15 carbon, trong đó carbon bậc bốn C-4' liên kết trực tiếp với fluor xuất hiện tương tác ghép spin cực đại $^1J_{\text{C-F}} = 235\text{ Hz}$ tại $\delta = 154{,}61 - 152{,}69\text{ ppm}$.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
Quy trình tổng hợp 4 giai đoạn điều chế chất trung gian DF4 từ acid 2-amino-4-fluorbenzoic (DF0) được tổng hợp định lượng trong bảng sau:
| Giai đoạn |
Phản ứng chuyển hóa |
Tác nhân và dung môi chính |
Điều kiện phản ứng |
Hiệu suất giai đoạn (%) |
Đặc tính sản phẩm ($t^\circ_\text{nc}$, TLC $R_f$) |
| 1 |
DF0 $\rightarrow$ DF1 |
Formamid (tỷ lệ 1 : 8) |
$160 \pm 5^\circ\text{C}$, $1{,}5\text{ h}$, khí $\text{N}_2$ |
89,10 (quy mô 10g: 90,11) |
$249{,}0 – 250{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}71$ (Hệ A) |
| 2 |
DF1 $\rightarrow$ DF2 |
$\text{HNO}_3$ bốc khói / $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$ (1 : 12) |
$0^\circ\text{C} \rightarrow$ nhiệt độ phòng, $12\text{ h}$ |
81,20 (tinh chế EA) |
$285{,}7 – 287{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}47$ (Hệ B) |
| 3 |
DF2 $\rightarrow$ DF3 |
$\text{CH}_3\text{ONa}$ / $\text{MeOH}$ (1 : 4) |
Bình áp suất kín, $90^\circ\text{C}$, $48\text{ h}$ |
97,73 |
$280{,}0 – 282{,}0^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}36$ (Hệ C) |
| 4 |
DF3 $\rightarrow$ DF4 |
GĐ1: $\text{SOCl}_2$, xúc tác DMF
GĐ2: 3-chloro-4-fluoroanilin, TEA, IPA |
GĐ1: $75^\circ\text{C}$, $1{,}5\text{ h}$
GĐ2: $80^\circ\text{C}$, $1{,}5\text{ h}$ |
48,31 (tinh chế IPA/nước) |
$273{,}2 – 274{,}6^\circ\text{C}$, $R_f = 0{,}76$ (Hệ B) |
- Hiệu suất tổng thể toàn quy trình (4 bước): Đạt $34{,}16%$.
Đóng góp khoa học và kỹ thuật
- Thay thế tác nhân đắt tiền: Thay thế hoàn toàn formamidin acetat bằng formamid trong phản ứng đóng vòng quinazolin, giúp giảm chi phí tổng hợp, phản ứng thực hiện trực tiếp không cần thêm dung môi phụ trợ và dễ dàng mở rộng quy mô lên $10\text{ g}$ với hiệu suất ổn định trên $90%$.
- Làm chủ kỹ thuật nitro hóa và khảo sát tác nhân thay thế: Chủ động tổng hợp $\text{HNO}_3$ bốc khói tại phòng thí nghiệm; đồng thời chứng minh hệ tác nhân muối nitrat ($\text{NaNO}_3/\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$) có thể thay thế hiệu quả với hiệu suất đạt $72{,}2%$, mang lại độ an toàn cao hơn và dễ thao tác hơn.
- Đột phá về hiệu suất methoxy hóa: Ứng dụng thành công thiết bị bình áp suất kín chịu nhiệt cho phản ứng thế ái nhân $\text{S}_\text{N}\text{Ar}$, nâng hiệu suất phản ứng từ $80{,}54%$ (phương pháp đun hồi lưu thông thường) lên $97{,}73%$, đồng thời rút ngắn thời gian từ $70\text{ giờ}$ xuống $48\text{ giờ}$.
- Tối ưu hóa quy trình one-pot: Kết hợp liên hoàn phản ứng clo hóa và amin hóa trong cùng một bình phản ứng giúp hạn chế tối đa sự phân hủy của dẫn chất trung gian 4-chloroquinazolin kém bền trước độ ẩm môi trường.
- Xác lập bộ dữ liệu phổ nghiệm chuẩn: Cung cấp đầy đủ các thông số phổ nghiệm phân giải cao (IR, ESI-MS, $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$), làm rõ các quy luật tách vạch và tương tác spin-spin giữa các hạt nhân với nguyên tử fluor trong cấu trúc quinazolin đa thế.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Tác nhân acid nitric bốc khói có tính nhạy cảm cao với ánh sáng và khó bảo quản lâu dài trong điều kiện thông thường.
- Hiệu suất giai đoạn 4 ("one-pot" clo hóa và $N$-alkyl hóa) còn ở mức trung bình ($48{,}31%$) do sản phẩm clo hóa trung gian nhạy cảm với ẩm, dễ bị thủy phân một phần quay trở lại hợp chất dạng hydroxyl ban đầu trong quá trình thao tác.
- Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (từ vài trăm miligam đến $10\text{ gam}$), chưa khảo sát động học và truyền nhiệt ở quy mô pilot.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Khảo sát thay thế tác nhân methoxy hóa bằng muối kali methoxid ($\text{CH}_3\text{OK}$) hoặc bổ sung các hệ xúc tác base hữu cơ khác nhằm tiếp tục rút ngắn thời gian phản ứng.
- Thử nghiệm đảo trật tự phản ứng: thực hiện phản ứng one-pot clo hóa và $N$-alkyl hóa trước, sau đó mới tiến hành thế nhóm methoxy nhằm đánh giá ảnh hưởng của thứ tự gắn nhóm thế lên hiệu suất toàn quy trình.
- Tiếp tục thực hiện các giai đoạn tiếp theo của quy trình: khử hóa nhóm nitro ($\text{-NO}_2 \rightarrow \text{-NH}_2$) bằng xúc tác hydro hóa và ngưng tụ với acid $(E)$-4-(piperidin-1-yl)but-2-enoic để hoàn thiện quy trình điều chế toàn phần hoạt chất Dacomitinib.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với:
- Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Hóa dược, Dược học và Hóa hữu cơ: Cung cấp tài liệu thực nghiệm mẫu mực về kỹ thuật tổng hợp dị vòng quinazolin, cơ chế phản ứng thế ái nhân thơm ($\text{S}_\text{N}\text{Ar}$) và kỹ thuật giải phổ cấu trúc hợp chất hữu cơ đa nhân chứa halogen ($\text{F, Cl}$).
- Các nhóm nghiên cứu tổng hợp hoạt chất chống ung thư nhóm TKI: Cung cấp quy trình công nghệ chi tiết, thông số nhiệt độ, tỷ lệ dung môi tinh chế và giải pháp nâng cao hiệu suất điều chế các chất trung gian quan trọng trong tổng hợp Dacomitinib, Afatinib và các dẫn xuất quinazolin liên quan.
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao phản ứng đóng vòng tạo DF1 từ DF0 lại cần sục khí nitơ và ủ nhiệt trong bếp cát ở $160^\circ\text{C}$?
Acid 2-amino-4-fluorobenzoic (DF0) chứa vòng thơm giàu điện tử và hệ liên hợp đôi nên rất dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ cao; việc sục khí $\text{N}_2$ giúp loại bỏ triệt để oxy hòa tan trong hệ phản ứng. Việc sử dụng bếp cát đảm bảo truyền nhiệt đồng đều xung quanh bình cầu đáy tròn ở nhiệt độ cao ($160 \pm 5^\circ\text{C}$), hạn chế quá nhiệt cục bộ và thúc đẩy phản ứng tách nước đóng vòng pyrimidinon.
2. Tác nhân nitro hóa nào cho hiệu suất tốt nhất và giải pháp thay thế an toàn trong phòng thí nghiệm là gì?
Hệ tác nhân $\text{HNO}_3$ bốc khói / $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$ ở tỷ lệ mol 1 : 12 cho hiệu suất cao nhất đạt $81{,}20%$. Tuy nhiên, do $\text{HNO}_3$ bốc khói khó bảo quản và nguy hiểm khi thao tác, hệ tác nhân muối nitrat $\text{NaNO}_3$ / $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ }98%$ được chứng minh là phương án thay thế tối ưu với hiệu suất đạt $72{,}20%$ và sản phẩm dễ tinh chế bằng ethyl acetat.
3. Vì sao phản ứng methoxy hóa tạo DF3 trong bình áp suất kín lại đạt hiệu suất vượt trội so với đun hồi lưu hở?
Phản ứng sử dụng $\text{CH}_3\text{ONa}$ trong methanol. Methanol có nhiệt độ sôi thấp ($64{,}7^\circ\text{C}$) và dễ bay hơi khi đun hồi lưu lâu. Bình áp suất kín cho phép nâng nhiệt độ hệ phản ứng lên $90^\circ\text{C}$ mà không làm thất thoát dung môi, duy trì áp suất hơi cao giúp tăng cường độ hòa tan và tần số va chạm giữa ion nucleophil $\text{CH}_3\text{O}^-$ với cơ chất DF2, từ đó nâng hiệu suất lên mức $97{,}73%$ và rút ngắn thời gian phản ứng từ $70\text{ giờ}$ xuống $48\text{ giờ}$.
4. Lý do thực hiện liên hoàn hai bước clo hóa và $N$-alkyl hóa theo phương pháp "One-pot" trong tổng hợp DF4?
Sản phẩm trung gian 4-chloroquinazolin sau khi clo hóa bằng $\text{SOCl}_2$ rất kém bền và cực kỳ nhạy cảm với ẩm, dễ bị thủy phân trở lại dạng 4-hydroxyquinazolin ban đầu nếu thực hiện phân lập và tinh chế riêng rẽ. Phương pháp "one-pot" cho phép cất đuổi nhanh $\text{SOCl}_2$ dư bằng DCM rồi nạp ngay 3-chloro-4-fluoroanilin cùng xúc tác TEA/IPA để chuyển hóa tức thì thành sản phẩm DF4 bền vững.
5. Vì sao trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$ chuẩn của DF4 vạch tín hiệu của carbon C-4' khó quan sát thấy và tác giả đã xử lý như thế nào?
Carbon C-4' (vị trí liên kết trực tiếp với nguyên tử fluor trên nhân anilin) là carbon bậc bốn không gắn hydro, có thời gian hồi phục spin-mạng (relaxation time) dài và cường độ tín hiệu bị phân tách mạnh do tương tác ghép spin hạt nhân cực lớn với fluor ($^1J_{\text{C-F}} = 235\text{ Hz}$). Tác giả đã xử lý phổ gốc bằng phần mềm ACD/Labs và giãn rộng vùng phổ $\delta = 154{,}61 - 152{,}69\text{ ppm}$ để xác nhận rõ ràng tín hiệu vạch đôi của carbon này.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang đã nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình 4 giai đoạn tổng hợp chất trung gian then chốt $N$-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-nitroquinazolin-4-amin (DF4) từ acid 2-amino-4-fluorobenzoic với hiệu suất toàn phần đạt $34{,}16%$. Đề tài đã đưa ra nhiều cải tiến công nghệ giá trị như sử dụng formamid giá rẻ để nâng quy mô đóng vòng quinazolin lên $10\text{ g}$ với hiệu suất trên $90%$, ứng dụng bình áp suất nâng hiệu suất methoxy hóa lên $97{,}73%$ và thực hiện thành công quy trình one-pot điều chế DF4. Toàn bộ các chất trung gian và sản phẩm cuối đều được tinh chế chọn lọc và xác định cấu trúc rõ ràng thông qua hệ thống phổ nghiệm FTIR, ESI-MS, $^{1}\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$, tạo tiền đề thực nghiệm vững chắc cho việc hoàn thiện quy trình tổng hợp thuốc điều trị ung thư Dacomitinib tại Việt Nam.
