CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Vi rút Viêm não Nhật Bản 1. Đặc điểm cấu trúc Vi rút VNNB là một thành viên của vi rút Arbo (arthropod borne viruses), là những vi rút do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất cả các vi rút arbo đều có hệ gen (genome) là RNA[8].
Vi rút VNNB thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus nhóm B và có liên quan chặt chẽ với virus West Nile và virus viêm não St. Louis… Flavivirus có đường kính 40- 50 nm; bề mặt ngoài là màng lipit kép có nguồn gốc từ tế bào chủ gắn với lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi RNA đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsit. Hạt vi rút VNNB tinh khiết bao gồm sợi RNA chiếm 6%, protein chiếm 66%, lipit 17% và carbohydrate chiếm 9%[1, 8, 9].
Cấu trúc phân tử của sợi RNA gồm 11.000 nucleotide, tương ứng với 3. Hệ gen của vi rút VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa [8].Vi rút VNNB có tỷ trọng 1,19-1,2 g/cm3 trong đường và 1,22- 1,24 g/cm3 trong Cesium chlorid, hệ số lắng 200S, trọng lượng phân tử: 60-70 x106 dalton, độ bền vững: Bền với pH=7-9, thích hợp nhất là pH=8. Vi rút VNNB dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút, 37oC trong vài giờ; nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC vi rút tồn tại trong nhiều năm và trong Nitrogen lỏng (-196oC) vi rút tồn tại lâu dài. Vi rút VNNB rất nhậy với dung môi hòa tan lipit như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyde.
Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút Vi rút VNNB có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của vi rút). Đây cũng chính là kháng nguyên sinh kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) - tức kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo vệ [1, 10]. Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB (Nguồn: Bobade S. Zika Virus –A Vector Borne Zoonotic Disease: an International Public Health Emergency.
Available from: https://bit.ly/2MLfJRM) Bộ gen RNA gồm: 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc. Các protein cấu trúc: Protein C (Capsid): Rất nhỏ, chỉ 9-12 Kda gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm 1 số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử RNA của vi rút với các tác nhân liên quan[11]. Protein M (Membrane): có 2 dạng là protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và protein M.
+Protein preM: có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Trước khi vi rút được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease để tạo thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động duy trì nòi giống của vi rút trưởng thành [1, 11, 12]. +Protein M: Có trong vi rút trưởng thành ngoài tế bào.
Hạt vi rút trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt vi rút chưa trưởng thành khoảng 400 lần, vì vậy khả năng tiếp cận với vi rút dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra 6 sự sắp xếp lại các cấu trúc Oligo trên bề mặt hạt vi rút, do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của vi rút trưởng thành tới vật chủ [1, 12]. So sánh chuỗi axit amin tương đồng cho thấy, protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các vi rút thuộc nhóm Flavivirus. Protein E liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của vi rút như chức năng bám dính, cảm thụ, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [1, 11, 12].
Các protein không cấu trúc (NS:nonstructural) NS1: Có trọng lượng phân tử 42-50 Kda, là một glycoprotein gồm 353-354 axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm. NS3: Có trọng lượng phân tử 67-70 Kda gồm 618-623 axit amin, có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit của nhóm Flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym protease và helicase[1, 13]. NS5: Có trọng lượng phân tử 104-106 Kda gồm 900-905 axit amin, có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit.
NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsit của RNA. NS2A, NS2B, NS4A & NS4B: Đều rất nhỏ, có tính bảo tồn kém trong chuỗi nucleotit, sự mã hóa của chúng có thể liên quan đến protein M. Trong quá trình vi rút phóng thích khỏi tế bào, protein PreM được tách ra nhờ enzym protease để thành protein trưởng thành và đây là thành phần có khả năng gây nhiễm của vi rút. Bộ gen của vi rút được bọc trong lớp lipit và protein E rồi hoàn thiện với protein C.
Protein E chịu trách nhiệm tấn công đến tế bào đích và hòa màng tế bào; chính protein E mang các kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa để tạo kháng thể trung hòa. Đây chính là tiêu chuẩn để chọn bất kỳ chủng dự tuyển nào cho sản xuất vắc xin VNNB. Vi rút VNNB được phân thành 5 kiểu gen (I-V) dựa trên cấu trúc gen vỏ (protein E) nhưng chỉ có 1 type huyết thanh được biết đến[14]. 7 Phương pháp phân biệt và nhận dạng kháng nguyên Theo các nghiên cứu cho thấy kháng nguyên của các Flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm vi rút có kháng nguyên quan hệ mật thiết và khăng khít với nhau đó là các vi rút gây bệnh sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và VNNB (Japanese encephalitis), do đó các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt.
Vì vậy,để phân biệt và nhận dạng kháng nguyên của các vi rút này sử dụng phản ứng trung hòa (NT) là nhậy nhất rồi đến phản ứng kết hợp bổ thể (CF) tiếp đến là phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF). Do đó việc đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin bằng kỹ thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50) trên tế bào; hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại Flavivirus và phân biệt với vi rút VNNB. Hiện nay sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR, với cặp mồi đặc hiệu, hoặc dùng phương pháp phân tích trình tự gen. có thể định loại được type vi rút trong các Flavivirus cũng như phân loại được các chủng vi rút VNNB khác nhau rất nhanh chóng và chính xác.
Sự nhân lên của vi rút trên tế bào Chu kỳ nhân lên của vi rút RNA Khi vi rút gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho vi rút thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp RNA[1, 15]. Sau đó sợi RNA được bộc lộ là RNA đơn polymerase để tạo thành RNA phân cực (-) bổ sung thành chuỗi RNA kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi RNA kép được làm khuôn để tổng hợp các sợi RNA mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc. RNA và protein của vi rút được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ.
Sự nhân lên của vi rút liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua mạng lưới Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virion mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới. 8 Sự nhân lên của vi rút trong tế bào Vi rút VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi(tế bào C6/36 muỗi Albobitus).Tế bào tiên phát gồm thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà.hay các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột hamster)[1].
Trong tế bào nuôi vi rút nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE. Hiệu giá vi rút đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và trong điều kiện thích hợp vi rút nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (tế bào C6/36, Vero và BHK21). Hình ảnh tổn thương tế bào được quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: Tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó. Có biểu hiện tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào.
Do đó hoạttính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm. Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản Dịch tễ sinh học phân tử tập trung khai thác khía cạnh di truyền, dựa trênsự so sánh trình tự nucleotide của một gen đích hoặc toàn bộ gen của các chủng vi rút VNNB được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau để dự đoán tình hình lưu hành dịch, giúp kiểm soát tốt nguy cơ dịch bệnh,đồng thời là cơ sở cho lựa chọn chủng trong sản xuất vắc xin… [2].