Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus PEDV trên lợn tại Hà Nội

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn pedv porcine, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Dương Thị Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) phân lập được từ các đàn lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DỊCH TIÊU CHẢY Ở LỢN YORKSHIRE (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS – PEDV) TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 11.1.1. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới
• 12. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.1. Đối tượng nghiên cứu
• 12.2. Nội dung nghiên cứu
• 12.3. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc
• 12.4. Phương pháp nghiên cứu
• 12.4.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
• 12.4.2. Phương pháp mổ khám
• 12.4.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
• 12.4.4. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
• 12.4.5. Phương pháp xử lý mẫu cho phân lập virus
• 12.4.6. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 12.4.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
• 12.4.8. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
• 12.4.9. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. Đặc tính sinh học
• 13.1.1. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dương tính với virus PEDV
• 13.1.2. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trường tế bào
• 13.1.3. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập được
• 13.1.4. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV
• 13.2. Đặc điểm gây bệnh
• 13.2.1. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV
• 13.2.2. Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 13.2.3. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PEDV và dịch tiêu chảy trên lợn tại Hà Nội

Virus PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nghiêm trọng ở lợn. Bệnh này đã xuất hiện tại nhiều quốc gia và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Tại Hà Nội, dịch tiêu chảy trên lợn do virus PEDV đã được ghi nhận từ năm 2008, ảnh hưởng đến nhiều đàn lợn, đặc biệt là giống Yorkshire. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus PEDV tại khu vực này.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PEDV

Virus PEDV thuộc họ Coronaviridae, có cấu trúc gen phức tạp với 28.033 nucleotide. Virus này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng ở lợn, đặc biệt là lợn con.

1.2. Tình hình dịch tiêu chảy trên lợn tại Hà Nội

Dịch tiêu chảy do virus PEDV đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn tại Hà Nội. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm tiêu chảy nặng, sút cân và tỷ lệ tử vong cao ở lợn con.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát dịch bệnh PEDV

Dịch bệnh PEDV đang trở thành một thách thức lớn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Việc kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều khó khăn do virus có khả năng lây lan nhanh và khó phát hiện. Các biện pháp phòng ngừa hiện tại chưa đủ hiệu quả để ngăn chặn sự bùng phát của dịch bệnh.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán virus PEDV

Việc chẩn đoán virus PEDV gặp khó khăn do triệu chứng lâm sàng tương tự với nhiều bệnh khác. Cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác và nhanh chóng để phát hiện virus kịp thời.

2.2. Tác động của dịch bệnh đến ngành chăn nuôi

Dịch bệnh PEDV đã gây ra thiệt hại kinh tế lớn cho các hộ chăn nuôi. Tỷ lệ tử vong cao và chi phí điều trị làm giảm lợi nhuận của ngành chăn nuôi lợn.

III. Phương pháp nghiên cứu virus PEDV gây dịch tiêu chảy trên lợn

Nghiên cứu virus PEDV được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phân lập virus, nuôi cấy tế bào và xác định hiệu giá virus. Các phương pháp này giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh của virus.

3.1. Phân lập virus PEDV từ mẫu lợn

Quá trình phân lập virus PEDV được thực hiện từ các mẫu lợn dương tính. Các chủng virus được phân lập sẽ được nuôi cấy trên môi trường tế bào Vero để đánh giá khả năng gây bệnh.

3.2. Xác định hiệu giá virus PEDV

Hiệu giá virus được xác định thông qua phương pháp TCID50, giúp đánh giá khả năng lây nhiễm của virus trong môi trường nuôi cấy tế bào.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy virus PEDV có khả năng gây bệnh cao, với các triệu chứng lâm sàng rõ rệt. Việc hiểu rõ về virus này sẽ giúp các bác sĩ thú y có phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả hơn.

4.1. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PEDV

Lợn mắc PEDV thường có triệu chứng như tiêu chảy nặng, sút cân và mệt mỏi. Các triệu chứng này cần được nhận diện sớm để có biện pháp can thiệp kịp thời.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả, cũng như các biện pháp điều trị và phòng ngừa dịch bệnh PEDV.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu virus PEDV là cần thiết để hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh của virus. Các kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp vào việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển vaccine hiệu quả và các phương pháp chẩn đoán nhanh để kiểm soát dịch bệnh PEDV.

5.2. Ý nghĩa của nghiên cứu đối với ngành chăn nuôi

Nghiên cứu virus PEDV không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn góp phần bảo vệ lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi, đảm bảo an toàn thực phẩm cho xã hội.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƢƠNG THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY TRÊN LỢN ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC ĐÀN LỢN YORKSHIRE NUÔI TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis Abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về dịch tiêu chảy ở lợn Yorkshire (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) trên thế giới và việt nam. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới. Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) ở Việt Nam. Hiểu biết về căn bệnh.

Hình thái cấu trúc. Tính chất nuôi cấy. Sức đề kháng. Hiểu biết về bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV).

Loài mắc bệnh. Lứa tuổi mắc bệnh. Đƣờng xâm nhập. Cơ chế sinh bệnh.

8 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Triệu chứng lâm sàng. Phòng và kiểm soát bệnh. Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức.

Định lƣợng virus. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Đặc tính sinh học. Đặc điểm gây bệnh. Địa điểm, thời gian nghiên cứu. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng. Phƣơng pháp mổ khám. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản.

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR. Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào. Phƣơng pháp phân lập virus trên môi trƣờng tế bào.

Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50. Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Đặc tính sinh học. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc.

32 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV. Đặc điểm gây bệnh chủ yếu của lợn mắc PEDV. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV.

Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn yorkshine mắc PEDV. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshine mắc PEDV. Kết luận và kiến nghị. 47 Tài liệu tham khảo.

48 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Micro lit CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecc’s Modified Eagle Medium ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal bovine serum IFA Indirect Immunofluorescense Assay IPMA Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGEV Transmissible Gastro Enteritis Virus RNA Ribonucleoic acid vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình. Kết quả của phản ứng RT-PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh PEDV. Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire theo từng địa phƣơng đƣợc chẩn đoán dƣơng tính với PEDV. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero.

Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc. Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV.

Bảng kết quả biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV. Biến đổi bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con theo mẹ mắc PEDV. 42 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc của Coronavirus (Kathryn V.

Cơ chế gây bệnh của PEDV. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR. Gen đƣợc khuếch đại một phần gen S (651bp). Tế bào Vero bình thƣờng.

Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích. Bệnh tích tế bào đang phát triển. Tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Bệnh tích tế bào ở 24h - PEDV – 03.

Bệnh tích tế bào ở 48h – PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 72h – PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 84h - PEDV - 03. Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy còm.

Lợn Yorkshire nôn mửa. Lợn Yorkshire nằm dồn đống. Phân dính hậu môn, chân. Phân lỏng màu vàng.

Phân màu xi măng. Ruột chứa dịch lỏng màu vàng. Thành ruột mỏng chứa đầy hơi. Hạch bẹn nông sƣng to.

Thận xuất huyết điểm. Phổi xuất huyết. Gan sƣng, túi mật căng. Biểu mô dạ dày đứt nát (HEx10).

Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10). Phổi sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10). Lông nhung ruột đứt nát (HE x 10). Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE x 40).

Thận sƣng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10). 45 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dƣơng Thị Hồng Tên Luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập được từ các đàn lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội”. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học và gây bệnh của các chủng virus PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nội dung : - Đặc tính sinh học + Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV.

+ Phân lập các chủng PEDV trên môi trƣờng tế bào. + Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập. + Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero. - Đặc điểm gây bệnh +Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus).

+Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus). +Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus ).  Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu : - Vật liệu + Nguyên liệu Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà Nội. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] + Hóa chất Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°), paraffin, PBS, DAB… Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecc’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), kháng sinh ( penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 pg/ml)), … + Máy móc dụng cụ Máy móc: Kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy chạy điện di, máy PCR, máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lò vi sóng, máy PCR , box vô trùng, tủ ấm 37°C/5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh -20°C, tủ lạnh -80°C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,… Dụng cụ sử dụng : Dao, kéo, panh kẹp, khay, eppendorf, bông cồn, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, panh, dao, kéo, cƣa, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm, lọ đựng formol 10%, bình nuôi cấy tế bào, khay 96 giếng, khay 24 giếng, đĩa lồng, pipet,… - Phƣơng pháp nghiên cứu + Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng + Phƣơng pháp mổ khám + Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản tiêu bản + Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT-PCR + Phƣơng pháp xử lý mẫu và phân lập virus + Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào + Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50 + Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể + Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận 1.

Đặc tính sinh học - Phân lập thành công 4 chủng virus PEDV từ 15 mẫu lợn đƣợc chẩn đoán dƣơng tính bằng với bệnh. Bệnh tích tế bào đặc trƣng đƣợc với các đám tế bào bị dung giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào, quan sát rõ bằng kính hiển vi soi ngƣợc.