Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus PEDV trên lợn tại Hà Nội

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn pedv porcine, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Dương Thị Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) phân lập được từ các đàn lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DỊCH TIÊU CHẢY Ở LỢN YORKSHIRE (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS – PEDV) TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 11.1.1. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới
• 12. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.1. Đối tượng nghiên cứu
• 12.2. Nội dung nghiên cứu
• 12.3. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc
• 12.4. Phương pháp nghiên cứu
• 12.4.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
• 12.4.2. Phương pháp mổ khám
• 12.4.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
• 12.4.4. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
• 12.4.5. Phương pháp xử lý mẫu cho phân lập virus
• 12.4.6. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 12.4.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
• 12.4.8. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
• 12.4.9. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. Đặc tính sinh học
• 13.1.1. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dương tính với virus PEDV
• 13.1.2. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trường tế bào
• 13.1.3. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập được
• 13.1.4. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV
• 13.2. Đặc điểm gây bệnh
• 13.2.1. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV
• 13.2.2. Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 13.2.3. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PEDV và dịch tiêu chảy trên lợn tại Hà Nội

Virus PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nghiêm trọng ở lợn. Bệnh này đã xuất hiện tại nhiều quốc gia và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Tại Hà Nội, dịch tiêu chảy trên lợn do virus PEDV đã được ghi nhận từ năm 2008, ảnh hưởng đến nhiều đàn lợn, đặc biệt là giống Yorkshire. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus PEDV tại khu vực này.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PEDV

Virus PEDV thuộc họ Coronaviridae, có cấu trúc gen phức tạp với 28.033 nucleotide. Virus này có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng ở lợn, đặc biệt là lợn con.

1.2. Tình hình dịch tiêu chảy trên lợn tại Hà Nội

Dịch tiêu chảy do virus PEDV đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn tại Hà Nội. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm tiêu chảy nặng, sút cân và tỷ lệ tử vong cao ở lợn con.

II. Vấn đề và thách thức trong việc kiểm soát dịch bệnh PEDV

Dịch bệnh PEDV đang trở thành một thách thức lớn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Việc kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều khó khăn do virus có khả năng lây lan nhanh và khó phát hiện. Các biện pháp phòng ngừa hiện tại chưa đủ hiệu quả để ngăn chặn sự bùng phát của dịch bệnh.

2.1. Khó khăn trong việc chẩn đoán virus PEDV

Việc chẩn đoán virus PEDV gặp khó khăn do triệu chứng lâm sàng tương tự với nhiều bệnh khác. Cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác và nhanh chóng để phát hiện virus kịp thời.

2.2. Tác động của dịch bệnh đến ngành chăn nuôi

Dịch bệnh PEDV đã gây ra thiệt hại kinh tế lớn cho các hộ chăn nuôi. Tỷ lệ tử vong cao và chi phí điều trị làm giảm lợi nhuận của ngành chăn nuôi lợn.

III. Phương pháp nghiên cứu virus PEDV gây dịch tiêu chảy trên lợn

Nghiên cứu virus PEDV được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phân lập virus, nuôi cấy tế bào và xác định hiệu giá virus. Các phương pháp này giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh của virus.

3.1. Phân lập virus PEDV từ mẫu lợn

Quá trình phân lập virus PEDV được thực hiện từ các mẫu lợn dương tính. Các chủng virus được phân lập sẽ được nuôi cấy trên môi trường tế bào Vero để đánh giá khả năng gây bệnh.

3.2. Xác định hiệu giá virus PEDV

Hiệu giá virus được xác định thông qua phương pháp TCID50, giúp đánh giá khả năng lây nhiễm của virus trong môi trường nuôi cấy tế bào.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy virus PEDV có khả năng gây bệnh cao, với các triệu chứng lâm sàng rõ rệt. Việc hiểu rõ về virus này sẽ giúp các bác sĩ thú y có phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả hơn.

4.1. Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PEDV

Lợn mắc PEDV thường có triệu chứng như tiêu chảy nặng, sút cân và mệt mỏi. Các triệu chứng này cần được nhận diện sớm để có biện pháp can thiệp kịp thời.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả, cũng như các biện pháp điều trị và phòng ngừa dịch bệnh PEDV.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu virus PEDV là cần thiết để hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh của virus. Các kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp vào việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển vaccine hiệu quả và các phương pháp chẩn đoán nhanh để kiểm soát dịch bệnh PEDV.

5.2. Ý nghĩa của nghiên cứu đối với ngành chăn nuôi

Nghiên cứu virus PEDV không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe đàn lợn mà còn góp phần bảo vệ lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi, đảm bảo an toàn thực phẩm cho xã hội.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tiêu chảy cấp tính trên lợn do virus Porcine Epidemic Diarrhea Virus gây ra là một trong những hiểm họa truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi, có thể gây tỷ lệ tử vong dao động từ 50% đến 100% ở đàn lợn con sơ sinh dưới 7 ngày tuổi. Kể từ khi xuất hiện lần đầu tại châu Âu vào thập niên 1970 và bùng phát tại Việt Nam từ đầu năm 2008, mầm bệnh này đã liên tục lây lan diện rộng, gây thiệt hại kinh tế hàng tỷ đồng mỗi năm cho các trang trại chăn nuôi công nghiệp tập trung.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm xuất phát từ thực tế rằng các chủng virus thực địa lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, đặc biệt trên giống lợn Yorkshire thuần và lai tại các vùng chăn nuôi trọng điểm, chưa được khảo sát đầy đủ về đặc tính sinh học, động lực nhân lên trên môi trường tế bào và các biến đổi bệnh lý đặc thù. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập các chủng virus thực địa từ lợn Yorkshire mắc bệnh, xác định hiệu giá virus và đánh giá hiệu ứng bệnh tích tế bào trên dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi, đồng thời mô tả chi tiết bệnh tích đại thể và vi thể nhằm chuẩn hóa cơ sở dữ liệu bệnh học.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai từ ngày 06/07/2015 đến ngày 31/08/2016 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thu thập 15 mẫu bệnh phẩm lợn Yorkshire tiêu chảy cấp từ 4 tỉnh thành phụ cận Hà Nội gồm Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Vĩnh Phúc. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp căn cứ để nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán lâm sàng đạt trên 95%, đồng thời tạo nguồn nguyên liệu giống virus đạt chuẩn phục vụ nghiên cứu điều chế vaccine phòng bệnh và chế tạo các bộ kít chẩn đoán nhanh cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết virus học phân tử và mô hình cơ chế bệnh sinh đường tiêu hóa ở động vật dạ dày đơn. Căn nguyên gây bệnh thuộc nhóm 1, giống Coronavirus, họ Coronaviridae, sở hữu hệ gen RNA chuỗi đơn dương có kích thước khoảng 28.033 nucleotide mã hóa các protein cấu trúc quan trọng gồm glycoprotein bề mặt Spike với khối lượng phân tử 180.000-200.000 Dalton và protein Nucleocapsid 57.000-58.000 Dalton.

Khung phân tích tập trung vào 3 khái niệm sinh học cốt lõi:

1. Hiệu ứng biến đổi bệnh lý tế bào: Hiện tượng tế bào chủ bị dung giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm và hình thành các thể hợp bào đa nhân đặc trưng khi bị virus xâm nhiễm.
2. Hiệu giá virus: Đo lường liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy nhằm biểu thị nồng độ và mật độ hạt virus sống.
3. Tỷ lệ nhiễm trùng bội số: Chỉ số định lượng tỷ lệ giữa hạt virus gây nhiễm và số lượng tế bào đích, đảm bảo tính chuẩn hóa khi theo dõi động lực sinh trưởng của các chủng virus khác nhau.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 15 cá thể lợn giống Yorkshire mắc hội chứng tiêu chảy cấp tại các trang trại thuộc Hà Nội (5 mẫu), Bắc Ninh (5 mẫu), Hưng Yên (3 mẫu) và Vĩnh Phúc (2 mẫu), bao gồm 15 mẫu ruột non và 15 mẫu phân tương ứng. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm ưu tiên những cá thể lợn sơ sinh và lợn con theo mẹ có triệu chứng lâm sàng điển hình chưa qua điều trị kháng sinh, đảm bảo thu giữ tối đa mật độ virus tự nhiên còn hoạt lực.

Quy trình phân tích kết hợp đồng bộ các kỹ thuật sinh học phân tử và bệnh học vi thể:

• Kỹ thuật RT-PCR: Sử dụng bộ kit tách chiết RNA chuyên dụng và cặp mồi đặc hiệu khuếch đại phân đoạn gen S có kích thước 651 bp qua 35 chu kỳ nhiệt, cho phép phát hiện căn nguyên nhanh chóng với độ nhạy cao.
• Phân lập và định lượng virus: Nuôi cấy trên tế bào Vero bổ sung Trypsin 10 µg/ml và dung môi Tryptose Phosphate Broth 0,3%; xác định hiệu giá virus theo công thức Reed-Muench trên hệ thống khay 96 giếng.
• Phương pháp mô bệnh học: Mổ khám theo tiêu chuẩn ngành TCVN-TC16-2005, xử lý mẫu bệnh phẩm qua hệ thống chuyển đúc tự động 12 bình hóa chất, đúc khối paraffin, cắt lát mỏng 2-3 µm bằng máy Microtome và nhuộm Hematoxylin-Eosin để quan sát cấu trúc vi thể dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 10X và 40X. Việc kết hợp RT-PCR với nuôi cấy tế bào và giải phẫu bệnh học giúp khẳng định chính xác tính tương đồng giữa sự hiện diện của bộ gen virus và tổn thương mô bào thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kết quả phản ứng RT-PCR xác định 100% (15/15) mẫu bệnh phẩm ruột và phân thu nhận từ lợn Yorkshire nghi mắc bệnh tại cả 4 địa phương đều dương tính với virus, cho vạch điện di sản phẩm DNA sắc nét đúng kích thước thiết kế 651 bp. Tỷ lệ phát hiện virus từ mẫu ruột non đạt 100%, chứng minh cơ quan tiêu hóa là đích định vị và nhân lên chủ yếu của mầm bệnh.

Thứ hai, nghiên cứu đã phân lập thành công 4 chủng virus thực địa trên dòng tế bào Vero qua 4 đời cấy truyền liên tiếp. Quá trình nhân lên của virus gây ra bệnh tích tế bào đặc trưng với hiện tượng tế bào trương phì, co cụm, dung giải màng và hình thành hợp bào đa nhân. Động lực học xuất hiện bệnh tích ở chủng PEDV-03 khởi phát sớm nhất sau 24 giờ gây nhiễm, phá hủy 30-50% diện tích tế bào sau 48 giờ, đạt 70-80% sau 60 giờ, đạt 100% sau 72 giờ và khiến toàn bộ tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi đáy bình nuôi cấy sau 84 giờ.

Thứ ba, hiệu giá virus của các chủng phân lập được xác định dao động từ 10^4.25 đến 10^5.25 TCID50/25µl. Trong đó, chủng PEDV-03 đạt hiệu giá cao nhất là 10^5.25 TCID50/25µl, tiếp theo là chủng PEDV-01 đạt 10^4.74 TCID50/25µl, và thấp nhất là chủng PEDV-02 với 10^4.25 TCID50/25µl.

Thứ tư, về bệnh cảnh lâm sàng và bệnh lý giải phẫu, 100% lợn con theo mẹ biểu hiện ỉa chảy dữ dội với phân lỏng màu vàng, 80,00% gầy còm sút cân nhanh chóng và 46,67% có biểu hiện nằm chồng đống trên bụng mẹ. Khi mổ khám, 100% cá thể có thành ruột non mỏng trong suốt chứa đầy dịch vàng và khí gas, 100% dạ dày ứ đọng sữa đông vón không tiêu, và 86,67% gan sưng kèm túi mật căng phồng chứa dịch mật đặc. Về mặt vi thể, tổn thương sung huyết chiếm 100% ở hạch ruột và 80,00% ở ruột non, dạ dày, phổi; hiện tượng teo đứt lông nhung ruột non làm tỷ lệ chiều cao trên độ dày lông nhung sụt giảm mạnh từ mức bình thường 7:1 xuống chỉ còn 3:1.

Thảo luận kết quả

Sự tổn thương bào mòn hệ thống vi nhung mao ruột non và suy giảm tỷ lệ chiều dài lông nhung xuống 3:1 giải thích rõ ràng cơ chế gây giảm hoạt tính của các enzyme bề mặt biểu mô ruột, dẫn tới hội chứng kém hấp thu cấp tính, mất nước cơ thể trầm trọng và gây tử vong nhanh chóng ở lợn sơ sinh. Việc phân lập thành công 4 chủng virus trên tế bào Vero với sự hiện diện của Trypsin 10 µg/ml củng cố các kết luận kinh điển trên thế giới về vai trò của enzyme phân giải protein trong việc kích hoạt thụ thể xâm nhập của Coronavirus.

Để trực quan hóa các phát hiện nghiên cứu, dữ liệu diễn tiến bệnh tích tế bào theo thời gian từ 12 đến 96 giờ có thể được trình bày thông qua biểu đồ đường đa trục nhằm so sánh tốc độ phá hủy tế bào giữa chủng PEDV-03 và các chủng còn lại. Đồng thời, bảng thống kê phân bố tỷ lệ tổn thương vi thể (sung huyết 80-100%, thâm nhiễm tế bào viêm 66,67-80%, thoái hóa thận 80%) có thể được cấu trúc thành biểu đồ cột xếp chồng nhằm đối chiếu rõ nét mức độ biến đổi bệnh lý giữa các cơ quan phủ tạng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán RT-PCR nhanh: Thiết lập quy trình chẩn đoán phân tử RT-PCR sử dụng cặp mồi PS1/PS2 nhắm vào đoạn gen S kích thước 651 bp tại hệ thống phòng xét nghiệm thú y cấp tỉnh, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 4 giờ với độ chính xác đạt trên 98% ngay trong 24 giờ đầu khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy; chủ trì thực hiện bởi Chi cục Chăn nuôi và Thú y các địa phương trong thời gian 6 tháng tới.
2. Khai thác chủng virus thực địa sản xuất chế phẩm sinh học: Ứng dụng chủng virus PEDV-03 có hoạt lực nhân lên mạnh và hiệu giá cao đạt 10^5.25 TCID50/25µl để nghiên cứu làm giảm độc lực và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy quy mô lớn trên tế bào Vero; mục tiêu phát triển thành công lô vaccine nhược độc hoặc vô hoạt thử nghiệm đạt tỷ lệ bảo hộ trên 85% cho đàn lợn nái mang thai trong lộ trình 18 tháng, giao các Viện nghiên cứu thú y và doanh nghiệp dược thú y phối hợp thực hiện.
3. Áp dụng biện pháp tạo miễn dịch chủ động có kiểm soát: Triển khai phương pháp gây nhiễm đường miệng có kiểm soát bằng dịch nghiền ruột lợn bệnh đã xử lý kháng sinh Colistin cho toàn bộ đàn lợn nái mang thai trước khi sinh 3 đến 4 tuần nhằm kích thích kháng thể IgA truyền qua sữa đầu, giảm tỷ lệ chết ở lợn con từ mức 100% xuống dưới 15%; áp dụng ngay tại các trang trại lợn giống quy mô trên 500 nái dưới sự giám sát chặt chẽ của cán bộ thú y chuyên trách.
4. Nâng cấp quy trình an toàn sinh học và quản lý chuồng nuôi: Tăng cường phun khử trùng tiêu độc chuồng trại định kỳ bằng hóa chất sát trùng nồng độ chuẩn, kiểm soát nghiêm ngặt người và phương tiện ra vào, đồng thời duy trì nhiệt độ chuồng úm lợn con từ 30°C đến 32°C nhằm giảm thiểu tỷ lệ phơi nhiễm mầm bệnh xuống dưới 5% trong vòng 3 tháng áp dụng, chịu trách nhiệm bởi chủ cơ sở chăn nuôi và kỹ thuật viên trại.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ thú y lâm sàng và cán bộ chẩn đoán thú y cơ sở: Tiếp cận bộ tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng 3 bước và nhận diện chuẩn xác các bệnh tích mổ khám đặc trưng như thành ruột mỏng (100%) và dạ dày chứa sữa đông (100%), từ đó thiết lập phác đồ phân biệt nhanh với dịch tiêu chảy truyền nhiễm do TGEV hay Rotavirus.
2. Chủ trang trại và nhà quản lý cơ sở chăn nuôi lợn giống: Nắm vững quy trình quản lý đàn nái mang thai, kỹ thuật tạo miễn dịch chuồng nuôi và biện pháp chăm sóc lợn sơ sinh để nâng cao tỷ lệ sống của lợn con theo mẹ lên trên 85%.
3. Chuyên gia nghiên cứu virus học và công nghệ sinh học dược phẩm: Sử dụng nguồn dẫn liệu chi tiết về điều kiện nuôi cấy phân lập virus trên tế bào Vero bổ sung Trypsin và dữ liệu hiệu giá đạt 10^5.25 TCID50/25µl làm tiền đề cho các nghiên cứu giải trình tự gen Spike và phát triển sinh phẩm chẩn đoán.
4. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Thú y: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa dịch tễ học thực địa, sinh học phân tử hiện đại và kỹ thuật giải phẫu mô bệnh học trên động vật nông nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Virus PEDV gây thiệt hại nặng nề nhất ở lứa tuổi nào của đàn lợn? Bệnh gây tỷ lệ mắc 100% và tỷ lệ tử vong từ 50% đến 100% ở lợn con sơ sinh dưới 7 ngày tuổi do hệ miễn dịch chưa hoàn thiện và phụ thuộc hoàn toàn vào kháng thể mẹ truyền. Lợn con bị tiêu chảy phân vàng toàn nước, mất cân bằng điện giải và kiệt sức nhanh chóng. Ở lợn trên 7 ngày tuổi, tỷ lệ chết giảm dần xuống khoảng 30%.

2. Đoạn gen nào của virus PEDV được lựa chọn để khuếch đại trong phản ứng RT-PCR? Nghiên cứu sử dụng cặp mồi PS1/PS2 đặc hiệu để khuếch đại phân đoạn gen Spike có kích thước 651 bp. Gen S là vùng gen quy định glycoprotein bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết thụ thể và kích thích miễn dịch, mang lại độ đặc hiệu 100% khi giám định các mẫu bệnh phẩm phân và ruột.

3. Tại sao môi trường nuôi cấy tế bào Vero cần bổ sung enzyme Trypsin khi phân lập virus? Virus PEDV thực địa đòi hỏi sự hiện diện của enzyme Trypsin ở nồng độ 10 µg/ml để cắt đứt liên kết protein bề mặt, tạo điều kiện cho virus xâm nhập và dung hợp màng tế bào chủ. Nếu thiếu enzyme này, virus không thể nhân lên hiệu quả và không tạo ra các ổ bệnh tích tế bào điển hình.

4. Bệnh tích đại thể nào giúp nhận biết chính xác bệnh khi mổ khám lợn? Bệnh tích đặc trưng nhất ghi nhận ở 100% lợn mổ khám là thành ruột non mỏng trong suốt như màng bóng kính, chứa đầy dịch lỏng màu vàng và hơi. Kèm theo đó, 100% dạ dày chứa đầy sữa vón đông không tiêu do mất hoạt tính enzyme phân giải và 86,67% gan sưng, túi mật căng phồng.

5. Chủng virus phân lập nào thể hiện đặc tính sinh học ưu việt nhất trong nghiên cứu? Chủng PEDV-03 phân lập tại khu vực Hà Nội đạt hiệu lực sinh học cao nhất với hiệu giá 10^5.25 TCID50/25µl. Chủng này gây biến đổi tế bào sớm nhất sau 24 giờ và phá hủy hoàn toàn 100% lớp tế bào Vero sau 84 giờ nuôi cấy ở tỷ lệ nhiễm trùng bội số MOI 0,1.

Kết luận

• Xác định 100% (15/15) mẫu bệnh phẩm ruột và phân từ lợn Yorkshire mắc tiêu chảy cấp tại vùng phụ cận Hà Nội dương tính với virus PEDV thông qua RT-PCR đoạn gen S kích thước 651 bp.
• Phân lập thành công 4 chủng virus thực địa trên dòng tế bào Vero qua 4 đời cấy truyền với biểu hiện dung giải màng và tạo thể hợp bào rõ nét.
• Xác định hiệu giá virus dao động từ 10^4.25 đến 10^5.25 TCID50/25µl, trong đó chủng PEDV-03 có hoạt lực mạnh nhất khi phá hủy hoàn toàn tế bào sau 84 giờ gây nhiễm.
• Làm sáng tỏ các biến đổi bệnh lý đặc trưng với 100% thành ruột non mỏng chứa dịch vàng, 100% dạ dày ứ đọng sữa đông và tổn thương teo đứt lông nhung ruột non làm giảm tỷ lệ cấu trúc xuống mức 3:1.
• Cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu sinh học chuẩn mực phục vụ hiệu quả cho công tác chẩn đoán phân biệt và định hướng công nghệ sản xuất vaccine phòng bệnh PED tại Việt Nam.

Đóng góp chính của luận văn là đã chuẩn hóa quy trình phân lập, đánh giá đặc tính sinh học và lập bản đồ bệnh lý mô học chi tiết của các chủng virus PEDV lưu hành thực tế trên giống lợn Yorkshire. Trong giai đoạn 12-24 tháng tới, các cơ quan nghiên cứu cần tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen và thử nghiệm tiền lâm sàng các dạng vaccine phòng ngừa. Các cơ sở chăn nuôi và nhà quản lý thú y hãy chủ động áp dụng các giải pháp chẩn đoán và an toàn sinh học từ công trình này để bảo vệ bền vững đàn lợn giống và nâng cao hiệu quả kinh tế ngành chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƢƠNG THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY TRÊN LỢN ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC ĐÀN LỢN YORKSHIRE NUÔI TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis Abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về dịch tiêu chảy ở lợn Yorkshire (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) trên thế giới và việt nam. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới. Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) ở Việt Nam. Hiểu biết về căn bệnh.

Hình thái cấu trúc. Tính chất nuôi cấy. Sức đề kháng. Hiểu biết về bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV).

Loài mắc bệnh. Lứa tuổi mắc bệnh. Đƣờng xâm nhập. Cơ chế sinh bệnh.

8 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Triệu chứng lâm sàng. Phòng và kiểm soát bệnh. Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức.

Định lƣợng virus. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Đặc tính sinh học. Đặc điểm gây bệnh. Địa điểm, thời gian nghiên cứu. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng. Phƣơng pháp mổ khám. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản.

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR. Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào. Phƣơng pháp phân lập virus trên môi trƣờng tế bào.

Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50. Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Đặc tính sinh học. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc.

32 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV. Đặc điểm gây bệnh chủ yếu của lợn mắc PEDV. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV.

Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn yorkshine mắc PEDV. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshine mắc PEDV. Kết luận và kiến nghị. 47 Tài liệu tham khảo.

48 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Micro lit CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecc’s Modified Eagle Medium ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal bovine serum IFA Indirect Immunofluorescense Assay IPMA Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGEV Transmissible Gastro Enteritis Virus RNA Ribonucleoic acid vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình. Kết quả của phản ứng RT-PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh PEDV. Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire theo từng địa phƣơng đƣợc chẩn đoán dƣơng tính với PEDV. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero.

Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc. Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV.

Bảng kết quả biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV. Biến đổi bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con theo mẹ mắc PEDV. 42 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc của Coronavirus (Kathryn V.

Cơ chế gây bệnh của PEDV. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR. Gen đƣợc khuếch đại một phần gen S (651bp). Tế bào Vero bình thƣờng.

Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích. Bệnh tích tế bào đang phát triển. Tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Bệnh tích tế bào ở 24h - PEDV – 03.

Bệnh tích tế bào ở 48h – PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 72h – PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 84h - PEDV - 03. Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy còm.

Lợn Yorkshire nôn mửa. Lợn Yorkshire nằm dồn đống. Phân dính hậu môn, chân. Phân lỏng màu vàng.

Phân màu xi măng. Ruột chứa dịch lỏng màu vàng. Thành ruột mỏng chứa đầy hơi. Hạch bẹn nông sƣng to.

Thận xuất huyết điểm. Phổi xuất huyết. Gan sƣng, túi mật căng. Biểu mô dạ dày đứt nát (HEx10).

Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10). Phổi sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10). Lông nhung ruột đứt nát (HE x 10). Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE x 40).

Thận sƣng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10). 45 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dƣơng Thị Hồng Tên Luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập được từ các đàn lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội”. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học và gây bệnh của các chủng virus PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nội dung : - Đặc tính sinh học + Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV.

+ Phân lập các chủng PEDV trên môi trƣờng tế bào. + Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập. + Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero. - Đặc điểm gây bệnh +Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus).

+Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus). +Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus ).  Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu : - Vật liệu + Nguyên liệu Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà Nội. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] + Hóa chất Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°), paraffin, PBS, DAB… Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecc’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), kháng sinh ( penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 pg/ml)), … + Máy móc dụng cụ Máy móc: Kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy chạy điện di, máy PCR, máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lò vi sóng, máy PCR , box vô trùng, tủ ấm 37°C/5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh -20°C, tủ lạnh -80°C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,… Dụng cụ sử dụng : Dao, kéo, panh kẹp, khay, eppendorf, bông cồn, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, panh, dao, kéo, cƣa, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm, lọ đựng formol 10%, bình nuôi cấy tế bào, khay 96 giếng, khay 24 giếng, đĩa lồng, pipet,… - Phƣơng pháp nghiên cứu + Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng + Phƣơng pháp mổ khám + Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản tiêu bản + Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT-PCR + Phƣơng pháp xử lý mẫu và phân lập virus + Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào + Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50 + Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể + Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận 1.

Đặc tính sinh học - Phân lập thành công 4 chủng virus PEDV từ 15 mẫu lợn đƣợc chẩn đoán dƣơng tính bằng với bệnh. Bệnh tích tế bào đặc trƣng đƣợc với các đám tế bào bị dung giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào, quan sát rõ bằng kính hiển vi soi ngƣợc.