ĐẶT VẤN ĐỀ Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) thuộc họ Coronaviridae, giống Alphacoronavirus là nguyên nhân gây tiêu chảy cấp và mất nước trầm trọng ở lợn (Debouck & Pensaert, 1980; Stevenson & cs. Virus được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1971 tại một ổ dịch tiêu chảy cấp ở Anh. Tuy nhiên, đến năm 1977 sau vụ dịch nổ ra nghiêm trọng tại Bỉ thì virus được đặt tên Porcine epidemic diarrhea virus, chủng virus lưu hành ở Bỉ tại thời điểm đó được đặt tên PEDV- CV777 (Pensaert & De Bouck, 1978). Là một virus khó phân lập và thích nghi, nên đến năm 1988 virus mới được phân lập và nuôi cấy thích nghi thành công trên tế bào Vero với sự hỗ trợ của trypsin.
Dịch tiêu chảy do PEDV xảy ra rộng khắp ở châu Âu trong những năm 1970 đến năm 1980. Từ năm 1980 đến năm 1990 số ổ dịch giảm dần ở châu lục này. Năm 2013, một vụ dịch lớn xảy ra ở Mỹ (Wang & cs., 2014), sau đó dịch lan nhanh các nước có biên giới với Mỹ. Cũng từ năm 2013 phân tích di truyền cho thấy hầu hết virus phân lập ở châu Á và châu Mỹ thuộc nhóm virus mới nổi G2b, nằm ở nhánh khác hoàn toàn với chủng virus thuộc nhóm G1 thường dùng chế vắc xin trước đó (Lee, 2015).
Trong khi một số Quốc gia đã thành công trong nghiên cứu vắc xin PEDV vô hoạt từ PEDV chủng thực địa thuộc nhóm G2 (Collin & cs. Bệnh PED được xác định lần đầu tiên tại Việt Nam năm 2008. Virus được phân lập và được xác định có quan hệ gần với các chủng PEDV phân lập Trung Quốc (Toan & cs. Có 2 nhóm di truyền của PEDV ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ, trong đó nhóm mới nổi G2 chiếm ưu thế (Van T., 2020; Nguyễn Văn Giáp & cs.
PEDV là một virus dễ biến đổi, kể từ năm 2010, đã có sự biến đổi của PEDV tại thực địa so với các chủng vắc xin (Sun & cs. Do đó, dù chương trình dùng vắc xin PED đầy đủ trên lợn ở các cơ sở chăn nuôi, nhưng dịch tiêu chảy do PEDV vẫn xảy ra. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện tại, vắc xin thương mại chủ yếu là vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc dựa vào các chủng thuộc nhóm cổ điển như: CV777, DR13, SM98. Protein S của PEDV có vai trò kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể 1 c trung hòa, đồng thời giúp virus tiếp cận và xâm nhập vào tế vào vật chủ (Bosch & cs.
Do đó, phản ứng trung hòa là phương pháp gián tiếp đánh giá tình trạng miễn dịch chống lại PEDV (Oh & cs., 2005), với ngưỡng kháng thể trung hòa 5 log2 có khả năng bảo hộ chống lại virus công cường độc (Clement & cs. So với nhóm cổ điển, các chủng PEDV thuộc nhóm mới nổi được chứng minh đề kháng cao với interferon và virus không bị trung hòa hoàn toàn bởi kháng thể tạo ra bởi chủng PEDV cổ điển (Shin & Park, 2019). Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy đáp ứng miễn dịch tạo ra chỉ có khả năng bảo hộ đồng chủng. Do đó lựa chọn virus dùng nghiên cứu sản xuất vắc xin cần dựa trên chủng virus hiện lưu hành ở thực địa của mỗi quốc gia.
Nhằm góp phần nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của vắc xin và lựa chọn chủng virus trong công việc nghiên cứu sản xuất vắc xin để kiểm soát bệnh PED, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam”. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Nhằm xây dựng được phản ứng trung hòa virus PED thực địa để có công cụ đánh giá khả năng miễn dịch của các chủng PED - Nhằm đánh giá khả năng miễn dịch chéo của các chủng PEDV vắc xin và thực địa, từ đó khuyến cáo việc dùng vắc xin hiện tại và lưu ý trong sự chọn chủng virus để nghiên cứu vắc xin phù hợp thực địa. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI - Ý nghĩa khoa học Là công cụ trong đánh giá lựa giống virus dùng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh PED. - Ý nghĩa thực tiễn + Xây dựng được phương pháp chẩn đoán huyết thanh học như VNT, ELISA dựa trên chủng lưu hành thực địa là công cụ đắc lực trong nghiên cứu miễn dịch của virus PED lưu hành thực địa; + Xác định đặc điểm của các chủng PEDV từ đó cung cấp nguồn thông tin hữu ích trong lựa chọn vắc xin phòng bệnh PEDV.
GIỚI HẠN ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu các chủng PEDV thực địa tại một số tỉnh miền Bắc, nhưng chưa có nguồn mẫu đại diện các vùng miền khác của Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PEDV 2. Đặc tính gây bệnh Bệnh PED thường xảy ra cấp tính và nghiêm trọng, lây nhiễm nhanh, nhiễm trên mọi lứa tuổi với triệu chứng tiêu chảy, nôn nhiều, phân chứa sữa không tiêu lợn cợn, lợn nằm trên bụng mẹ, chồng lên nhau, da khô, nằm bệt (Hình 2.
Tỉ lệ chết ở lợn con bú mẹ 80-90%, lợn 4 tuần tuổi tỉ lệ chết tới 40% (Sun & cs. Quan sát lâm sàng không thể phân biệt được bệnh do PEDV hay TGEV, chỉ phân biệt được khi kết hợp lâm sàng và chẩn đoán phòng thí nghiệm (RT-PCR và hóa miễn dịch). Mổ khám bệnh tích đại thể khi lợn mắc bệnh PED: phân màu vàng dính bết lông, da, con vật chết trong trạng thái mất nước, mắt hốc hác, da không đàn hồi, dịch dạ dầy chứa sữa đông, ruột non chứa sữa không tiêu màu trắng đến vàng, thành ruột non mỏng (Hình 2. Bằng cách làm tiêu bản vi thể, quan sát bệnh lý tế bào biểu mô có hiện tượng thoái hóa đầu lông nhung, villi bị co ngắn, virus khu trú ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột (Hình 2.
Đặc điểm bệnh lý của dịch PED được miêu tả tương tự ở các nước thuộc châu Á như Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam (Huang & cs. Nguồn: Song & cs. (2015) Ghi chú: Hình 2. Lợn dưới 1 tuần tuổi bị mất nước nghiêm trọng.
Lợn nằm chồng lên nhau Hình 2. Biểu hiện lâm sàng của lợn nhiễm PEDV ở Hàn Quốc năm 2015 4 c Nguồn: Stevenson & cs. (2013) Ghi chú: Hình 2. Lợn 4 ngày tuổi của nông trang ở Mỹ năm 2013 nhiễm PEDV cấp tính.
Thành ruột mỏng, trong suốt, giãn. Tiêu bản ruột non nhuộm hóa miễn dịch, PEDV nhuộm màu nâu trong nguyên sinh, virus ở hầu hết tế bào biểu mô lông nhung ruột Hình 2. Bệnh tích đại thể và vi thể tại ruột của lợn nhiễm PEDV 2. Cơ chế sinh bệnh Virus thuộc họ Coronaviridae có tính hướng tế bào biểu bì của đường ruột và tế bào đại thực bào.
Đường lây nhiễm chính qua đường tiêu hóa. Nguồn virus chủ yếu từ phân, dịch nôn, thức ăn từ lợn trưởng thành mang trùng truyền PEDV vào lợn mẫn cảm (Dee & cs. Một con đường lây nhiễm khác, là con đường lây nhiễm qua khí dung, đích đến vẫn là tế bào biểu mô ruột. Khí dung đưa PEDV nhiễm vào tế bào biểu mô mũi (NEC), sau đó gắn kết tế bào T - CD3+, T- CD3+ mang virus theo hệ thống tuần hoàn tới các tế bào đích ở niêm mạc ruột (Hình 2.
Men porcine aminopeptidase N của lợn (pAPN) có sẵn trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non, nó được xác định như là thụ thể tế bào, protein S vùng S1 của PEDV tiếp cận thụ thể pAPN giúp PEDV xâm nhập vào tế bào vật chủ (Li & cs.4 mô phỏng sự xâm nhập của virus qua khí dung. 5 c Nguồn: Li & cs. (2018) Ghi chú: Cơ chế PEDV truyền qua đường không khí xâm nhập vào lợn, PEDV xâm nhập vào đường mũi, tế bào DCs có vai trò quan trọng giúp virus xâm nhập vào niêm mạc mũi và được vận chuyển bởi tế bào T- CD3+ truyền virus vào tế bào biểu mô ruột nhờ hệ thống tuần hoàn Hình 2. Virus truyền lây thông qua khí dung Nguồn: Li & cs.
(2018) Ghi chú: Kháng nguyên PEDV được nhuộm màu nâu (mũi tên) trong tế bào niêm mạc mũi Hình 2. PEDV xuất hiện trong tế bào biểu mô mũi 6 c Cơ chế PEDV xâm nhập, nhân lên của virus trong tế bào vật chủ, thực hiện vòng đời của PEDV trong tế bào, biểu diễn trong Hình 2.5 Nguồn: Changhee (2015) Ghi chú: Virus tiếp cận pAPN như thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột non, thực hiện quy trình nhân bản trong nguyên sinh chất, tạo virus thế hệ sau hoàn chỉnh trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào. Cơ chế xâm nhập và tăng sinh của PEDV trong tế bào vật chủ Hình 2. Mô tả chu kỳ nhân lên của PEDV, PEDV bám pAPN-một thụ thể bề mặt của tế bào vật chủ thông qua Protein S.
Protein S giúp cho virus tháo gỡ vỏ, bộ gen virus chui vào nguyên sinh chất của tế bào vật chủ. Mỗi mARN được phiên mã đầy đủ để cho protein đã được mã hóa ở ORF của đoạn mARN, các protein S, E và M được lồng vào trong thể Golgi của tế bào vật chủ. Protein N tương tác ARN tạo phức hợp ARN xoắn. Virus con được tạo thành trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào vật chủ qua màng, phát tán sang tế bào khác, tiếp tục chu kỳ mới (Changhee, 2015).
Chẩn đoán, xét nghiệm PEDV Chẩn đoán bệnh do PEDV không chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng bởi vì biểu hiện tiêu chảy giống các nguyên nhân khác gây tiêu chảy ở lợn. Chẩn đoán phân biệt là cần thiết để xác định PEDV trong phòng thí nghiệm. Nhiều kỹ thuật được phát triển và sử dụng để xác định PEDV trong bệnh phẩm, bao gồm miễn dịch huỳnh quang (IF), kỹ thuật hóa miễn dịch, kính hiển vi điện tử quan sát trực tiếp, in situ Hybridization, RT-PCR, phản ứng ELISA. Tuy nhiên, mỗi kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, thời gian xét nghiệm cũng khác 7 c nhau (Kim & cs.
RT-PCR phát hiện PEDV thường nhanh hơn các phương pháp khác và phân biệt được TGEV và PEDV. Phát triển kỹ thuật RT- PCR và multiplex RT-PCR xác định PEDV: độ nhạy và độ đặc hiệu và hiệu quả cao khi sự xuất hiện ngày càng đa dạng các virus gây bệnh ở dạ dày ruột cấp tính ở lợn (Song & cs. Sự thích nghi virus trên tế bào Mặc dù PEDV được phát hiện năm 1971, đến năm 1977 mới được đặt tên PEDV, tuy nhiên đến năm 1988 virus mới được phân lập, nuôi cấy thích nghi bởi tác giả Hofmann. Sự thích nghi virus trên tế bào và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã được thử trên các loại tế bào tiên phát (primary cells) và tế bào dòng (cell lines).