Luận văn thạc sĩ nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại việt nam

Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và chủng virus tiêu chảy dịch tễ heo tại Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bích
• Người hướng dẫn: TS. Chu Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú Y
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Miễn Dịch Chéo Giữa Các Chủng Virus Tiêu Chảy Dịch Tễ Lợn Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 8. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 9. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI
• 10. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PEDV
• 11.1.1. Đặc tính gây bệnh
• 11.1.2. Cơ chế sinh bệnh
• 11.1.3. Chẩn đoán, xét nghiệm PEDV
• 11.1.4. Sự thích nghi virus trên tế bào
• 11.2. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV
• 11.2.1. Cấu trúc di truyền liên quan đến dịch tễ học phân tử của PEDV
• 11.3. ĐẶC ĐIỂM MIỄN DỊCH CỦA PEDV
• 11.3.1. Tìm hiểu cấu trúc PEDV liên quan đặc tính miễn dịch của virus PED
• 11.3.2. Phản ứng của vật chủ với sự nhiễm PEDV
• 11.3.3. Vắc xin phòng bệnh PED
• 11.3.4. Phản ứng chéo huyết thanh học
• 11.4. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
• 11.4.1. Phản ứng trung hòa virus
• 11.4.2. Phát hiện kháng thể bằng phản ứng ELISA
• 12. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 12.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 12.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
• 12.3. Virus PED dùng trong nghiên cứu
• 12.4. Hóa chất, sinh phẩm trong nghiên cứu
• 12.5. Vật tư và thiết bị
• 12.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.6.1. Phương pháp RT-PCR
• 12.6.2. Phương pháp giám định genogroup của PEDV
• 12.6.3. Phương pháp thử độc lực của PEDV trên lợn con theo mẹ
• 12.6.4. Phương pháp xác định hiệu giá PEDV trên tế bào Vero
• 12.6.5. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV
• 12.6.6. Phương pháp miễn dịch mỗi chủng PEDV trên thỏ
• 12.6.7. Phương pháp thiết lập phản ứng trung hòa PEDV
• 12.6.8. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa virus
• 12.6.9. Phương pháp phản ứng trung hòa chéo giữa các chủng virus
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. LỰA CHỌN CHỦNG PEDV DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 13.1.1. Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus
• 13.1.2. Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV
• 13.1.3. Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa
• 13.2. KẾT QUẢ THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRUNG HÒA PEDV
• 13.2.1. Kết quả tối ưu môi trường dùng trong phản ứng trung hòa
• 13.2.2. Tối ưu cách đánh giá kết quả của phản ứng trung hòa
• 13.3. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHẢN ỨNG TRUNG HÒA
• 13.3.1. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
• 13.3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa trên nền mẫu chuẩn QC
• 13.3.3. Phản ứng trung hòa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
• 13.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MIỄN DỊCH CHÉO GIỮA CÁC CHỦNG
• 13.4.1. Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
• 13.4.2. Đánh giá khả năng trung hòa chéo giữa các chủng PEDV
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Miễn Dịch Chéo PEDV Tại Việt Nam

Bệnh tiêu chảy dịch tễ lợn (PED) do virus tiêu chảy dịch tễ lợn (PEDV) gây ra, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh đặc trưng bởi tiêu chảy, nôn mửa và mất nước nghiêm trọng, đặc biệt ở lợn con theo mẹ. Tỷ lệ chết có thể lên đến 80-90% ở lợn con. PEDV thuộc họ Coronaviridae, giống Alphacoronavirus. Virus này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1971 tại Anh và sau đó lan rộng ra nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Việt Nam, bệnh PED được ghi nhận lần đầu vào năm 2008. Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự biến đổi di truyền của PEDV tại thực địa so với các chủng vắc xin cổ điển, làm giảm hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Do đó, việc nghiên cứu miễn dịch chéo PEDV giữa các chủng virus là rất quan trọng để lựa chọn vắc xin phù hợp và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Miễn Dịch Chéo PEDV

Nghiên cứu miễn dịch chéo PEDV giúp đánh giá khả năng bảo vệ của vắc xin hiện tại trước các biến chủng PEDV Việt Nam đang lưu hành. Điều này rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả phòng bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Việc hiểu rõ về sự khác biệt giữa các chủng PEDV cũng giúp các nhà khoa học lựa chọn chủng virus phù hợp để phát triển vắc xin mới, có khả năng bảo vệ rộng hơn.

1.2. Mục Tiêu Và Phạm Vi Của Nghiên Cứu PEDV

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng vắc xin và các chủng thực địa đang lưu hành tại Việt Nam. Mục tiêu chính là xây dựng phản ứng trung hòa virus (VNT) để đánh giá kháng thể PEDV và tế bào miễn dịch PEDV, từ đó đưa ra khuyến cáo về việc sử dụng vắc xin và lựa chọn chủng virus phù hợp cho nghiên cứu và sản xuất vắc xin. Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong việc kiểm soát bệnh PED tại Việt Nam.

II. Thách Thức Trong Phòng Bệnh Tiêu Chảy Dịch Tễ Lợn PEDV

Mặc dù đã có vắc xin phòng bệnh PED, nhưng dịch bệnh vẫn xảy ra thường xuyên, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Một trong những nguyên nhân chính là sự biến đổi di truyền của virus PEDV, dẫn đến sự khác biệt về độc lực của virus PEDV và khả năng lây lan của virus PEDV giữa các chủng. Các chủng PEDV mới nổi có thể kháng lại interferon và không bị trung hòa hoàn toàn bởi kháng thể tạo ra từ các chủng vắc xin cổ điển. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc lựa chọn vắc xin và phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả.

2.1. Sự Biến Đổi Di Truyền Của Virus PEDV Và Ảnh Hưởng

Sự biến đổi di truyền của virus PEDV dẫn đến sự xuất hiện của các biến chủng PEDV Việt Nam mới, có khả năng né tránh hệ miễn dịch tạo ra bởi vắc xin. Điều này làm giảm hiệu quả bảo vệ của vắc xin và gây ra các vụ dịch PED trên lợn đã được tiêm phòng. Việc giải trình tự gene PEDV và phân tích tương đồng di truyền giữa các chủng PEDV là rất quan trọng để theo dõi sự biến đổi của virus và đánh giá nguy cơ dịch bệnh.

2.2. Hiệu Quả Vắc Xin Và Khả Năng Bảo Vệ Chéo PEDV

Các vắc xin PEDV hiện tại chủ yếu dựa trên các chủng virus cổ điển, có thể không cung cấp đủ khả năng bảo vệ chéo PEDV trước các chủng virus mới nổi. Việc đánh giá hiệu quả vaccine PEDV và khả năng bảo vệ chéo PEDV là rất quan trọng để lựa chọn vắc xin phù hợp và phát triển các chiến lược tiêm phòng hiệu quả. Các nghiên cứu về phản ứng miễn dịch PEDV và phản ứng chéo huyết thanh học cũng giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bảo vệ của vắc xin.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Miễn Dịch Chéo PEDV Phản Ứng Trung Hòa

Phản ứng trung hòa (VNT) là một phương pháp quan trọng để đánh giá khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng virus. Phương pháp này dựa trên khả năng của kháng thể trong huyết thanh hoặc sữa đầu để trung hòa virus, ngăn chặn virus xâm nhập và gây nhiễm tế bào. VNT được sử dụng để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa, một chỉ số quan trọng để đánh giá tình trạng miễn dịch của lợn đối với virus PEDV. Phương pháp này cũng được sử dụng để đánh giá khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng vắc xin và các chủng thực địa.

3.1. Thiết Lập Và Tối Ưu Hóa Phản Ứng Trung Hòa PEDV

Việc thiết lập và tối ưu hóa phản ứng trung hòa virus tiêu chảy dịch tễ lợn (PEDV) là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm loại tế bào sử dụng, nồng độ virus, thời gian ủ và cách đánh giá kết quả. Việc sử dụng các mẫu chuẩn QC (Quality Control) giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả VNT.

3.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Phản Ứng

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai chỉ số quan trọng để đánh giá giá trị sử dụng của phản ứng trung hòa. Độ nhạy thể hiện khả năng của phương pháp để phát hiện kháng thể trung hòa trong các mẫu dương tính, trong khi độ đặc hiệu thể hiện khả năng của phương pháp để phân biệt giữa các mẫu dương tính và âm tính. Việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa giúp đảm bảo tính ứng dụng của phương pháp trong thực tế.

3.3. Ứng Dụng Phản Ứng Trung Hòa Trong Nghiên Cứu PEDV

Phản ứng trung hòa được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu virus tiêu chảy dịch tễ lợn (PEDV) để đánh giá khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng virus, đánh giá hiệu quả của vắc xin và theo dõi sự biến đổi của virus. Phương pháp này cũng được sử dụng để xác định ngưỡng kháng thể trung hòa cần thiết để bảo vệ lợn khỏi bệnh PED.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đánh Giá Miễn Dịch Chéo Giữa Các Chủng PEDV

Nghiên cứu đã giám định được các chủng PEDV thực địa thuộc nhóm genogroup 2 và PEDV từ vắc xin nhược độc thuộc genogroup 1. Kết quả cho thấy các chủng PEDV đều có khả năng sinh kháng thể trung hòa trên thỏ sau 14 ngày miễn dịch kháng nguyên PEDV. Tuy nhiên, chủng PEDV từ vắc xin (gennogroup G1) chỉ trung hòa chéo một phần với các chủng thực địa (genogroup 2). Một trong số 4 chủng PEDV thực địa có khả năng trung hòa chéo với 3 chủng PEDV thực địa còn lại 100%.

4.1. Đặc Tính Sinh Học Và Hiệu Giá Của Các Chủng PEDV

Nghiên cứu đã xác định đặc tính sinh học và hiệu giá của các chủng PEDV được sử dụng trong nghiên cứu. Việc xác định độc lực của chủng PEDV thực địa giúp đánh giá khả năng gây bệnh của virus và lựa chọn chủng virus phù hợp cho nghiên cứu vắc xin.

4.2. Khả Năng Trung Hòa Chéo Giữa Các Chủng PEDV

Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể PEDV trung hòa của vắc xin PED nhược độc chỉ trung hòa chéo một phần với các chủng virus PED thực địa. Điều này cho thấy cần thiết phải sử dụng các chủng virus thực địa để phát triển vắc xin có khả năng bảo vệ rộng hơn.

4.3. Lựa Chọn Chủng PEDV Tiềm Năng Cho Nghiên Cứu Vắc Xin

Nghiên cứu đã lựa chọn được một chủng PEDV thực địa có tiềm năng trong việc chọn giống virus nghiên cứu sản xuất vắc xin. Chủng virus này có khả năng trung hòa chéo với nhiều chủng PEDV thực địa khác, cho thấy khả năng bảo vệ rộng hơn.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Giải Pháp Kiểm Soát Bệnh PEDV

Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng để lựa chọn vắc xin phù hợp và phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh PED hiệu quả. Việc sử dụng vắc xin dựa trên các chủng virus thực địa có thể cải thiện khả năng bảo vệ và giảm thiểu thiệt hại do bệnh PED gây ra. Ngoài ra, việc áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cải thiện sức đề kháng của lợn và quản lý đàn lợn cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh PED.

5.1. Lựa Chọn Vắc Xin Phù Hợp Dựa Trên Nghiên Cứu PEDV

Dựa trên kết quả nghiên cứu, người chăn nuôi nên lựa chọn vắc xin có chứa các chủng virus tương đồng với các chủng PEDV đang lưu hành tại địa phương. Việc tham khảo ý kiến của các chuyên gia thú y giúp đưa ra quyết định đúng đắn và đảm bảo hiệu quả phòng bệnh.

5.2. Các Biện Pháp An Toàn Sinh Học Trong Chăn Nuôi Lợn

Các biện pháp an toàn sinh học bao gồm vệ sinh chuồng trại, kiểm soát côn trùng và động vật gặm nhấm, sử dụng thuốc sát trùng và quản lý chất thải. Việc áp dụng các biện pháp này giúp giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm virus PEDV và các bệnh truyền nhiễm khác.

5.3. Cải Thiện Sức Đề Kháng Của Lợn Để Phòng Bệnh PEDV

Cải thiện sức đề kháng của lợn thông qua dinh dưỡng hợp lý, quản lý đàn lợn tốt và tiêm phòng đầy đủ giúp tăng cường khả năng chống lại virus PEDV. Việc cung cấp đủ dinh dưỡng cho lợn con theo mẹ và đảm bảo vệ sinh chuồng trại là rất quan trọng để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Miễn Dịch Chéo PEDV Tương Lai

Nghiên cứu đã góp phần làm sáng tỏ về khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng vắc xin và các chủng thực địa tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc lựa chọn vắc xin và phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh PED hiệu quả. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về sự biến đổi di truyền của virus PEDV, phát triển các vắc xin thế hệ mới và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng bệnh khác.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Về Miễn Dịch Chéo PEDV

Nghiên cứu đã xác định được sự khác biệt về khả năng bảo vệ chéo PEDV giữa các chủng vắc xin và các chủng thực địa. Kết quả cho thấy cần thiết phải sử dụng các chủng virus thực địa để phát triển vắc xin có khả năng bảo vệ rộng hơn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Virus Tiêu Chảy Dịch Tễ Lợn

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm nghiên cứu về cơ chế lây nhiễm và gây bệnh của virus PEDV, phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác, và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng bệnh mới.

6.3. Cập Nhật Thông Tin Về Tình Hình Dịch Bệnh PEDV

Việc cập nhật thông tin về tình hình dịch bệnh PEDV và các nghiên cứu mới nhất về virus PEDV là rất quan trọng để đưa ra các quyết định phòng bệnh hiệu quả. Người chăn nuôi nên thường xuyên theo dõi các báo cáo khoa học và tham gia các hội thảo về virus PEDV để cập nhật kiến thức và kinh nghiệm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tiêu chảy cấp ở lợn do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) gây ra là một trong những thách thức nghiêm trọng hàng đầu đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Bệnh có đặc tính lây lan rất nhanh qua đường tiêu hóa và khí dung, gây tỷ lệ tử vong từ 80% đến 90% ở lợn con theo mẹ dưới 1 tuần tuổi và khoảng 40% ở lợn 4 tuần tuổi do tình trạng mất nước cấp tính và tổn thương nghiêm trọng niêm mạc ruột. Mặc dù nhiều trang trại đã triển khai quy trình tiêm phòng vắc xin đầy đủ, các ổ dịch tiêu chảy cấp vẫn bùng phát liên tục. Nguyên nhân cốt lõi bắt nguồn từ sự sai khác kháng nguyên giữa các chủng vắc xin cổ điển và các chủng virus thực địa đang biến đổi mạnh mẽ.

Trước thực trạng đó, đề tài tập trung giải quyết vấn đề đánh giá tính tương đồng miễn dịch giữa chủng vắc xin và chủng thực địa nhằm tìm ra căn cứ khoa học cho công tác kiểm soát dịch bệnh. Mục tiêu cụ thể của công trình là xây dựng thành công phản ứng trung hòa virus (Virus Neutralization Test - VNT) trên tế bào Vero, đồng thời ứng dụng phản ứng này để đánh giá khả năng bảo hộ chéo giữa chủng PEDV vắc xin thuộc nhóm di truyền cổ điển với các chủng PEDV phân lập thực địa.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện từ tháng 6/2019 đến tháng 6/2020 tại Trung tâm kiểm nghiệm Công ty TNHH Dược Hanvet và Học viện Nông nghiệp Việt Nam, khảo sát trên 4 chủng PEDV thực địa thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Hải Dương, Hưng Yên và Hà Nam trong giai đoạn 2016 - 2018 cùng 1 mẫu vắc xin nhược độc thương mại. Kết quả của luận văn mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi cung cấp hệ thống chỉ số tương quan huyết thanh học r1, giúp các nhà sản xuất lựa chọn chính xác chủng giống virus có khả năng bảo hộ chéo toàn diện 100% để phát triển vắc xin thế hệ mới, thay thế cho các dòng vắc xin cũ chỉ đạt hiệu quả trung hòa tối đa 50%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học phân tử và miễn dịch học thú y đối với giống Alphacoronavirus, thuộc họ Coronaviridae. Khung lý thuyết trọng tâm bao gồm:

• Cấu trúc kháng nguyên và vai trò sinh học của Protein Spike (S): Glycoprotein S của PEDV gồm 1.383 đến 1.386 axit amin, đóng vai trò quyết định trong việc nhận diện thụ thể porcine aminopeptidase N (pAPN) trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non. Tiểu phần S1 chịu trách nhiệm gắn kết thụ thể và chứa các epitope trung hòa chính, trong khi tiểu phần S2 hỗ trợ quá trình dung hợp màng tế bào dưới sự hoạt hóa của enzyme trypsin.
• Lý thuyết tiến hóa di truyền và phân nhóm genogroup: PEDV được chia thành 2 nhóm di truyền chính: Genogroup 1 (G1 - dòng cổ điển như CV777, DR13, SM98) và Genogroup 2 (G2 - dòng mới nổi có độc lực cao phổ biến từ sau năm 2013). Sự đột biến, mất đoạn hoặc thay thế trên 10% axit amin tại vùng gen S làm thay đổi cấu trúc không gian của kháng nguyên, khiến kháng thể tạo ra từ chủng G1 không thể nhận diện và bất hoạt hoàn toàn chủng G2.
• Mô hình tương quan miễn dịch học huyết thanh (Serological Relatedness): Dựa trên công thức xác định hệ số quan hệ huyết thanh học r1 của Rweyemamu (1978). Giá trị r1 biểu thị tỷ số giữa hiệu giá kháng thể trung hòa đối với virus dị chủng và hiệu giá kháng thể trung hòa đối với virus đồng chủng. Tỷ số r1 tiệm cận 1,0 chứng minh hai chủng có tính tương đồng miễn dịch tuyệt đối, trong khi r1 dưới 0,5 phản ánh khả năng bảo hộ chéo kém.

Các khái niệm then chốt được chuẩn hóa trong nghiên cứu bao gồm: Bệnh tích tế bào (Cytopathogenic Effect - CPE), Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50), Phản ứng nhuộm hóa miễn dịch tế bào một lớp (Immunoperoxidase Monolayer Assay - IPMA), và Phản ứng trung hòa virus (VNT).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu: Nghiên cứu sử dụng 4 chủng virus PEDV thực địa (ký hiệu PEDV 0116, PEDV 0117, PEDV 0317, PEDV 0118) phân lập từ các ổ dịch tiêu chảy cấp tại miền Bắc Việt Nam (2016 - 2018) và 1 chủng PEDV vắc xin nhược độc thương mại. Cỡ mẫu đánh giá độc lực gồm 10 lợn con sơ sinh 1 ngày tuổi chưa bú sữa mẹ (chia thành 5 con đối chứng và 5 con gây nhiễm liều 10^4.0 TCID50/ml). Mô hình gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh chuẩn sử dụng thỏ New Zealand khỏe mạnh 3 tháng tuổi (3 con cho mỗi chủng virus, tiêm 3 mũi với liều tăng dần 1 ml, 2 ml, 4 ml cách nhau 7 ngày).
• Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn mẫu bệnh phẩm chủ đích từ lợn con mắc hội chứng tiêu chảy cấp điển hình tại các trang trại chưa từng sử dụng vắc xin hoặc tái phát dịch sau tiêm phòng, đảm bảo tính đại diện cho các vùng sinh thái chăn nuôi trọng điểm.
• Phương pháp phân tích và lý do lựa chọn:
  • Kỹ thuật Multiplex RT-PCR: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phân biệt chủng G1 (sản phẩm 685 bp), G2 (sản phẩm 669 bp) và phát hiện băng chung 817 bp; đồng thời loại trừ sự đồng nhiễm của Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV - 859 bp) và Rotavirus nhóm A (309 bp).
  • Chuẩn độ virus bằng IPMA: Thay vì chỉ quan sát CPE truyền thống vốn dễ nhầm lẫn do độc tính của trypsin làm bong tróc tế bào, việc nhuộm hóa miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng và cơ chất 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) cho phép định lượng chính xác hiệu giá virus dựa trên các tế bào bắt màu đỏ đặc hiệu trong nguyên sinh chất.
  • Phản ứng trung hòa VNT: Chuẩn hóa với liều virus cố định 100 TCID50/100 µl ủ cùng huyết thanh pha loãng bậc 2 trên đĩa nuôi cấy tế bào Vero 96 giếng, bổ sung trypsin nồng độ tối ưu 8 µg/ml.
  • Xử lý số liệu: Toàn bộ dữ liệu hiệu giá kháng thể, độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị r1 được thống kê và phân tích tương quan Pearson thông qua phần mềm Minitab 16.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã mang lại 4 phát hiện quan trọng có giá trị khoa học và thực tiễn cao:

• Sự thích nghi và gia tăng hiệu giá virus thực địa trên tế bào Vero: Cả 4 chủng virus PEDV thực địa sau khi cấy chuyển từ đời thứ 4 (P4) sang đời thứ 6 (P6) đều có sự gia tăng rõ rệt về hiệu giá sinh học. Chủng PEDV 0116 tăng từ 4,3 lên 5,7 log10 TCID50/ml; PEDV 0117 tăng từ 4,5 lên 5,9 log10 TCID50/ml; PEDV 0317 tăng từ 4,5 lên 5,7 log10 TCID50/ml; và chủng PEDV 0118 đạt hiệu giá cao nhất, tăng từ 4,7 lên 6,1 log10 TCID50/ml (tăng hơn 25 lần về mật độ hạt virus lây nhiễm).
• Đặc điểm di truyền phân tử thuần nhất của các chủng thực địa: Kết quả điện di sản phẩm Multiplex RT-PCR khẳng định 100% mẫu virus phân lập thực địa (4/4 chủng) thuộc nhóm genogroup G2 (xuất hiện đồng thời 2 vạch 817 bp và 669 bp), hoàn toàn âm tính với TGEV và Rotavirus. Ngược lại, chủng virus vắc xin đối chứng thuộc nhóm genogroup G1 cổ điển (xuất hiện 2 vạch 817 bp và 685 bp).
• Độc lực cao của chủng thực địa PEDV 0118: Thử nghiệm công cường độc trên lợn con 2 ngày tuổi không có kháng thể mẹ truyền cho thấy 100% cá thể nhóm thí nghiệm xuất hiện triệu chứng tiêu chảy phân vàng toàn nước sau 24 giờ, thành ruột mỏng trong suốt, nhung mao ruột teo ngắn nghiêm trọng sau 32 giờ gây nhiễm.
• Sự sai biệt lớn về khả năng bảo hộ chéo giữa chủng vắc xin và chủng thực địa: Kháng huyết thanh thỏ kháng chủng vắc xin G1 chỉ trung hòa chéo một phần các chủng thực địa G2 với chỉ số r1 dao động từ 0,25 đến 0,5 (chỉ đạt 25% - 50% hiệu lực so với đồng chủng). Đặc biệt, trong số 4 chủng thực địa, huyết thanh kháng chủng PEDV 0118 có khả năng trung hòa chéo hoàn toàn với 3 chủng thực địa còn lại với chỉ số r1 đạt tuyệt đối 1,0 (100%).

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt về hiệu giá trung hòa giữa chủng vắc xin G1 và các chủng thực địa G2 phản ánh rõ nét tác động của biến đổi cấu trúc protein S đối với đáp ứng miễn dịch dịch thể. Trong khi các nghiên cứu quốc tế tại Hàn Quốc và Trung Quốc ghi nhận các chủng biến thể G2b đề kháng mạnh mẽ với kháng thể tạo ra bởi chủng cổ điển CV777, dữ liệu của luận văn đã chứng minh thực trạng tương tự đang diễn ra tại các vùng chăn nuôi trọng điểm ở miền Bắc Việt Nam. Sự thay đổi axit amin tại các vùng quyết định kháng nguyên trên tiểu phần S1 làm suy giảm ái lực gắn kết của kháng thể vắc xin cổ điển, giải thích lý do vì sao đàn lợn nái đã tiêm phòng vắc xin G1 vẫn không thể truyền đủ lượng kháng thể bảo hộ cho lợn con qua sữa đầu.

Dữ liệu nghiên cứu về tính tương quan huyết thanh học có thể được hệ thống hóa trực quan thông qua bảng ma trận giá trị r1 giữa các cặp kháng nguyên - kháng thể và biểu đồ đường biểu diễn động thái hiệu giá kháng thể trung hòa từ ngày D0 đến ngày D42. Kết quả này đồng thuận với các công bố khoa học trước đây, đồng thời khẳng định việc ứng dụng kỹ thuật IPMA giúp khắc phục triệt để hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả khi đọc bệnh tích tế bào CPE trong môi trường có bổ sung enzyme trypsin 8 - 10 µg/ml. Phát hiện về chủng PEDV 0118 với chỉ số r1 = 1,0 mở ra triển vọng to lớn trong việc làm chủ nguồn giống virus bản địa phục vụ sản xuất vắc xin tương thích hoàn hảo với dịch tễ Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể:

• Chuyển giao và chuẩn hóa chủng giống sản xuất vắc xin: Khuyến nghị các doanh nghiệp dược phẩm thú y trong nước tiếp nhận và sử dụng chủng PEDV 0118 (genogroup G2) để làm chủng giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc hoặc vô hoạt nhũ dầu (với chất bổ trợ như ISA 201), đảm bảo đích hiệu giá kháng nguyên trước vô hoạt đạt tối thiểu 10^6.0 TCID50/ml trong lộ trình 12 đến 18 tháng tới.
• Điều chỉnh phác đồ tiêm phòng tại các cơ sở chăn nuôi: Khuyến cáo các chủ trang trại lợn nái ưu tiên lựa chọn các dòng vắc xin có chứa cấu trúc kháng nguyên nhóm G2 tương thích với thực địa. Áp dụng quy trình tiêm phòng cho lợn nái mang thai 2 mũi vào thời điểm 5 tuần và 3 tuần trước khi sinh, hướng tới mục tiêu đạt hiệu giá kháng thể trung hòa trong sữa đầu tối thiểu ≥ 5 log2 để bảo vệ 100% lợn con theo mẹ.
• Chuẩn hóa quy trình kiểm nghiệm chất lượng sinh phẩm thú y: Đề xuất Cục Thú y và các trung tâm kiểm nghiệm quốc gia ứng dụng phương pháp VNT trên nền tế bào Vero kết hợp nhuộm IPMA làm tiêu chuẩn vàng để đánh giá hiệu lực bảo hộ chéo của các lô vắc xin nhập khẩu và lưu hành nội địa trong vòng 6 tháng tới.
• Mở rộng mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử: Thiết lập chương trình tầm soát dịch bệnh định kỳ tại 100% các vùng chăn nuôi lợn tập trung trên cả nước giai đoạn 2021 - 2025, ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT-PCR và giải trình tự gen S nhằm phát hiện sớm các biến chủng mới phát sinh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn sâu rộng cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật - Thú y: Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu chi tiết về kỹ thuật nuôi cấy thích ứng PEDV trên tế bào Vero, quy trình bổ sung enzyme trypsin và phương pháp nhuộm hóa miễn dịch IPMA, làm tài liệu tham khảo cho các đề tài nghiên cứu chuyên sâu về virus học.
• Chuyên viên R&D tại các công ty sản xuất vắc xin sinh phẩm: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn từ khâu cô đặc kháng nguyên bằng PEG 6000, bất hoạt virus bằng Binary Ethyleneimine (BEI) đến việc định liều miễn dịch và đánh giá chỉ số kháng chéo r1 để chọn lọc giống sản xuất.
• Bác sĩ thú y thực hành và nhà quản lý trang trại chăn nuôi lợn: Giúp người phụ trách kỹ thuật hiểu rõ bản chất của sự thất bại vắc xin do lệch kháng nguyên G1/G2, từ đó xây dựng kế hoạch kiểm soát an toàn sinh học và lựa chọn sản phẩm tiêm phòng phù hợp nhất cho đàn lợn nái.
• Cán bộ kiểm nghiệm và cơ quan quản lý dược phẩm thú y: Sử dụng các tiêu chí kỹ thuật về độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng VNT và ELISA làm căn cứ xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia trong công tác cấp phép lưu hành vắc xin PED tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

• Phản ứng trung hòa virus (VNT) có ưu điểm gì vượt trội so với xét nghiệm ELISA thông thường?
  Phản ứng ELISA thông thường chủ yếu phát hiện kháng thể gắn kết (như IgG kháng protein N hoặc S) mà không phân biệt được kháng thể đó có chức năng tiêu diệt virus hay không. Ngược lại, VNT đo lường trực tiếp lượng kháng thể chức năng có khả năng khóa thụ thể và ngăn chặn virus xâm nhập vào tế bào sống, đạt độ tương đồng 84,2% và là tiêu chuẩn vàng để đánh giá mức độ bảo hộ thực tế.
• Tại sao lợn nái đã tiêm vắc xin PED cổ điển nhưng đàn lợn con vẫn bị tiêu chảy cấp tử vong cao?
  Hầu hết vắc xin thương mại truyền thống được sản xuất từ các chủng thuộc nhóm genogroup G1 (như CV777, DR13). Trong khi đó, các chủng virus lưu hành tại thực địa Việt Nam hiện nay thuộc nhóm genogroup G2 với sự đột biến trên 10% axit amin protein S. Sự sai khác này khiến kháng thể mẹ truyền chỉ đạt chỉ số trung hòa chéo tối đa r1 = 0,5, không đủ ngưỡng bảo vệ lợn con.
• Chủng virus PEDV 0118 có những đặc tính ưu việt gì để được đề xuất làm chủng giống sản xuất vắc xin?
  Chủng PEDV 0118 thích nghi rất tốt trên tế bào Vero ở đời P6 với hiệu giá cao đạt 6,1 log10 TCID50/ml, có độc lực mạnh gây bệnh tích điển hình trên lợn con và đặc biệt sở hữu khả năng trung hòa chéo 100% (chỉ số r1 = 1,0) đối với tất cả các chủng PEDV thực địa khác được khảo sát trong nghiên cứu.
• Vai trò cốt lõi của enzyme Trypsin trong quy trình nuôi cấy và xét nghiệm PEDV là gì?
  Trypsin đóng vai trò cắt phân tử protein S của PEDV thành hai tiểu phần chức năng S1 và S2, kích hoạt quá trình dung hợp màng giữa vỏ virus và màng tế bào vật chủ. Nồng độ trypsin tối ưu từ 8 đến 10 µg/ml trong môi trường duy trì là điều kiện bắt buộc để virus xâm nhập, nhân lên và tạo bệnh tích tế bào in vitro.
• Mức kháng thể trung hòa trong sữa đầu của lợn nái có ý nghĩa như thế nào đối với lợn con?
  Lợn con sơ sinh hoàn toàn không có kháng thể bẩm sinh qua nhau thai mà phụ thuộc 100% vào kháng thể mẹ truyền qua sữa đầu. Hàm lượng kháng thể trung hòa trong sữa đầu cao gấp tối thiểu 4 lần so với huyết thanh mẹ, trong đó IgG chiếm hơn 60% tổng lượng globulin, đóng vai trò tạo hàng rào miễn dịch niêm mạc ruột bảo vệ lợn con trong 7 ngày đầu đời.

Kết luận

• Xác định thành công 4 chủng virus PEDV phân lập tại miền Bắc Việt Nam (2016 - 2018) đều thuộc nhóm genogroup G2 mới nổi, trong khi chủng vắc xin nhược độc thương mại thuộc genogroup G1 cổ điển.
• Nuôi cấy thích nghi và nâng cao hiệu giá thành công 4 chủng virus thực địa trên tế bào Vero, đạt từ 5,7 đến 6,1 log10 TCID50/ml ở đời cấy chuyển thứ 6 (P6).
• Xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình phản ứng trung hòa virus (VNT) kết hợp kỹ thuật nhuộm hóa miễn dịch IPMA với nồng độ trypsin tối ưu 8 µg/ml.
• Chứng minh kháng thể kháng chủng vắc xin G1 chỉ trung hòa chéo một phần các chủng thực địa G2 với chỉ số r1 tối đa đạt 0,5 (50%).
• Tuyển chọn được chủng thực địa ưu tú PEDV 0118 sở hữu độc lực cao và khả năng bảo hộ chéo hoàn hảo 100% (chỉ số r1 = 1,0) với các chủng thực địa lưu hành.

Kế hoạch tiếp theo cần tập trung giải trình tự toàn bộ bộ gen của chủng PEDV 0118 và tiến hành thử nghiệm sản xuất lô vắc xin vô hoạt tiền lâm sàng trong vòng 12 tháng tới. Các doanh nghiệp và đơn vị quản lý cần nhanh chóng ứng dụng kết quả này để sớm đưa các dòng vắc xin phòng bệnh PED tương thích thực địa vào sản xuất đại trà, bảo vệ hiệu quả ngành chăn nuôi lợn Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) thuộc họ Coronaviridae, giống Alphacoronavirus là nguyên nhân gây tiêu chảy cấp và mất nước trầm trọng ở lợn (Debouck & Pensaert, 1980; Stevenson & cs. Virus được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1971 tại một ổ dịch tiêu chảy cấp ở Anh. Tuy nhiên, đến năm 1977 sau vụ dịch nổ ra nghiêm trọng tại Bỉ thì virus được đặt tên Porcine epidemic diarrhea virus, chủng virus lưu hành ở Bỉ tại thời điểm đó được đặt tên PEDV- CV777 (Pensaert & De Bouck, 1978). Là một virus khó phân lập và thích nghi, nên đến năm 1988 virus mới được phân lập và nuôi cấy thích nghi thành công trên tế bào Vero với sự hỗ trợ của trypsin.

Dịch tiêu chảy do PEDV xảy ra rộng khắp ở châu Âu trong những năm 1970 đến năm 1980. Từ năm 1980 đến năm 1990 số ổ dịch giảm dần ở châu lục này. Năm 2013, một vụ dịch lớn xảy ra ở Mỹ (Wang & cs., 2014), sau đó dịch lan nhanh các nước có biên giới với Mỹ. Cũng từ năm 2013 phân tích di truyền cho thấy hầu hết virus phân lập ở châu Á và châu Mỹ thuộc nhóm virus mới nổi G2b, nằm ở nhánh khác hoàn toàn với chủng virus thuộc nhóm G1 thường dùng chế vắc xin trước đó (Lee, 2015).

Trong khi một số Quốc gia đã thành công trong nghiên cứu vắc xin PEDV vô hoạt từ PEDV chủng thực địa thuộc nhóm G2 (Collin & cs. Bệnh PED được xác định lần đầu tiên tại Việt Nam năm 2008. Virus được phân lập và được xác định có quan hệ gần với các chủng PEDV phân lập Trung Quốc (Toan & cs. Có 2 nhóm di truyền của PEDV ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ, trong đó nhóm mới nổi G2 chiếm ưu thế (Van T., 2020; Nguyễn Văn Giáp & cs.

PEDV là một virus dễ biến đổi, kể từ năm 2010, đã có sự biến đổi của PEDV tại thực địa so với các chủng vắc xin (Sun & cs. Do đó, dù chương trình dùng vắc xin PED đầy đủ trên lợn ở các cơ sở chăn nuôi, nhưng dịch tiêu chảy do PEDV vẫn xảy ra. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện tại, vắc xin thương mại chủ yếu là vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc dựa vào các chủng thuộc nhóm cổ điển như: CV777, DR13, SM98. Protein S của PEDV có vai trò kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể 1 c trung hòa, đồng thời giúp virus tiếp cận và xâm nhập vào tế vào vật chủ (Bosch & cs.

Do đó, phản ứng trung hòa là phương pháp gián tiếp đánh giá tình trạng miễn dịch chống lại PEDV (Oh & cs., 2005), với ngưỡng kháng thể trung hòa 5 log2 có khả năng bảo hộ chống lại virus công cường độc (Clement & cs. So với nhóm cổ điển, các chủng PEDV thuộc nhóm mới nổi được chứng minh đề kháng cao với interferon và virus không bị trung hòa hoàn toàn bởi kháng thể tạo ra bởi chủng PEDV cổ điển (Shin & Park, 2019). Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy đáp ứng miễn dịch tạo ra chỉ có khả năng bảo hộ đồng chủng. Do đó lựa chọn virus dùng nghiên cứu sản xuất vắc xin cần dựa trên chủng virus hiện lưu hành ở thực địa của mỗi quốc gia.

Nhằm góp phần nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của vắc xin và lựa chọn chủng virus trong công việc nghiên cứu sản xuất vắc xin để kiểm soát bệnh PED, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam”. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Nhằm xây dựng được phản ứng trung hòa virus PED thực địa để có công cụ đánh giá khả năng miễn dịch của các chủng PED - Nhằm đánh giá khả năng miễn dịch chéo của các chủng PEDV vắc xin và thực địa, từ đó khuyến cáo việc dùng vắc xin hiện tại và lưu ý trong sự chọn chủng virus để nghiên cứu vắc xin phù hợp thực địa. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI - Ý nghĩa khoa học Là công cụ trong đánh giá lựa giống virus dùng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh PED. - Ý nghĩa thực tiễn + Xây dựng được phương pháp chẩn đoán huyết thanh học như VNT, ELISA dựa trên chủng lưu hành thực địa là công cụ đắc lực trong nghiên cứu miễn dịch của virus PED lưu hành thực địa; + Xác định đặc điểm của các chủng PEDV từ đó cung cấp nguồn thông tin hữu ích trong lựa chọn vắc xin phòng bệnh PEDV.

GIỚI HẠN ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu các chủng PEDV thực địa tại một số tỉnh miền Bắc, nhưng chưa có nguồn mẫu đại diện các vùng miền khác của Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PEDV 2. Đặc tính gây bệnh Bệnh PED thường xảy ra cấp tính và nghiêm trọng, lây nhiễm nhanh, nhiễm trên mọi lứa tuổi với triệu chứng tiêu chảy, nôn nhiều, phân chứa sữa không tiêu lợn cợn, lợn nằm trên bụng mẹ, chồng lên nhau, da khô, nằm bệt (Hình 2.

Tỉ lệ chết ở lợn con bú mẹ 80-90%, lợn 4 tuần tuổi tỉ lệ chết tới 40% (Sun & cs. Quan sát lâm sàng không thể phân biệt được bệnh do PEDV hay TGEV, chỉ phân biệt được khi kết hợp lâm sàng và chẩn đoán phòng thí nghiệm (RT-PCR và hóa miễn dịch). Mổ khám bệnh tích đại thể khi lợn mắc bệnh PED: phân màu vàng dính bết lông, da, con vật chết trong trạng thái mất nước, mắt hốc hác, da không đàn hồi, dịch dạ dầy chứa sữa đông, ruột non chứa sữa không tiêu màu trắng đến vàng, thành ruột non mỏng (Hình 2. Bằng cách làm tiêu bản vi thể, quan sát bệnh lý tế bào biểu mô có hiện tượng thoái hóa đầu lông nhung, villi bị co ngắn, virus khu trú ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột (Hình 2.

Đặc điểm bệnh lý của dịch PED được miêu tả tương tự ở các nước thuộc châu Á như Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam (Huang & cs. Nguồn: Song & cs. (2015) Ghi chú: Hình 2. Lợn dưới 1 tuần tuổi bị mất nước nghiêm trọng.

Lợn nằm chồng lên nhau Hình 2. Biểu hiện lâm sàng của lợn nhiễm PEDV ở Hàn Quốc năm 2015 4 c Nguồn: Stevenson & cs. (2013) Ghi chú: Hình 2. Lợn 4 ngày tuổi của nông trang ở Mỹ năm 2013 nhiễm PEDV cấp tính.

Thành ruột mỏng, trong suốt, giãn. Tiêu bản ruột non nhuộm hóa miễn dịch, PEDV nhuộm màu nâu trong nguyên sinh, virus ở hầu hết tế bào biểu mô lông nhung ruột Hình 2. Bệnh tích đại thể và vi thể tại ruột của lợn nhiễm PEDV 2. Cơ chế sinh bệnh Virus thuộc họ Coronaviridae có tính hướng tế bào biểu bì của đường ruột và tế bào đại thực bào.

Đường lây nhiễm chính qua đường tiêu hóa. Nguồn virus chủ yếu từ phân, dịch nôn, thức ăn từ lợn trưởng thành mang trùng truyền PEDV vào lợn mẫn cảm (Dee & cs. Một con đường lây nhiễm khác, là con đường lây nhiễm qua khí dung, đích đến vẫn là tế bào biểu mô ruột. Khí dung đưa PEDV nhiễm vào tế bào biểu mô mũi (NEC), sau đó gắn kết tế bào T - CD3+, T- CD3+ mang virus theo hệ thống tuần hoàn tới các tế bào đích ở niêm mạc ruột (Hình 2.

Men porcine aminopeptidase N của lợn (pAPN) có sẵn trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non, nó được xác định như là thụ thể tế bào, protein S vùng S1 của PEDV tiếp cận thụ thể pAPN giúp PEDV xâm nhập vào tế bào vật chủ (Li & cs.4 mô phỏng sự xâm nhập của virus qua khí dung. 5 c Nguồn: Li & cs. (2018) Ghi chú: Cơ chế PEDV truyền qua đường không khí xâm nhập vào lợn, PEDV xâm nhập vào đường mũi, tế bào DCs có vai trò quan trọng giúp virus xâm nhập vào niêm mạc mũi và được vận chuyển bởi tế bào T- CD3+ truyền virus vào tế bào biểu mô ruột nhờ hệ thống tuần hoàn Hình 2. Virus truyền lây thông qua khí dung Nguồn: Li & cs.

(2018) Ghi chú: Kháng nguyên PEDV được nhuộm màu nâu (mũi tên) trong tế bào niêm mạc mũi Hình 2. PEDV xuất hiện trong tế bào biểu mô mũi 6 c Cơ chế PEDV xâm nhập, nhân lên của virus trong tế bào vật chủ, thực hiện vòng đời của PEDV trong tế bào, biểu diễn trong Hình 2.5 Nguồn: Changhee (2015) Ghi chú: Virus tiếp cận pAPN như thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột non, thực hiện quy trình nhân bản trong nguyên sinh chất, tạo virus thế hệ sau hoàn chỉnh trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào. Cơ chế xâm nhập và tăng sinh của PEDV trong tế bào vật chủ Hình 2. Mô tả chu kỳ nhân lên của PEDV, PEDV bám pAPN-một thụ thể bề mặt của tế bào vật chủ thông qua Protein S.

Protein S giúp cho virus tháo gỡ vỏ, bộ gen virus chui vào nguyên sinh chất của tế bào vật chủ. Mỗi mARN được phiên mã đầy đủ để cho protein đã được mã hóa ở ORF của đoạn mARN, các protein S, E và M được lồng vào trong thể Golgi của tế bào vật chủ. Protein N tương tác ARN tạo phức hợp ARN xoắn. Virus con được tạo thành trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào vật chủ qua màng, phát tán sang tế bào khác, tiếp tục chu kỳ mới (Changhee, 2015).

Chẩn đoán, xét nghiệm PEDV Chẩn đoán bệnh do PEDV không chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng bởi vì biểu hiện tiêu chảy giống các nguyên nhân khác gây tiêu chảy ở lợn. Chẩn đoán phân biệt là cần thiết để xác định PEDV trong phòng thí nghiệm. Nhiều kỹ thuật được phát triển và sử dụng để xác định PEDV trong bệnh phẩm, bao gồm miễn dịch huỳnh quang (IF), kỹ thuật hóa miễn dịch, kính hiển vi điện tử quan sát trực tiếp, in situ Hybridization, RT-PCR, phản ứng ELISA. Tuy nhiên, mỗi kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, thời gian xét nghiệm cũng khác 7 c nhau (Kim & cs.

RT-PCR phát hiện PEDV thường nhanh hơn các phương pháp khác và phân biệt được TGEV và PEDV. Phát triển kỹ thuật RT- PCR và multiplex RT-PCR xác định PEDV: độ nhạy và độ đặc hiệu và hiệu quả cao khi sự xuất hiện ngày càng đa dạng các virus gây bệnh ở dạ dày ruột cấp tính ở lợn (Song & cs. Sự thích nghi virus trên tế bào Mặc dù PEDV được phát hiện năm 1971, đến năm 1977 mới được đặt tên PEDV, tuy nhiên đến năm 1988 virus mới được phân lập, nuôi cấy thích nghi bởi tác giả Hofmann. Sự thích nghi virus trên tế bào và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã được thử trên các loại tế bào tiên phát (primary cells) và tế bào dòng (cell lines).