Phân lập và xác định đặc tính sinh học của virus PEDV ở lợn nuôi tại Thái Nguyên và Hưng Yên

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu phân lập và xác định đặc tính sinh học của virus tiêu chảy dịch tễ ở lợn tại Thái Nguyên và Hưng Yên.

• Tác giả: Trần Thị Nhàn
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) ở lợn nuôi tại Thái Nguyên và Hưng Yên
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC HOẶC THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN LỢN (PEDV)
• 11.2. Hình thái cấu trúc và bộ gen virus
• 11.3. Các loại protein cấu trúc của PEDV
• 11.4. Đặc tính nuôi cấy của virus PED trên tế bào
• 11.5. Tính không đồng nhất
• 11.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài
• 11.6.1. Nghiên cứu trong nước
• 11.6.2. Nghiên cứu nước ngoài
• 11.7. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng PED trên thế giới và Việt Nam
• 11.7.1. Trên thế giới
• 11.7.2. Tại Việt Nam
• 12. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.1. Địa điểm nghiên cứu
• 12.2. Thời gian nghiên cứu
• 12.3. Đối tượng - Vật liệu nghiên cứu
• 12.4. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu
• 12.5. Môi trường, hóa chất
• 12.6. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm
• 12.7. Nội dung nghiên cứu
• 12.8. Phương pháp nghiên cứu
• 12.8.1. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu
• 12.8.2. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero
• 12.8.3. Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết
• 12.8.4. Phương pháp RT – PCR
• 12.8.5. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml)
• 12.8.6. Phương pháp kiểm tra tính độc
• 12.8.7. Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit
• 12.8.8. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus
• 12.8.9. Phương pháp giải trình tự gen
• 12.8.10. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn
• 13.2. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào Vero
• 13.3. Kết quả phân lập PEDV
• 13.4. Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập
• 13.5. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập
• 13.5.1. Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập
• 13.5.2. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập
• 13.5.3. Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED
• 13.6. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV
• 13.7. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV
• 13.8. Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus PEDV và tác động của nó ở lợn

Virus PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) là một loại virus RNA thuộc họ Coronaviridae, gây ra bệnh tiêu chảy cấp ở lợn. Bệnh này có thể gây tử vong cao, đặc biệt là ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Tại Việt Nam, virus này đã gây ra nhiều thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn. Nghiên cứu về virus PEDV là cần thiết để hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của nó và tìm ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PEDV

Virus PEDV có cấu trúc gen RNA đơn sợi, kích thước khoảng 28kb, với nhiều khung đọc mở (ORF) mã hóa cho các protein cấu trúc. Đặc tính sinh học của virus này bao gồm khả năng lây nhiễm cao và gây bệnh nặng cho lợn con.

1.2. Tình hình dịch bệnh PED tại Thái Nguyên và Hưng Yên

Tại Thái Nguyên và Hưng Yên, dịch bệnh PED đã bùng phát mạnh mẽ, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Việc nghiên cứu và phân lập virus PEDV từ thực địa là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu virus PEDV

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về virus PEDV, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phân lập và xác định các đặc tính sinh học của virus này. Sự biến đổi gen của virus và sự khác biệt giữa các chủng virus là một trong những vấn đề lớn.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập virus PEDV

Phân lập virus PEDV từ mẫu bệnh phẩm là một quá trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và điều kiện phòng thí nghiệm nghiêm ngặt. Nhiều mẫu bệnh phẩm không đạt yêu cầu do tạp nhiễm.

2.2. Sự biến đổi gen của virus PEDV

Virus PEDV có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển vắc-xin hiệu quả và quản lý dịch bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu virus PEDV hiệu quả

Để nghiên cứu virus PEDV, các phương pháp hiện đại như RT-PCR, nuôi cấy tế bào và giải trình tự gen được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định chính xác sự hiện diện và đặc tính của virus.

3.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ lợn con bị tiêu chảy và xử lý bằng kỹ thuật RT-PCR để xác định sự có mặt của virus PEDV. Quá trình này đảm bảo độ chính xác cao trong việc phân lập virus.

3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào Vero

Nuôi cấy tế bào Vero là phương pháp chính để phân lập virus PEDV. Tế bào Vero cho phép virus phát triển và sinh sản, từ đó thu thập được virus để nghiên cứu.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập thành công hai chủng virus PEDV từ mẫu bệnh phẩm. Những chủng này có khả năng gây bệnh cao và có thể được sử dụng để phát triển vắc-xin phòng bệnh.

4.1. Kết quả phân lập virus PEDV

Hai chủng virus PEDV đã được phân lập thành công từ mẫu bệnh phẩm, cho thấy hiệu giá virus đạt cao và không có tạp nhiễm. Điều này mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu sâu hơn về virus.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất vắc xin

Các chủng virus PEDV phân lập được sẽ là nguồn nguyên liệu quan trọng cho việc phát triển vắc-xin phòng bệnh tiêu chảy cấp ở lợn, giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu về virus PEDV là rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và phát triển vắc-xin hiệu quả. Các kết quả đạt được từ nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus PEDV

Nghiên cứu virus PEDV không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của virus mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các chủng virus PEDV mới và phát triển các vắc-xin hiệu quả hơn để bảo vệ đàn lợn khỏi dịch bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ NHÀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) Ở LỢN NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN VÀ HƯNG YÊN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày.

năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Văn Phan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày. năm 2018 Tác giả luận văn Trần Thị Nhàn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan.

ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.v Danh mục bảng biểu. vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn.

viii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học hoặc thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu. Giới thiệu chung về virus gây dịch tiêu chảy cấp trên lợn (PEDV). Hình thái cấu trúc và bộ gen virus.

Các loại protein cấu trúc của PEDV. Đặc tính nuôi cấy của virus PED trên tế bào. Tính không đồng nhất. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài.

Nghiên cứu trong nước. Nghiên cứu nước ngoài. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng PED trên thế giới và việt nam. Trên thế giới.

Tại Việt Nam. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Đối tượng -Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng - Nguyên liệu nghiên cứu .18 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Môi trường, hóa chất. Thiết bị, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập và xử lí mẫu. Phương pháp phân lập virus PED trên tế bào Vero.

Phương pháp kiểm tra vô trùng và thuần khiết. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá virus (TCID50/ml). Phương pháp kiểm tra tính độc.

Phương pháp chẩn đoán nhanh PEDV bằng PED-Ag test kit. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus. Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp xây dựng cây sinh học phân tử.

Kết quả và thảo luận. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV trên lợn. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero. Kết quả phân lập PEDV.

Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập. Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV phân lập. Khả năng thích nghi và gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập.

Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV. Kết quả so sánh tương đồng về nucleotide và axit amin.

Kết luận và kiến nghị .51 Tài liệu tham khảo .61 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DEPC Diethyl pyrocarbonate DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HY Hưng Yên MTV Một thành viên MOI Multiplicity of infection ORF Open reading frame PBS Phosphate buffered saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic acid RT - PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TCID50 Tissue culture infective dose 50 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGEV Transmissible gastroenteritis virus TN Thái Nguyên TNHH Trách nhiệm hữu hạn TSB Trypto-casein soy broth v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2. Chức năng của các loại protein cấu tạo PEDV. Danh mục các loại vắc - xin phòng bệnh PED đang lưu hành tại Việt Nam hiện nay. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA.

Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn độ hiệu giá virus PED. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính độc các chủng PEDV phân lập.

Trình tự mồi sử dụng giải trình tự gen S. Chu trình nhiệt của phản ứng RT - PCR nhân gen S. Danh sách mẫu bệnh phẩm dương tính với PEDV thuộc hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên. Kết quả phân lập PEDV trên tế bào Vero.

Kết quả kiểm tra tạp khuẩn và tạp nấm của 2 chủng PEDV. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn con sau khi uống PEDV với các liều khác nhau.

Mức độ tương đồng (dưới) và số nucleotide khác nhau giữa 2 chủng phân lập được và các chủng tham chiếu. Mức độ tương đồng (dưới) và số amino acid khác nhau giữa 2 chủng phân lập được và các chủng tham chiếu .48 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Sơ đồ tổ chức và cấu trúc hệ gen virus PED. Kỹ thuật kiểm tra PEDV bằng kít test nhanh.

Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Biểu hiện bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập được và kết quả giám định bằng kỹ thuật RT –PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm của 2 chủng PEDV phân lập với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn khác. Bệnh tích tế bào của PEDV qua các đời cấy truyền ở 24 giờ sau gây nhiễm.

Biểu đồ biểu thị hiệu giá chủng PEDV phân lập qua các đời cấy truyền. Đường biểu diễn tốc độ sinh trưởng của hai chủng virus PED phân lập theo thời gian. Bệnh tích tế bào theo thời gian. Một số dấu hiệu lâm sàng ghi nhận được trên lợn thí nghiệm.

Hình ảnh mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể ở lợn thí nghiệm sau khi gây nhiễm PEDV. Mối quan hệ di truyền giữa chủng PEDV/TN8/2016 và chủng PEDV/HY3/2015 với các chủng ham chiếu khác. Kết quả căn trình tự vùng COE. Kết quả căn trình tự các vùng quyết định kháng nguyên.

49 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Nhàn Tên luận văn: Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của chủng PEDV ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) tại Thái Nguyên và Hưng Yên Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA) Mục đích nghiên cứu - Phân lập được virus PED để khẳng định chắc chắn sự lưu hành của loại virus này tại Thái Nguyên và Hưng Yên. - Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus PED phân lập được. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập và xử lí mẫu. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập theo phương pháp hồi cứu.

Tức là chỉ sử dụng những mẫu đã được chẩn đoán dương tính với PEDV tại hai tỉnh Hưng Yên và Thái Nguyên từ năm 2015 -2017 bằng kỹ thuật RT – PCR và hiện đang còn lưu trữ tại Phòng thí nghiệm của Công ty TNHHMTV Avac Việt Nam. Mẫu được chọn, trước khi sử dụng cho phân lập virus đều được kiểm tra lại tình trạng mẫu bằng kỹ thuật RT –PCR để giám định lại sự có mặt của PEDV trong mẫu bệnh phẩm. Sau đó mẫu được nghiền hoặc đồng nhất thành huyễn dịch 10%, ly tâm và lọc qua màng lọc 0,45µm và sử dụng cho phân lập PEDV. - Phương pháp phân lập PEDV trên tế bào Vero - Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết + Phuơng pháp kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 + Phương pháp kiểm tra sự thuần khiết sử dụng kỹ thuật RT – PCR - Phương pháp chuẩn độ virus (TCID50/ml) - Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của virus - Phương pháp xác định tính độc của virus - Phương pháp giải trình tự gene - Phương pháp dựng cây sinh phát sinh chủng loại.

Kết quả chính và kết luận - Sau 5 đời cấy truyền mù trên môi trường tế bào vero, đã phân lập thành công 2 chủng virus PED (PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015) trong tổng số 22 mẫu bệnh viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phẩm thực địa. Hiệu giá virus thu được dao động từ 106 - 106,5 TCID50/ml. Cả 2 chủng virus đều đạt tiêu chuẩn vô trùng và thuần khiết không tạp nhiễm bất cứ vi sinh vật ngoại lai nào. - Kết quả nghiên cứu về đường cong sinh trưởng của hai chủng PEDV phân lập được trên môi trường tế bào cho thấy, với liều gây nhiễm MOI = 0,01, hiệu giá virus thu được đạt cao nhất sau 36 – 48 giờ gây nhiễm.

- Kết quả nghiên cứu về độc lực của virus trên động vật thí nghiệm cho thấy cả 2 chủng PEDV phân lập được đều có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm với những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của PED.