Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại việt nam

Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và chủng porcine epidemic diarrhea virus tại Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bích
• Người hướng dẫn: TS. Chu Thị Thanh Hương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú Y
• Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. THESIS ABSTRACT
• 7. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 8. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 9. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI
• 10. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PEDV
• 11.1.1. Đặc tính gây bệnh
• 11.1.2. Cơ chế sinh bệnh
• 11.1.3. Chẩn đoán, xét nghiệm PEDV
• 11.1.4. Sự thích nghi virus trên tế bào
• 11.2. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV
• 11.2.1. Cấu trúc di truyền liên quan đến dịch tễ học phân tử của PEDV
• 11.3. ĐẶC ĐIỂM MIỄN DỊCH CỦA PEDV
• 11.3.1. Tìm hiểu cấu trúc PEDV liên quan đặc tính miễn dịch của virus PED
• 11.3.2. Phản ứng của vật chủ với sự nhiễm PEDV
• 11.3.3. Vắc xin phòng bệnh PED
• 11.3.4. Phản ứng chéo huyết thanh học
• 11.4. TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
• 11.4.1. Phản ứng trung hòa virus
• 11.4.2. Phát hiện kháng thể bằng phản ứng ELISA
• 12. NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 12.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 12.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
• 12.3. Virus PED dùng trong nghiên cứu
• 12.4. Hóa chất, sinh phẩm trong nghiên cứu
• 12.5. Vật tư và thiết bị
• 12.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 12.6.1. Phương pháp RT-PCR
• 12.6.2. Phương pháp giám định genogroup của PEDV
• 12.6.3. Phương pháp thử độc lực của PEDV trên lợn con theo mẹ
• 12.6.4. Phương pháp xác định hiệu giá PEDV trên tế bào Vero
• 12.6.5. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng PEDV
• 12.6.6. Phương pháp miễn dịch mỗi chủng PEDV trên thỏ
• 12.6.7. Phương pháp thiết lập phản ứng trung hòa PEDV
• 12.6.8. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa virus
• 12.6.9. Phương pháp phản ứng trung hòa chéo giữa các chủng virus
• 13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 13.1. LỰA CHỌN CHỦNG PEDV DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 13.1.1. Xác định đặc tính sinh học và hiệu giá virus
• 13.1.2. Giám định tính thuần khiết của chủng PEDV
• 13.1.3. Xác định độc lực của chủng PEDV thực địa
• 13.2. KẾT QUẢ THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRUNG HÒA PEDV
• 13.2.1. Kết quả tối ưu môi trường dùng trong phản ứng trung hòa
• 13.2.2. Tối ưu cách đánh giá kết quả của phản ứng trung hòa
• 13.3. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHẢN ỨNG TRUNG HÒA
• 13.3.1. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu trên nền mẫu thực địa
• 13.3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng trung hòa trên nền mẫu chuẩn QC
• 13.3.3. Phản ứng trung hòa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
• 13.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MIỄN DỊCH CHÉO GIỮA CÁC CHỦNG
• 13.4.1. Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
• 13.4.2. Đánh giá khả năng trung hòa chéo giữa các chủng PEDV
• 14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus tiêu chảy dịch tễ ở lợn

Nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus tiêu chảy dịch tễ (PEDV) ở lợn tại Việt Nam là một chủ đề quan trọng trong ngành thú y. Virus PEDV gây ra dịch tiêu chảy cấp tính, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và năng suất của đàn lợn. Việc hiểu rõ khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng virus và vắc xin sẽ giúp cải thiện hiệu quả phòng bệnh và bảo vệ đàn lợn.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus PEDV và vắc xin

Virus PEDV thuộc họ Coronaviridae, gây ra bệnh tiêu chảy cấp tính ở lợn. Vắc xin hiện tại chủ yếu là vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc, nhưng vẫn cần nghiên cứu để xác định tính hiệu quả của chúng đối với các chủng virus thực địa.

1.2. Tình hình dịch bệnh PED tại Việt Nam

Dịch bệnh PED đã được xác định lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 2008. Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp với sự xuất hiện của nhiều chủng virus khác nhau, đòi hỏi cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong việc đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV

Đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV gặp nhiều thách thức. Sự biến đổi gen của virus và sự khác biệt giữa các chủng vắc xin và thực địa có thể ảnh hưởng đến hiệu quả miễn dịch. Việc xác định đúng chủng virus và vắc xin phù hợp là rất quan trọng.

2.1. Sự biến đổi gen của virus PEDV

Virus PEDV có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này làm cho việc phát triển vắc xin trở nên khó khăn hơn, vì vắc xin có thể không còn hiệu quả với các chủng mới.

2.2. Khó khăn trong việc xác định chủng virus thực địa

Việc phân lập và xác định các chủng virus thực địa là một thách thức lớn. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại cần được cải thiện để đảm bảo tính chính xác và độ nhạy cao.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV

Nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phản ứng trung hòa virus, ELISA và RT-PCR. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, cần được lựa chọn phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

3.1. Phản ứng trung hòa virus trong nghiên cứu

Phản ứng trung hòa virus là một phương pháp quan trọng để đánh giá khả năng miễn dịch. Phương pháp này giúp xác định khả năng kháng thể trung hòa virus trong huyết thanh lợn.

3.2. Sử dụng ELISA để phát hiện kháng thể

Phương pháp ELISA được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng PEDV trong mẫu huyết thanh. Đây là một công cụ hữu ích trong việc đánh giá tình trạng miễn dịch của đàn lợn.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng virus PEDV và vắc xin là có. Một số chủng vắc xin có khả năng trung hòa chéo với các chủng virus thực địa, điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất vắc xin.

4.1. Đánh giá khả năng trung hòa chéo giữa các chủng

Nghiên cứu đã xác định được một số chủng PEDV thực địa có khả năng trung hòa chéo với vắc xin. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển vắc xin hiệu quả hơn.

4.2. Ứng dụng thực tiễn từ kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc lựa chọn chủng virus để sản xuất vắc xin, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh cho đàn lợn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu vắc xin PEDV

Nghiên cứu khả năng miễn dịch chéo giữa vắc xin và virus PEDV là một lĩnh vực quan trọng cần được tiếp tục khai thác. Việc phát triển các vắc xin mới dựa trên các chủng virus thực địa sẽ giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

5.1. Tương lai của nghiên cứu vắc xin PEDV

Nghiên cứu cần tiếp tục để phát triển các vắc xin mới có khả năng bảo vệ tốt hơn trước các chủng virus mới nổi. Việc này sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh gây ra.

5.2. Khuyến nghị cho ngành chăn nuôi lợn

Ngành chăn nuôi cần áp dụng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả, bao gồm việc sử dụng vắc xin phù hợp và theo dõi tình hình dịch bệnh thường xuyên để đảm bảo sức khỏe cho đàn lợn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch tiêu chảy cấp ở lợn do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) gây ra là một trong những thách thức nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu và tại Việt Nam. Bệnh có đặc tính lây lan rất nhanh qua đường tiêu hóa và khí dung, gây tỷ lệ tử vong từ 80% đến 90% ở lợn con theo mẹ dưới 1 tuần tuổi và khoảng 40% ở lợn 4 tuần tuổi. Kể từ khi được phát hiện lần đầu tại Việt Nam vào năm 2008, virus liên tục biến đổi di truyền phức tạp. Mặc dù nhiều trang trại đã áp dụng quy trình tiêm phòng vắc xin đầy đủ, các đợt dịch tiêu chảy cấp vẫn tái bùng phát diện rộng do sự sai khác kháng nguyên giữa chủng vắc xin cổ điển và chủng thực địa mới nổi.

Trước thực trạng cấp bách đó, đề tài luận văn thạc sĩ ngành Thú y của tác giả Nguyễn Thị Bích tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã thực hiện: "Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam". Nghiên cứu được triển khai từ tháng 6/2019 đến tháng 6/2020 tại Trung tâm kiểm nghiệm dược và sinh phẩm Công ty TNHH Dược Hanvet (Hưng Yên). Mục tiêu trọng tâm là thiết lập thành công phản ứng trung hòa virus (Virus Neutralization Test - VNT) trên tế bào Vero đạt chuẩn phòng thí nghiệm GLP, từ đó đánh giá chính xác mức độ bảo hộ chéo giữa chủng vắc xin nhóm genogroup 1 và các chủng thực địa thuộc genogroup 2. Kết quả mang lại giá trị thực tiễn vượt trội khi xác định được chủng thực địa PEDV 0118 có tỷ lệ trung hòa chéo đạt 100% (chỉ số r1 = 1,0), tạo cơ sở khoa học then chốt để tuyển chọn giống virus sản xuất vắc xin đặc hiệu tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn xây dựng trên nền tảng phân loại của Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV 2012) và lý thuyết sinh học phân tử về Coronaviridae, thuộc chi Alphacoronavirus. Bộ gen của PEDV là sợi đơn ARN dương kích thước khoảng 28 kb mã hóa 4 protein cấu trúc chính gồm Spike (S), Envelope (E), Membrane (M) và Nucleocapsid (N). Trong đó, glycoprotein S đóng vai trò quyết định trong việc liên kết với thụ thể aminopeptidase N của lợn (pAPN) trên bề mặt niêm mạc ruột non và chứa các epitope kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa.

Về dịch tễ học phân tử, PEDV được chia thành hai nhóm gen chính: genogroup 1 (G1 - dòng cổ điển như CV777, DR13, SM98) và genogroup 2 (G2 - dòng mới nổi với hai phân nhóm G2a và G2b). Các nghiên cứu miễn dịch học chỉ ra rằng sự sai khác trên 10% axit amin ở vùng protein S1 có thể làm suy giảm nghiêm trọng khả năng bảo hộ chéo giữa các phân nhóm virus. Đề tài vận dụng mô hình định lượng miễn dịch học huyết thanh theo hướng dẫn của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE 2009) và áp dụng công thức tính hệ số tương quan huyết thanh học r1 của Rweyemamu để đo lường mức độ kháng chéo giữa virus dị chủng và đồng chủng.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 4 chủng PEDV phân lập thực địa tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2016-2018 (Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nam) và 1 chủng vắc xin nhược độc thương mại nhập khẩu nhóm G1. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 10 lợn con sơ sinh 1-2 ngày tuổi không bú sữa mẹ phục vụ thử độc lực (5 lợn đối chứng và 5 lợn gây nhiễm đường uống với 1 ml virus nồng độ 10^4.0 TCID50/ml), cùng 15 thỏ New Zealand khỏe mạnh 3 tháng tuổi (trọng lượng 1,6-2,0 kg) chia đều cho các lô tiêm kháng nguyên vô hoạt nhũ dầu ISA 201 với liều tăng dần (1 ml, 2 ml, 4 ml) ở hiệu giá 10^5.5 TCID50/ml để chế tạo kháng huyết thanh chuẩn.

Phương pháp chọn mẫu bệnh phẩm thực địa được thực hiện theo kỹ thuật chọn mẫu có chủ đích từ các đàn lợn con mắc tiêu chảy cấp điển hình. Virus được nuôi cấy và thích nghi trên dòng tế bào Vero (ATCC - CCL-81) với môi trường duy trì DMEM bổ sung 0,3% TBP, 0,02% Yeast Extract và trypsin ở nồng độ 8-10 µg/ml. Kỹ thuật multiplex RT-PCR với các cặp mồi chuyên biệt được sử dụng để giám định độ thuần khiết (loại trừ TGEV, Rotavirus) và định loại genogroup. Phản ứng trung hòa virus (VNT) cố định liều 100 TCID50/100µl kết hợp nhuộm hóa miễn dịch IPMA bằng cơ chất AEC được lựa chọn thay thế việc đọc bệnh tích tế bào (CPE) truyền thống, giúp nâng cao độ nhạy, tính khách quan và rút ngắn thời gian phân tích từ 72 giờ xuống còn 30 giờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kết quả multiplex RT-PCR xác định 100% (4/4) chủng virus phân lập thực địa (PEDV 0116, PEDV 0117, PEDV 0317, PEDV 0118) đều thuộc nhóm genogroup G2 mới nổi, trong khi mẫu virus vắc xin đối chứng thuộc nhóm genogroup G1 cổ điển. Cả 4 chủng thực địa đều đảm bảo tính thuần khiết sinh học, hoàn toàn âm tính với TGEV và Rotavirus.

Thứ hai, qua 6 đời cấy chuyển (P6) trên tế bào Vero, hiệu giá virus của các chủng thực địa tăng trưởng ổn định từ mức 10^4.3 - 10^4.7 TCID50/ml ở đời P4 lên đạt 10^5.7 - 10^6.1 TCID50/ml ở đời P6. Chủng PEDV 0118 đạt hiệu giá cao nhất là 10^6.1 TCID50/ml, thể hiện khả năng thích nghi tế bào vượt trội. Thử nghiệm độc lực in vivo trên lợn con sơ sinh khẳng định chủng PEDV 0118 có độc lực cao, gây tiêu chảy phân vàng toàn nước và bài thải virus qua phân chỉ sau 24-32 giờ gây nhiễm.

Thứ ba, phản ứng trung hòa chéo (VNT) ghi nhận kháng huyết thanh của chủng vắc xin G1 chỉ trung hòa chéo một phần các chủng thực địa G2 với chỉ số r1 cao nhất là 0,5 (tương đương giảm 50% hiệu lực bảo hộ so với đồng chủng). Đáng chú ý, kháng huyết thanh của chủng thực địa PEDV 0118 có khả năng trung hòa chéo hoàn toàn 100% với cả 3 chủng thực địa G2 còn lại với chỉ số r1 = 1,0, chứng minh phổ kháng nguyên bảo hộ bao phủ toàn diện.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện trên hoàn toàn phù hợp với quy luật tiến hóa kháng nguyên của Coronaviridae. Sự sai khác di truyền tại vùng gen S1 giữa phân nhóm G1 và G2 lý giải vì sao vắc xin cổ điển không bảo vệ hoàn toàn đàn lợn trước các chủng thực địa, khi mà "hiệu lực bảo hộ bị suy giảm tới một nửa". So sánh với các công bố quốc tế tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Mỹ, các chủng PEDV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có sự tương đồng di truyền từ 95,7% đến 98,2% với nhánh G2b châu Á. Điều này đòi hỏi kháng thể trung hòa dịch thể phải đạt ngưỡng bảo hộ tối thiểu 5 log2 (hoặc hiệu giá từ 1:20 trở lên) trong huyết thanh và sữa đầu lợn nái.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan chặt chẽ giữa giá trị mật độ quang OD450 của phản ứng ELISA và hiệu giá trung hòa VNT (với hệ số tương quan Pearson R = 0,837, độ tương đồng đạt 84,2%). Ngoài ra, bảng ma trận đối chuẩn chỉ số r1 giữa các cặp huyết thanh và virus cung cấp bằng chứng định lượng rõ ràng, khẳng định việc sử dụng chủng PEDV 0118 làm ứng viên sản xuất vắc xin bản địa sẽ mang lại hiệu quả phòng hộ vượt trội so với các dòng vắc xin nhập khẩu.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp chiến lược có tính ứng dụng cao cho ngành chăn nuôi thú y:

1. Tuyển chọn chủng giống sản xuất vắc xin bản địa: Các viện nghiên cứu thú y và doanh nghiệp dược phẩm cần sử dụng ngay chủng thực địa nhóm G2 (tiêu biểu là PEDV 0118) để phát triển vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc thế hệ mới. Mục tiêu hướng tới là nâng tỷ lệ bảo hộ thực địa cho lợn con theo mẹ đạt trên 85%, triển khai thực hiện trong lộ trình 12-24 tháng.
2. Chuẩn hóa quy trình kiểm nghiệm huyết thanh học bằng VNT: Cục Thú y và các trung tâm chẩn đoán quốc gia cần áp dụng quy trình phản ứng trung hòa virus kết hợp nhuộm IPMA trên tế bào Vero theo tiêu chuẩn GLP. Phương pháp này giúp rút ngắn thời gian kiểm nghiệm xuống dưới 36 giờ, đồng thời đạt độ đặc hiệu trên 95% khi đánh giá chất lượng vắc xin lưu hành.
3. Tối ưu hóa lịch tiêm phòng và kiểm soát kháng thể sữa đầu: Các chủ trang trại chăn nuôi lợn công nghiệp cần áp dụng lịch tiêm 3-4 mũi vắc xin cho nái mang thai vào tuần thứ 5 và tuần thứ 3 trước khi sinh. Mục tiêu đảm bảo hiệu giá kháng thể trung hòa trong sữa đầu đạt ngưỡng an toàn tối thiểu 1:20 trong suốt 72 giờ đầu sau khi sinh.
4. Mở rộng hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Cơ quan quản lý thú y địa phương cần phối hợp với các cơ sở đào tạo tổ chức lấy mẫu giám sát định kỳ 6 tháng/lần tại 100% các vùng chăn nuôi trọng điểm miền Bắc và miền Trung, nhằm cập nhật kịp thời các biến chủng tái tổ hợp mới của PEDV.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị tham khảo chuyên sâu và thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Các nhà khoa học và chuyên gia phát triển vắc xin: Cung cấp dữ liệu chi tiết về quy trình phân lập, thích nghi virus PEDV trên tế bào Vero với hàm lượng trypsin tối ưu (8-10 µg/ml) và phương pháp xác định chủng ứng viên vắc xin thông qua chỉ số trung hòa chéo r1.
2. Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm và chẩn đoán thú y: Hướng dẫn chuẩn hóa phản ứng trung hòa virus (VNT) kết hợp kỹ thuật nhuộm hóa miễn dịch IPMA, giúp định lượng kháng thể trung hòa chính xác thay vì phụ thuộc vào việc đọc bệnh tích CPE chủ quan.
3. Bác sĩ thú y và nhà quản lý trang trại chăn nuôi: Giúp hiểu rõ cơ chế miễn dịch mẹ truyền qua sữa đầu và nắm bắt sự khác biệt kháng nguyên giữa các phân nhóm virus, từ đó lựa chọn đúng loại vắc xin thương mại phù hợp với dịch tễ trang trại nhằm giảm tỷ lệ chết ở lợn con xuống dưới 10%.
4. Học viên cao học và sinh viên ngành Thú y, Công nghệ Sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về thiết kế thí nghiệm in vitro, in vivo, quy trình multiplex RT-PCR phân định genogroup và phương pháp xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Minitab 16.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao lợn nái đã được tiêm phòng đầy đủ nhưng lợn con sinh ra vẫn mắc dịch tiêu chảy cấp? Hiện tượng này xuất phát từ sự khác biệt kháng nguyên giữa chủng vắc xin cổ điển (G1) và chủng thực địa mới nổi (G2). Kết quả nghiên cứu chứng minh kháng thể vắc xin G1 chỉ trung hòa chéo một phần chủng G2 với chỉ số r1 tối đa 0,5, làm giảm 50% hiệu lực bảo hộ lợn con trước các chủng virus thực địa lưu hành.

2. Phản ứng trung hòa virus (VNT) có ưu điểm gì vượt trội hơn so với phản ứng ELISA? Trong khi ELISA chỉ phát hiện kháng thể gắn kết tổng số (chủ yếu là IgG) với độ tương đồng 84,2%, phản ứng VNT trực tiếp định lượng kháng thể có hoạt tính vô hiệu hóa virus. Phương pháp VNT kết hợp IPMA cho phép đọc kết quả sau 30 giờ và loại bỏ hoàn toàn các trường hợp dương tính giả (khoảng 12,6%) của ELISA.

3. Trypsin đóng vai trò sinh học như thế nào trong quá trình nhân nuôi PEDV trên tế bào Vero? Trypsin đóng vai trò enzym phân cắt glycoprotein Spike (S) thành hai tiểu phần S1 và S2, giúp hoạt hóa quá trình dung hợp màng giữa vỏ virus và màng tế bào vật chủ. Việc bổ sung trypsin ở nồng độ 8-10 µg/ml là điều kiện bắt buộc để virus PEDV thực địa xâm nhập và tăng sinh ổn định trên tế bào Vero.

4. Tại sao chủng PEDV 0118 lại được đánh giá là chủng giống tiềm năng nhất để chế tạo vắc xin? Chủng PEDV 0118 phân lập tại Hưng Yên đạt hiệu giá nhân lên cao nhất (10^6.1 TCID50/ml ở đời P6), mang độc lực thực địa mạnh và đặc biệt có khả năng tạo kháng thể trung hòa chéo 100% (chỉ số r1 = 1,0) với tất cả các chủng thực địa G2 khác trong nghiên cứu.

5. Làm thế nào để đảm bảo lợn con sơ sinh nhận đủ lượng kháng thể bảo hộ từ lợn mẹ? Cần tiêm đủ 3-4 mũi vắc xin cho lợn nái trước khi sinh từ 3 đến 5 tuần để nồng độ IgG và IgA tích lũy tối đa trong tuyến vú. Lợn con bắt buộc phải được bú no sữa đầu trong 24 giờ đầu sau sinh, đảm bảo hiệu giá kháng thể trung hòa trong máu đạt ngưỡng bảo hộ từ 5 log2 trở lên.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ của tác giả Nguyễn Thị Bích đã giải quyết toàn diện bài toán đánh giá tính miễn dịch chéo của PEDV tại Việt Nam với các đóng góp học thuật và thực tiễn cốt lõi:

• Giám định thành công 4 chủng PEDV thực địa miền Bắc thuộc genogroup G2 mới nổi và chủng vắc xin thuộc genogroup G1 cổ điển.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình phản ứng trung hòa virus (VNT) kết hợp nhuộm hóa miễn dịch IPMA trên tế bào Vero đạt chuẩn GLP.
• Làm sáng tỏ nguyên nhân thất bại của vắc xin cổ điển khi chứng minh kháng thể vắc xin G1 chỉ trung hòa chéo một phần (r1 ≤ 0,5) với chủng thực địa G2.
• Tuyển chọn thành công chủng thực địa PEDV 0118 có hoạt tính trung hòa chéo 100% (r1 = 1,0) làm chủng giống triển vọng cho sản xuất vắc xin thế hệ mới.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học và huyết thanh học giá trị cao phục vụ chiến lược phòng chống dịch PED trên toàn quốc.

Để nhanh chóng chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn, các doanh nghiệp dược thú y cần bắt tay triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng vắc xin từ chủng PEDV 0118 trong vòng 12 tháng tới. Quý độc giả, nhà khoa học và các trang trại chăn nuôi quan tâm có thể liên hệ trực tiếp Học viện Nông nghiệp Việt Nam để tiếp cận toàn văn công trình nghiên cứu và tài liệu kỹ thuật chi tiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) thuộc họ Coronaviridae, giống Alphacoronavirus là nguyên nhân gây tiêu chảy cấp và mất nước trầm trọng ở lợn (Debouck & Pensaert, 1980; Stevenson & cs. Virus được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1971 tại một ổ dịch tiêu chảy cấp ở Anh. Tuy nhiên, đến năm 1977 sau vụ dịch nổ ra nghiêm trọng tại Bỉ thì virus được đặt tên Porcine epidemic diarrhea virus, chủng virus lưu hành ở Bỉ tại thời điểm đó được đặt tên PEDV- CV777 (Pensaert & De Bouck, 1978). Là một virus khó phân lập và thích nghi, nên đến năm 1988 virus mới được phân lập và nuôi cấy thích nghi thành công trên tế bào Vero với sự hỗ trợ của trypsin.

Dịch tiêu chảy do PEDV xảy ra rộng khắp ở châu Âu trong những năm 1970 đến năm 1980. Từ năm 1980 đến năm 1990 số ổ dịch giảm dần ở châu lục này. Năm 2013, một vụ dịch lớn xảy ra ở Mỹ (Wang & cs., 2014), sau đó dịch lan nhanh các nước có biên giới với Mỹ. Cũng từ năm 2013 phân tích di truyền cho thấy hầu hết virus phân lập ở châu Á và châu Mỹ thuộc nhóm virus mới nổi G2b, nằm ở nhánh khác hoàn toàn với chủng virus thuộc nhóm G1 thường dùng chế vắc xin trước đó (Lee, 2015).

Trong khi một số Quốc gia đã thành công trong nghiên cứu vắc xin PEDV vô hoạt từ PEDV chủng thực địa thuộc nhóm G2 (Collin & cs. Bệnh PED được xác định lần đầu tiên tại Việt Nam năm 2008. Virus được phân lập và được xác định có quan hệ gần với các chủng PEDV phân lập Trung Quốc (Toan & cs. Có 2 nhóm di truyền của PEDV ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ, trong đó nhóm mới nổi G2 chiếm ưu thế (Van T., 2020; Nguyễn Văn Giáp & cs.

PEDV là một virus dễ biến đổi, kể từ năm 2010, đã có sự biến đổi của PEDV tại thực địa so với các chủng vắc xin (Sun & cs. Do đó, dù chương trình dùng vắc xin PED đầy đủ trên lợn ở các cơ sở chăn nuôi, nhưng dịch tiêu chảy do PEDV vẫn xảy ra. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm hiện tại, vắc xin thương mại chủ yếu là vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc dựa vào các chủng thuộc nhóm cổ điển như: CV777, DR13, SM98. Protein S của PEDV có vai trò kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trung hòa, đồng thời giúp virus tiếp cận và xâm nhập vào tế vào vật chủ (Bosch & cs.

Do đó, phản ứng trung hòa là phương pháp gián tiếp đánh giá tình trạng miễn dịch chống lại PEDV (Oh & cs., 2005), với ngưỡng kháng thể trung hòa 5 log2 có khả năng bảo hộ chống lại virus công cường độc (Clement & cs. So với nhóm cổ điển, các chủng PEDV thuộc nhóm mới nổi được chứng minh đề kháng cao với interferon và virus không bị trung hòa hoàn toàn bởi kháng thể tạo ra bởi chủng PEDV cổ điển (Shin & Park, 2019). Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy đáp ứng miễn dịch tạo ra chỉ có khả năng bảo hộ đồng chủng. Do đó lựa chọn virus dùng nghiên cứu sản xuất vắc xin cần dựa trên chủng virus hiện lưu hành ở thực địa của mỗi quốc gia.

Nhằm góp phần nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của vắc xin và lựa chọn chủng virus trong công việc nghiên cứu sản xuất vắc xin để kiểm soát bệnh PED, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phản ứng trung hòa đánh giá khả năng miễn dịch chéo giữa chủng porcine epidemic diarrhea virus vắc xin và chủng thực địa lưu hành tại Việt Nam”. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Nhằm xây dựng được phản ứng trung hòa virus PED thực địa để có công cụ đánh giá khả năng miễn dịch của các chủng PED - Nhằm đánh giá khả năng miễn dịch chéo của các chủng PEDV vắc xin và thực địa, từ đó khuyến cáo việc dùng vắc xin hiện tại và lưu ý trong sự chọn chủng virus để nghiên cứu vắc xin phù hợp thực địa. Ý NGHĨA ĐỀ TÀI - Ý nghĩa khoa học Là công cụ trong đánh giá lựa giống virus dùng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh PED. - Ý nghĩa thực tiễn + Xây dựng được phương pháp chẩn đoán huyết thanh học như VNT, ELISA dựa trên chủng lưu hành thực địa là công cụ đắc lực trong nghiên cứu miễn dịch của virus PED lưu hành thực địa; + Xác định đặc điểm của các chủng PEDV từ đó cung cấp nguồn thông tin hữu ích trong lựa chọn vắc xin phòng bệnh PEDV.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu các chủng PEDV thực địa tại một số tỉnh miền Bắc, nhưng chưa có nguồn mẫu đại diện các vùng miền khác của Việt Nam. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PEDV 2. Đặc tính gây bệnh Bệnh PED thường xảy ra cấp tính và nghiêm trọng, lây nhiễm nhanh, nhiễm trên mọi lứa tuổi với triệu chứng tiêu chảy, nôn nhiều, phân chứa sữa không tiêu lợn cợn, lợn nằm trên bụng mẹ, chồng lên nhau, da khô, nằm bệt (Hình 2. Tỉ lệ chết ở lợn con bú mẹ 80-90%, lợn 4 tuần tuổi tỉ lệ chết tới 40% (Sun & cs. Quan sát lâm sàng không thể phân biệt được bệnh do PEDV hay TGEV, chỉ phân biệt được khi kết hợp lâm sàng và chẩn đoán phòng thí nghiệm (RT-PCR và hóa miễn dịch).

Mổ khám bệnh tích đại thể khi lợn mắc bệnh PED: phân màu vàng dính bết lông, da, con vật chết trong trạng thái mất nước, mắt hốc hác, da không đàn hồi, dịch dạ dầy chứa sữa đông, ruột non chứa sữa không tiêu màu trắng đến vàng, thành ruột non mỏng (Hình 2. Bằng cách làm tiêu bản vi thể, quan sát bệnh lý tế bào biểu mô có hiện tượng thoái hóa đầu lông nhung, villi bị co ngắn, virus khu trú ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột (Hình 2. Đặc điểm bệnh lý của dịch PED được miêu tả tương tự ở các nước thuộc châu Á như Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam (Huang & cs. Nguồn: Song & cs.

(2015) Ghi chú: Hình 2. Lợn dưới 1 tuần tuổi bị mất nước nghiêm trọng. Lợn nằm chồng lên nhau Hình 2. Biểu hiện lâm sàng của lợn nhiễm PEDV ở Hàn Quốc năm 2015 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguồn: Stevenson & cs.

(2013) Ghi chú: Hình 2. Lợn 4 ngày tuổi của nông trang ở Mỹ năm 2013 nhiễm PEDV cấp tính. Thành ruột mỏng, trong suốt, giãn. Tiêu bản ruột non nhuộm hóa miễn dịch, PEDV nhuộm màu nâu trong nguyên sinh, virus ở hầu hết tế bào biểu mô lông nhung ruột Hình 2.

Bệnh tích đại thể và vi thể tại ruột của lợn nhiễm PEDV 2. Cơ chế sinh bệnh Virus thuộc họ Coronaviridae có tính hướng tế bào biểu bì của đường ruột và tế bào đại thực bào. Đường lây nhiễm chính qua đường tiêu hóa. Nguồn virus chủ yếu từ phân, dịch nôn, thức ăn từ lợn trưởng thành mang trùng truyền PEDV vào lợn mẫn cảm (Dee & cs.

Một con đường lây nhiễm khác, là con đường lây nhiễm qua khí dung, đích đến vẫn là tế bào biểu mô ruột. Khí dung đưa PEDV nhiễm vào tế bào biểu mô mũi (NEC), sau đó gắn kết tế bào T - CD3+, T- CD3+ mang virus theo hệ thống tuần hoàn tới các tế bào đích ở niêm mạc ruột (Hình 2. Men porcine aminopeptidase N của lợn (pAPN) có sẵn trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non, nó được xác định như là thụ thể tế bào, protein S vùng S1 của PEDV tiếp cận thụ thể pAPN giúp PEDV xâm nhập vào tế bào vật chủ (Li & cs.4 mô phỏng sự xâm nhập của virus qua khí dung. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguồn: Li & cs.

(2018) Ghi chú: Cơ chế PEDV truyền qua đường không khí xâm nhập vào lợn, PEDV xâm nhập vào đường mũi, tế bào DCs có vai trò quan trọng giúp virus xâm nhập vào niêm mạc mũi và được vận chuyển bởi tế bào T- CD3+ truyền virus vào tế bào biểu mô ruột nhờ hệ thống tuần hoàn Hình 2. Virus truyền lây thông qua khí dung Nguồn: Li & cs. (2018) Ghi chú: Kháng nguyên PEDV được nhuộm màu nâu (mũi tên) trong tế bào niêm mạc mũi Hình 2. PEDV xuất hiện trong tế bào biểu mô mũi 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Cơ chế PEDV xâm nhập, nhân lên của virus trong tế bào vật chủ, thực hiện vòng đời của PEDV trong tế bào, biểu diễn trong Hình 2.5 Nguồn: Changhee (2015) Ghi chú: Virus tiếp cận pAPN như thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột non, thực hiện quy trình nhân bản trong nguyên sinh chất, tạo virus thế hệ sau hoàn chỉnh trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào.

Cơ chế xâm nhập và tăng sinh của PEDV trong tế bào vật chủ Hình 2. Mô tả chu kỳ nhân lên của PEDV, PEDV bám pAPN-một thụ thể bề mặt của tế bào vật chủ thông qua Protein S. Protein S giúp cho virus tháo gỡ vỏ, bộ gen virus chui vào nguyên sinh chất của tế bào vật chủ. Mỗi mARN được phiên mã đầy đủ để cho protein đã được mã hóa ở ORF của đoạn mARN, các protein S, E và M được lồng vào trong thể Golgi của tế bào vật chủ.

Protein N tương tác ARN tạo phức hợp ARN xoắn. Virus con được tạo thành trong thể Golgi, rồi phóng thích ra khỏi tế bào vật chủ qua màng, phát tán sang tế bào khác, tiếp tục chu kỳ mới (Changhee, 2015). Chẩn đoán, xét nghiệm PEDV Chẩn đoán bệnh do PEDV không chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng bởi vì biểu hiện tiêu chảy giống các nguyên nhân khác gây tiêu chảy ở lợn. Chẩn đoán phân biệt là cần thiết để xác định PEDV trong phòng thí nghiệm.

Nhiều kỹ thuật được phát triển và sử dụng để xác định PEDV trong bệnh phẩm, bao gồm miễn dịch huỳnh quang (IF), kỹ thuật hóa miễn dịch, kính hiển vi điện tử quan sát trực tiếp, in situ Hybridization, RT-PCR, phản ứng ELISA. Tuy nhiên, mỗi kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, thời gian xét nghiệm cũng khác 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nhau (Kim & cs. RT-PCR phát hiện PEDV thường nhanh hơn các phương pháp khác và phân biệt được TGEV và PEDV. Phát triển kỹ thuật RT- PCR và multiplex RT-PCR xác định PEDV: độ nhạy và độ đặc hiệu và hiệu quả cao khi sự xuất hiện ngày càng đa dạng các virus gây bệnh ở dạ dày ruột cấp tính ở lợn (Song & cs.