Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02

Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus kty prrs 01 và kty prrs 02 trong luận văn thạc sĩ vnua, cung cấp thông tin quan trọng cho ngành chăn nuôi.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.8.1. Mục tiêu chung
• 1.8.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 1.9.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.9.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.10. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• 1.11. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.11.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.11.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 1.12. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.12.1. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.12.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 1.12.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 1.12.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS
• 1.12.2.1. Cấu trúc virus PRRS
• 1.12.2.2. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS
• 1.12.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
• 1.13. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.13.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 1.13.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 1.13.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 1.14. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.14.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.14.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.15. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.15.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 1.15.2. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
• 1.15.3. Phương pháp xác định TCID50
• 1.15.4. Phương pháp xác định sự nhân lên của virus
• 1.15.5. Phương pháp RT – PCR
• 1.15.6. Phương pháp giải trình tự gene
• 1.15.7. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
• 1.15.8. Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ
• 1.15.9. Phương pháp IPMA
• 1.15.10. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm
• 1.16. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.16.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
• 1.16.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 1.16.1.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 1.16.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR
• 1.16.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu
• 1.16.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene
• 1.16.2.4. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu
• 1.16.2.5. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu
• 1.16.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu
• 1.17. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus KTY PRRS và đặc tính sinh học của nó

Virus KTY-PRRS là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trong ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Bệnh tai xanh, hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), đã gây ra thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus này là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm cấu trúc và gen của virus KTY PRRS

Virus KTY-PRRS thuộc họ Arteriviridae, có cấu trúc gen RNA đơn dương với kích thước khoảng 15 kb. Bộ gen của virus này bao gồm nhiều khung đọc mở (ORF), trong đó ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein polymerase cần thiết cho sự nhân lên của virus.

1.2. Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam

Từ năm 2005, PRRS đã trở thành một trong những dịch bệnh phổ biến tại Việt Nam, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Các chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đã được phát hiện và nghiên cứu để đánh giá mức độ gây bệnh và khả năng lây lan của chúng.

II. Thách thức trong nghiên cứu virus KTY PRRS tại Việt Nam

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về virus KTY-PRRS, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc hiểu rõ đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus này. Sự đa dạng di truyền của virus và khả năng biến đổi nhanh chóng là những yếu tố gây khó khăn trong việc phát triển vắc-xin hiệu quả.

2.1. Sự đa dạng di truyền của virus KTY PRRS

Virus KTY-PRRS có nhiều biến thể khác nhau, điều này làm cho việc phát triển vắc-xin trở nên khó khăn. Các nghiên cứu cho thấy rằng sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus có thể dao động từ 55-70%.

2.2. Khó khăn trong việc phát hiện và chẩn đoán virus

Việc phát hiện virus KTY-PRRS trong môi trường thực địa gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi gen của virus. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại cần được cải thiện để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu virus KTY PRRS hiệu quả

Để nghiên cứu virus KTY-PRRS, cần áp dụng các phương pháp hiện đại như nuôi cấy tế bào, RT-PCR và giải trình tự gen. Những phương pháp này giúp xác định đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus một cách chính xác.

3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào để nghiên cứu virus

Nuôi cấy tế bào là phương pháp cơ bản để nghiên cứu sự nhân lên của virus KTY-PRRS. Các tế bào Marc 145 thường được sử dụng để theo dõi sự phát triển và gây bệnh của virus.

3.2. Phương pháp RT PCR trong phát hiện virus

RT-PCR là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện sự có mặt của virus KTY-PRRS trong mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các chủng virus khác nhau.

IV. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của virus KTY PRRS

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 có khả năng gây bệnh cao, với hiệu giá virus đạt mức tối đa trong khoảng thời gian từ 60 đến 84 giờ sau khi gây nhiễm. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa.

4.1. Khả năng gây bệnh của các chủng virus KTY PRRS

Cả hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có khả năng gây bệnh tích tế bào cao, với tỷ lệ gây bệnh đạt 100% trong thời gian ngắn. Điều này cho thấy mức độ độc lực của chúng là rất cao.

4.2. Đánh giá hiệu giá virus trong môi trường nuôi cấy

Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu giá virus KTY-PRRS-01 đạt 1,74x10^6 TCID50/25µl và KTY-PRRS-02 đạt 3,16x10^6 TCID50/25µl, cho thấy sự nhân lên mạnh mẽ của virus trong môi trường nuôi cấy.

V. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu virus KTY PRRS

Các kết quả nghiên cứu về virus KTY-PRRS không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học của virus mà còn có thể ứng dụng trong việc phát triển vắc-xin và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

5.1. Phát triển vắc xin hiệu quả từ nghiên cứu

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc phát triển các loại vắc-xin mới, giúp nâng cao hiệu quả phòng ngừa bệnh tai xanh trong chăn nuôi.

5.2. Tăng cường biện pháp phòng ngừa dịch bệnh

Các thông tin từ nghiên cứu sẽ giúp các nhà quản lý và người chăn nuôi có những biện pháp phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh tai xanh gây ra.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu virus KTY PRRS

Nghiên cứu về virus KTY-PRRS tại Việt Nam là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus này. Các kết quả nghiên cứu sẽ mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả trong tương lai.

6.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus KTY PRRS

Nghiên cứu virus KTY-PRRS không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về virus mà còn góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam khỏi các dịch bệnh nguy hiểm.

6.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu virus

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về virus KTY-PRRS, đặc biệt là các biến thể mới và khả năng lây lan của chúng, nhằm phát triển các chiến lược phòng ngừa hiệu quả hơn trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch bệnh rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), thường gọi là bệnh tai xanh, là mối đe dọa nghiêm trọng hàng đầu đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu. Theo các thống kê kinh tế quốc tế, thiệt hại hàng năm do PRRS gây ra cho ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ ước tính lên tới 560 triệu USD. Tại khu vực châu Á, đợt bùng phát PRRS độc lực cao năm 2006 tại Trung Quốc đã khiến hơn 2 triệu con lợn mắc bệnh và hơn 400.000 con bị chết chỉ trong vòng 3 tháng. Tại Việt Nam, kể từ khi xuất hiện ca bệnh đầu tiên năm 1997 trên đàn lợn giống nhập khẩu và bùng phát dữ dội từ năm 2007, dịch bệnh đã liên tục tái phát tại nhiều tỉnh thành. Đỉnh điểm vào năm 2010, dịch bệnh ghi nhận tại 1.517 xã thuộc 215 huyện, làm 717.830 con lợn mắc bệnh và buộc phải tiêu hủy hơn 413.000 con.

Vấn đề cốt lõi hiện nay là sự biến dị liên tục của virus PRRS (PRRSV), dẫn đến hiện tượng vắc-xin thương mại giảm hiệu lực bảo hộ chéo trước các biến chủng thực địa. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Nguyễn Thị Ngọc, thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Thị Lan tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập trung giải quyết yêu cầu cấp thiết này. Mục tiêu nghiên cứu là xác định toàn diện các đặc tính sinh học chủ yếu và đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y. Đối tượng nghiên cứu là 02 chủng virus phân lập từ các ổ dịch bùng phát năm 2013 tại hai vùng chăn nuôi trọng điểm gồm Thái Bình và Nghệ An. Công trình mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp dữ liệu di truyền chuẩn hóa để phát triển các dòng vắc-xin bản địa có độ tương đồng kháng nguyên cao, hướng tới mục tiêu giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở đàn lợn xuống dưới 5% và kiểm soát bền vững dịch bệnh tại thực địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở khoa học của đề tài dựa trên lý thuyết phân loại học và sinh học phân tử của bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus. Hệ gen của PRRSV là một phân tử RNA sợi đơn dương có kích thước khoảng 15 kb, bao gồm 9 khung đọc mở (ORF). Trong đó, ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 75% hệ gen, mã hóa cho 13 protein phi cấu trúc (NSP) liên quan trực tiếp đến quá trình sao chép và phiên mã của virus.

Khung lý thuyết cấu trúc virus tập trung vào các protein vỏ và màng nhân. Khung đọc mở ORF5 (kích thước 603 bp) mã hóa cho Glycoprotein 5 (GP5) gồm 200 amino acid, là protein bề mặt quan trọng nhất chịu trách nhiệm gắn kết thụ thể trên tế bào đích và mang các epitop trung hòa kháng thể. Khung đọc mở ORF7 (kích thước 372 bp) mã hóa cho protein màng nhân Nucleocapsid (N) gồm 123 amino acid, có tính kháng nguyên mạnh và bảo tồn cao, được ứng dụng làm kháng nguyên chuẩn trong các phản ứng chẩn đoán huyết thanh học. Về mặt dịch tễ học phân tử, PRRSV được phân thành hai kiểu gen chính: Type 1 (dòng châu Âu, chủng chuẩn Lelystad) và Type 2 (dòng Bắc Mỹ, chủng chuẩn VR-2332), với độ sai khác về trình tự nucleotide giữa hai kiểu gen dao động từ 30% đến 45%.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm bắt nguồn từ 02 chủng virus KTY-PRRS-01 (phân lập từ phổi lợn nái mang thai tại Thái Bình) và KTY-PRRS-02 (phân lập từ hạch phổi lợn nái mang thai tại Nghệ An) thu thập trong đợt dịch năm 2013. Mẫu bệnh phẩm được thu thập có chủ đích từ các cá thể lợn nái mang thai biểu hiện bệnh tích lâm sàng điển hình, giúp đảm bảo thu nhận đúng chủng độc lực thực địa đang lưu hành.

Quy trình nghiên cứu sinh học tế bào sử dụng dòng tế bào thận khỉ Marc 145, nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS ở điều kiện 37 độ C và 5% CO2. Phương pháp gây nhiễm virus thực hiện ở tỷ lệ đa nhiễm MOI = 0,1. Hiệu giá virus được chuẩn độ trên đĩa 96 giếng theo phương pháp Spearman-Karber để xác định chỉ số TCID50/25µl. Động thái nhân lên của virus được xác định thông qua việc thu mẫu định lượng dịch nổi và tế bào tại các mốc 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 và 96 giờ sau gây nhiễm.

Đánh giá tính kháng nguyên được tiến hành trên mô hình động vật thí nghiệm với cỡ mẫu gồm 25 chuột lang (chia thành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 10 con tiêm kháng nguyên tinh chế 20 µg, 1 lô đối chứng 5 con) và 20 thỏ (chia thành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 8 con tiêm 20 µg kháng nguyên, 1 lô đối chứng 4 con). Kháng thể kháng PRRSV trong huyết thanh được giám định bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men trên tế bào một lớp (IPMA) với độ pha loãng huyết thanh từ 1/40 đến 1/2560.

Phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen ORF5 (720 bp) và ORF7 (372 bp). Sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000. Dữ liệu nucleotide và amino acid được xử lý qua phần mềm BLAST, Genetyx 5.4 và MEGA6. Cây phát sinh loài được xây dựng theo thuật toán Neighbor-Joining với 1.000 lần lặp bootstrap để đảm bảo độ tin cậy phân loại. Toàn bộ thực nghiệm hoàn thành trong khung thời gian 9 tháng từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình theo dõi thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện cốt lõi về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 02 chủng virus nghiên cứu:

Thứ nhất, về khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng Marc 145, cả hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều bắt đầu phá hủy tế bào ở thời điểm 36 giờ sau gây nhiễm với tỷ lệ tổn thương 10%. Tuy nhiên, tốc độ tiến triển bệnh tích có sự khác biệt rõ nét: chủng KTY-PRRS-02 phát triển nhanh hơn, đạt 85% CPE ở 60 giờ và phá hủy 100% bề mặt tế bào ở 72 giờ; trong khi chủng KTY-PRRS-01 đạt 80% CPE ở 60 giờ và đạt 100% CPE ở mốc 84 giờ.

Thứ hai, về hiệu giá virus và quy luật nhân lên, chuẩn độ virus theo công thức Spearman-Karber cho thấy chủng KTY-PRRS-02 đạt hiệu giá rất cao là 3,16 x 10^6 TCID50/25µl, cao hơn chủng KTY-PRRS-01 với hiệu giá 1,74 x 10^6 TCID50/25µl. Quy luật động thái sinh trưởng khẳng định lượng virus giải phóng ngoại bào luôn cao hơn lượng virus nội bào tại hầu hết các thời điểm. Hàm lượng virus nội bào của chủng KTY-PRRS-02 đạt đỉnh ở 60 giờ, còn KTY-PRRS-01 đạt đỉnh ở 72 giờ với giá trị log TCID50 đạt mức 5,5.

Thứ ba, về đặc tính phân tử gen cấu trúc, đoạn gen ORF5 của cả 2 chủng có độ dài 603 bp mã hóa 200 amino acid của protein GP5; đoạn gen ORF7 có độ dài 372 bp mã hóa 123 amino acid của protein N. So sánh nội bộ giữa 2 chủng nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng nucleotide rất cao, đạt 98,03% đối với gen ORF5 và 98,58% đối với gen ORF7. Mức độ tương đồng về chuỗi amino acid tương ứng lần lượt là 95,04% và 96,32%.

Thứ tư, về phả hệ di truyền và tính sinh miễn dịch, phân tích cây sinh học phân tử xác định KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều thuộc kiểu gen Bắc Mỹ Type 2, nằm cùng phân nhánh với các chủng PRRS độc lực cao của Trung Quốc (như JXA1, TJ). Kháng nguyên tinh chế từ cả 2 chủng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ trên chuột lang và thỏ thí nghiệm, cho kết quả phản ứng IPMA dương tính rõ rệt ở độ pha loãng huyết thanh cao.

Thảo luận kết quả

Khi thảo luận về động thái tăng trưởng, dữ liệu thực nghiệm có thể được mô hình hóa sinh động thông qua biểu đồ đường cong sinh trưởng biểu diễn giá trị log TCID50 theo các trục thời gian từ 12 đến 96 giờ, kết hợp cùng bảng ma trận đối sánh tỷ lệ % tương đồng di truyền. Kết quả nghiên cứu chứng minh hai chủng virus phân lập tại miền Bắc và miền Trung có độc lực tế bào cao, thích ứng tuyệt đối với tế bào Marc 145 và mang đặc tính nhân lên mạnh mẽ.

Sự tương đồng di truyền cao giữa KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với các chủng độc lực cao Trung Quốc (đạt 97,6% đến 99,42% ở gen ORF5 và lên tới 99,65% ở gen ORF7) phù hợp với bối cảnh dịch tễ học khu vực. Ngược lại, mức độ tương đồng của hai chủng này với chủng vắc-xin cổ điển VR-2332 thấp hơn nhiều, chỉ dao động từ 85,12% đến 89,2%. Điều này giải thích căn nguyên vì sao việc tiêm phòng bằng các loại vắc-xin cổ điển trước đây thường không mang lại hiệu quả bảo hộ tuyệt đối, khiến dịch tai xanh vẫn bùng phát định kỳ tại các địa phương chăn nuôi quy mô lớn của Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, luận văn đưa ra bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể nhằm kiểm soát dịch bệnh tai xanh:

1. Tuyển chọn chủng giống sản xuất vắc-xin thế hệ mới: Các viện nghiên cứu thú y và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm (như Navetco, Vetvaco) cần tiến hành sử dụng chủng KTY-PRRS-02 làm chủng virus giống tiềm năng để sản xuất vắc-xin vô hoạt hoặc vắc-xin nhược độc đông khô. Mục tiêu là tạo ra dòng vắc-xin có độ tương đồng kháng nguyên đạt trên 98% với các chủng thực địa, nâng tỷ lệ bảo hộ thực tế lên trên 85% trong khung thời gian thử nghiệm 12-24 tháng.
2. Chuẩn hóa kit chẩn đoán kháng nguyên và kháng thể: Cục Thú y và các phòng thí nghiệm chuyên ngành cần ứng dụng protein N (mã hóa từ ORF7) và kháng thể tinh chế từ nghiên cứu để sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán IPMA và ELISA nội địa. Chỉ tiêu đặt ra là nâng độ nhạy chẩn đoán lên trên 98%, rút ngắn thời gian phát hiện bệnh xuống dưới 4 giờ, triển khai hoàn thiện trong vòng 6-12 tháng.
3. Thiết lập mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Cơ quan thú y vùng phối hợp với Học viện Nông nghiệp Việt Nam triển khai giải trình tự gen ORF5 định kỳ hàng quý đối với các mẫu bệnh phẩm thu thập tại các ổ dịch. Biện pháp này giúp phát hiện sớm các đột biến điểm tại vùng epitope trung hòa, duy trì độ bao phủ giám sát 100% tại các vùng chăn nuôi trọng điểm.
4. Tối ưu hóa quy trình phòng dịch và lựa chọn vắc-xin tại trang trại: Người chăn nuôi và kỹ sư thú y cơ sở cần chuyển đổi sang sử dụng các dòng vắc-xin nhược độc có nguồn gốc từ dòng Bắc Mỹ độc lực cao tương đồng với chủng lưu hành. Phác đồ tiêm phòng định kỳ 2 lần/năm cho lợn nái và 1 liều cho lợn con sau cai sữa giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh tại trang trại xuống dưới 3%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả thực nghiệm của công trình luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

• Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Thú y học: Khai thác dữ liệu về phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào Marc 145, quy trình chuẩn độ TCID50 và phương pháp giải trình tự gen để phục vụ giảng dạy và phát triển các đề tài chuyên sâu về dịch tễ học phân tử.
• Chuyên gia R&D tại các công ty sản xuất vắc-xin và chế phẩm sinh học: Ứng dụng thông số về hiệu giá virus (đạt mức 3,16 x 10^6 TCID50/25µl) và quy luật giải phóng ngoại bào để tối ưu hóa công nghệ lên men sinh khối virus quy mô công nghiệp.
• Cán bộ quản lý dịch bệnh tại Cục Thú y và Chi cục Thú y các tỉnh: Sử dụng cơ sở dữ liệu phả hệ di truyền để xây dựng bản đồ lưu hành virus PRRS Type 2, định hướng chính sách kiểm dịch và quản lý vận chuyển gia súc liên tỉnh.
• Bác sĩ thú y thực địa và chủ trang trại chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp: Tham khảo thông tin về sự sai khác di truyền giữa chủng thực địa và chủng vắc-xin thương mại để đưa ra quyết định lựa chọn dòng vắc-xin phòng tai xanh đạt hiệu quả bảo hộ chéo tối ưu nhất.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 thuộc kiểu gen nào và phân bố ở đâu? Hai chủng virus này thuộc kiểu gen II (dòng Bắc Mỹ), nằm cùng phân nhánh phả hệ với các chủng PRRS độc lực cao của Trung Quốc. Chủng KTY-PRRS-01 được phân lập từ phổi lợn nái tại Thái Bình, trong khi chủng KTY-PRRS-02 được phân lập từ hạch phổi lợn nái tại Nghệ An trong đợt dịch năm 2013.

2. Khả năng nhân lên và hiệu giá của hai chủng virus trên tế bào Marc 145 đạt mức nào? Cả hai chủng đều nhân lên mạnh mẽ trên tế bào Marc 145, bắt đầu gây bệnh tích tế bào sau 36 giờ và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 72 đến 84 giờ. Hiệu giá của chủng KTY-PRRS-01 đạt 1,74 x 10^6 TCID50/25µl và chủng KTY-PRRS-02 đạt 3,16 x 10^6 TCID50/25µl.

3. Vì sao nghiên cứu lại tập trung giải trình tự hai gen ORF5 và ORF7? Gen ORF5 (603 bp) mã hóa Glycoprotein 5 có tính đa hình cao và chứa epitop trung hòa, là chỉ thị chính để đánh giá sự biến chủng và tính sinh miễn dịch. Gen ORF7 (372 bp) mã hóa protein N có tính bảo tồn cao, là kháng nguyên tiêu chuẩn để chẩn đoán phân tử và giám định huyết thanh.

4. Tính sinh miễn dịch của 2 chủng virus được đánh giá trên mô hình thực nghiệm nào? Tính sinh miễn dịch được kiểm chứng trên cỡ mẫu 25 chuột lang và 20 thỏ thông qua việc tiêm 2 lần kháng nguyên tinh chế với liều 20 µg. Huyết thanh thu thập sau 14 ngày tiêm lần 2 đều cho phản ứng IPMA dương tính mạnh mẽ ở độ pha loãng cao.

5. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thế nào đối với công tác tiêm phòng vắc-xin tai xanh tại Việt Nam? Nghiên cứu chỉ ra các chủng virus thực địa có độ tương đồng di truyền cao với chủng độc lực cao dòng Bắc Mỹ (97,6% - 99,42%) nhưng sai khác lớn với chủng cổ điển VR-2332. Kết quả này giúp ngành thú y định hướng sử dụng đúng loại vắc-xin tương đồng để tránh hiện tượng thất bại miễn dịch.

Kết luận

• Xác lập đầy đủ các đặc tính gây bệnh tích tế bào đặc trưng của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 trên dòng tế bào Marc 145, đạt mức phá hủy 100% bề mặt tế bào sau 72 đến 84 giờ nuôi cấy.
• Định lượng chính xác hiệu giá virus ở mức rất cao, đạt từ 1,74 x 10^6 TCID50/25µl đến 3,16 x 10^6 TCID50/25µl, khẳng định tiềm năng nhân sinh khối vượt trội cho công nghệ sản xuất sinh phẩm.
• Giải trình tự và xác định kích thước hoàn chỉnh của gen ORF5 (603 bp mã hóa 200 amino acid) và ORF7 (372 bp mã hóa 123 amino acid) với độ tương đồng nội bộ đạt trên 98%.
• Chứng minh bằng cây phát sinh loài rằng 02 chủng nghiên cứu thuộc Type 2 (dòng Bắc Mỹ) và thuộc phân nhóm virus PRRS độc lực cao có quan hệ di truyền chặt chẽ với các chủng bùng phát dịch tại khu vực.
• Đánh giá thành công khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên tinh chế trên mô hình động vật thí nghiệm bằng phản ứng IPMA chuẩn hóa.

Đóng góp quan trọng nhất của luận văn là làm phong phú nguồn quỹ gen PRRSV bản địa chuẩn hóa, mở đường cho việc nghiên cứu phát triển các dòng vắc-xin phòng bệnh tai xanh có hiệu lực cao tại Việt Nam. Trong các giai đoạn tiếp theo (2018-2022), các nhà nghiên cứu cần đẩy mạnh thử nghiệm nhược độc hóa chủng KTY-PRRS-02 qua các đời tiếp truyền tế bào và tiến hành công cường độc đánh giá hiệu lực bảo hộ trên đàn lợn thực nghiệm. Hãy liên hệ với các đơn vị nghiên cứu thú y uy tín để tiếp cận nguồn vật liệu di truyền và ứng dụng các tiến bộ công nghệ sinh học vào thực tiễn chăn nuôi an toàn sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 VÀ KTY-PRRS-02 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Thị Lan người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của cô mà luận văn của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục…. iii Danh mục chữ viết tắt.

v Danh mục bảng. vi Danh mục hình .vii Trích yếu luận văn .viii Thesis Abstract. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI.

Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể. PHẠM VI NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI. Ý nghĩa khoa học của đề tài.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới.

Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS. Cấu trúc virus PRRS. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS.

Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 24 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào.

Phương pháp xác định TCID50. Phương pháp xác định sự nhân lên của virus. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp giải trình tự gene.

Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein. Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ. Phương pháp IPMA. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02.

Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY- PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả phản ứng RT-PCR.

Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả truy cập ngân hàng gene. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu.

Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 73 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ giữa số lượng virus và số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2.

Protein cấu trúc của PRRSV. Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02 và chủng virus vắc-xin.

Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS. Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS lần 2. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của chuột và thỏ thí nghiệm. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủngvirus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu.

Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%).

Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%). 60 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Hình thái virus PRRS. Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS. Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01.

Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01.

Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-02. Đối chứng tế bào. Phản ứng IPMA dương tính.

Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B). Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu.

So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. 64 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Tên Luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”.

Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích của luận văn nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như:sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene.