Tổng quan nghiên cứu

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp chế biến nông sản và chăn nuôi làm gia tăng đáng kể lượng nước thải hữu cơ chứa nồng độ ô nhiễm cao. Theo các báo cáo môi trường tại Việt Nam, các chỉ số COD và BOD trong nước thải chế biến thực phẩm và chăn nuôi chưa qua xử lý thường vượt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 40:2011/BTNMT từ 5 đến 10 lần. Nồng độ nitơ tổng số dao động trong khoảng 512 đến 594 mg/l, trong khi hàm lượng photpho tổng số đạt từ 13,8 đến 62 mg/l. Lượng phế thải giàu xenluloza, tinh bột và protein nếu không được kiểm soát sẽ phân hủy kỵ khí tự nhiên, phát sinh mùi hôi thối nồng nặc và gây phú dưỡng hóa nghiêm trọng nguồn nước mặt.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm đặt ra là các hệ vi sinh vật tự nhiên sẵn có trong nước thải thường phân hủy chất hữu cơ rất chậm và không triệt để. Do đó, mục tiêu của luận văn là nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào mạnh như xenlulaza, amylaza và proteaza, từ đó định hướng ứng dụng xử lý nước thải giàu hữu cơ sau hầm biogas.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguồn mẫu vi sinh vật được phân lập từ nước thải Công ty Cổ phần Thực phẩm Xuất khẩu Đồng Giao (Ninh Bình) và thử nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas tại huyện Đan Phượng (Hà Nội) với quy mô 2,5 m3/mẻ sục khí liên tục trong giai đoạn năm 2014. Đề tài mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi hướng tới mục tiêu đưa nồng độ COD về dưới 150 mg/l (cột B) hoặc 75 mg/l (cột A), giảm 100% lượng photpho hòa tan ở nồng độ 6 mg/l, góp phần hoàn thiện công nghệ xử lý sinh học thân thiện với môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết xử lý nước thải bằng phương pháp bùn hoạt tính hiếu khí và kỵ khí, được kế thừa từ các nguyên lý sinh học kinh điển do Fowler, Ardern và Lockett phát triển từ năm 1914. Trong công nghệ bùn hoạt tính, quần xã vi sinh vật dị dưỡng sử dụng chất hữu cơ hòa tan làm nguồn cơ chất cacbon và năng lượng để sinh trưởng, chuyển hóa các phân tử cao phân tử thành sinh khối mới, nước và khí cacbonic.

Quá trình phân giải sinh học trong luận văn tập trung vào 3 nhóm phản ứng enzym chủ đạo: phản ứng thủy phân xenluloza nhờ phức hệ enzym xenlulaza cắt liên kết beta-1,4-glucozit; phản ứng thủy phân tinh bột qua enzym amylaza cắt liên kết alpha-1,4-glucozit; và phản ứng phân giải protein thành peptit cùng axit amin qua enzym proteaza. Tiếp theo là chu trình khoáng hóa nitơ qua các giai đoạn amon hóa, nitrit hóa, nitrat hóa và phản nitrat hóa. Đồng thời, nghiên cứu tích hợp lý thuyết hấp thu và tích lũy photpho vượt mức nhu cầu sinh lý của vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí, chuyển hóa photphat thành dạng polyphotphat dự trữ trong tế bào chất, nâng hàm lượng photpho chiếm từ 6% đến 12% trọng lượng tế bào khô. Các khái niệm then chốt bao gồm: Nhu cầu oxy hóa học (COD), Nhu cầu oxy sinh học (BOD5), hoạt lực enzym xenlulaza (IU/ml), tỷ lệ phối trộn dinh dưỡng C:N:P tiêu chuẩn (100:10:1) và chỉ số thể tích bùn lắng sau 30 phút (SV30).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tuyển chọn 3 chủng vi khuẩn triển vọng ký hiệu là NT01, NT03 và NT05 từ nguồn mẫu nước thải chế biến rau quả tại Ninh Bình thông qua phương pháp pha loãng tới hạn và cấy gạt trên môi trường thạch đĩa dinh dưỡng. Cỡ mẫu thử nghiệm nước thải thực tế được vận hành ở thể tích 2,5 m3/mẻ tại trạm xử lý sau hầm biogas huyện Đan Phượng, Hà Nội. Phương pháp chọn mẫu phân lập ngẫu nhiên có định hướng dựa trên khả năng hình thành vòng phân giải cơ chất chọn lọc.

Hệ thống phương pháp phân tích bao gồm:

  • Đánh giá khả năng sinh enzym qua phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và định lượng hoạt tính xenlulaza bằng phương pháp đo đường khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNSA) ở bước sóng 540 nm theo nguyên lý Bernfeld.
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym ở các dải nhiệt độ từ 25°C đến 60°C, dải pH từ 3 đến 9, nồng độ NaCl từ 0,3% đến 11% và nhiều nguồn cacbon, nitơ khác nhau qua phép đo mật độ quang OD ở bước sóng 600 nm và 620 nm.
  • Phân loại vi sinh vật bằng khóa phân loại Bergey kết hợp bộ sinh phẩm sinh hóa chuẩn API 50 CHB (đánh giá khả năng lên men 49 loại cơ chất đường) và kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen 16S rRNA dài khoảng 1500 bp với cặp mồi Pr16F và Pr16R.
  • Đánh giá chất lượng nước thải theo các tiêu chuẩn quốc gia: COD theo TCVN 6491-1999 (phương pháp chuẩn độ bicromat, khoảng đo 30 đến 700 mg/l), BOD5 theo TCVN 6001-1995 (ủ 5 ngày ở 20°C), photpho tổng theo Hach DR2800-10127 ở bước sóng 710 nm và nitơ tổng theo TCVN 5988-1995.

Lý do lựa chọn tổ hợp phương pháp này là nhằm đảm bảo tính chính xác tuyệt đối từ mức độ phân tử đến quy mô thử nghiệm bán công nghiệp, đáp ứng các tiêu chuẩn đo lường môi trường hiện hành tại Việt Nam. Toàn bộ tiến trình nghiên cứu được hoàn thành trong thời gian 12 tháng năm 2014.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao:

Thứ nhất, về khả năng sinh enzym thủy phân, chủng vi khuẩn NT01 thể hiện hoạt tính vượt trội với đường kính vòng phân giải xenluloza (CMC) đạt 21,0 mm và tinh bột đạt 20,0 mm. Chủng NT03 đạt vòng phân giải CMC 19,0 mm, tinh bột 17,0 mm; chủng NT05 đạt vòng phân giải CMC 17,0 mm, tinh bột 15,0 mm. Cả 3 chủng đều có khả năng làm loãng gelatin 10% sau 48 giờ nuôi cấy ở 37°C. Hoạt tính enzym xenlulaza cực đại của NT01 đạt 2,6 IU/ml sau 48 giờ, cao hơn chủng NT03 (2,5 IU/ml) khoảng 4% và chủng NT05 (2,45 IU/ml) khoảng 6,1%.

Thứ hai, về khả năng chuyển hóa photpho và nitơ, ở nồng độ photpho ban đầu 6 mg/l, cả 3 chủng đều loại bỏ hoàn toàn 100% photphat sau 7 ngày nuôi cấy. Khi tăng nồng độ photpho lên gấp 3 lần (18 mg/l), chủng NT01 tích lũy photphat tốt nhất, làm giảm 29,12% lượng photphat trong môi trường, cao hơn NT03 (giảm 25,77%) và NT05 (giảm 22,94%). Về hàm lượng nitơ amoni (NH4+), sau 15 ngày nuôi cấy, chủng NT01 làm giảm 33,34% (hàm lượng còn lại 66,66%), vượt trội hơn so với mức giảm 30,97% của NT03 (còn 69,03%) và 28,72% của NT05 (còn 71,28%).

Thứ ba, về sinh lý sinh thái, các chủng nghiên cứu thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ rộng từ 37°C đến 50°C và đạt đỉnh tối ưu tại 45°C với mật độ quang OD600 đạt 3,76 ở NT01; 3,82 ở NT03 và 3,80 ở NT05. Dải pH thích hợp rộng từ 5 đến 8, trong đó NT01 sinh trưởng và sinh enzym tối ưu tại pH 8 (OD đạt 3,95; hoạt tính đạt 2,28 IU/ml), còn NT03 và NT05 tối ưu tại pH 7 (hoạt tính enzym đạt 2,0 đến 2,1 IU/ml). Các chủng chịu được nồng độ muối NaCl từ 1% đến 5%, thích hợp nhất với nguồn cacbon là rỉ đường (OD đạt từ 5,02 đến 5,33) và nguồn nitơ hữu cơ từ pepton hoặc cao men.

Thứ tư, về phân loại định danh, kết hợp phân loại hình thái Bergey, kit API 50 CHB và trình tự gen 16S rRNA đã xác định chủng NT01 là Bacillus licheniformis (độ tương đồng 91,4%), chủng NT03 là Bacillus subtilis (độ tương đồng 88,5%) và chủng NT05 là Bacillus megaterium. Thử nghiệm cấy giao nhau trên đĩa thạch chứng minh 3 chủng hoàn toàn không đối kháng, tương hỗ sinh trưởng tốt khi kết hợp.

Thảo luận kết quả

Khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ của 3 chủng vi khuẩn bắt nguồn từ đặc tính tiết hệ enzym ngoại bào phong phú của chi Bacillus. Trong môi trường nước thải giàu xenluloza và tinh bột, enzym xenlulaza và amylaza nhanh chóng bẻ gãy các liên kết glucozit bền vững, chuyển hóa mạch polyme phức tạp thành đường đơn dễ hấp thu. Sự kết hợp giữa khả năng phân giải cacbon và khả năng tích lũy polyphotphat giúp tế bào chuyển hóa triệt để nguồn dinh dưỡng dư thừa, làm giảm nhanh chỉ số ô nhiễm.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua đồ thị đường kép mô tả mối tương quan giữa động học sinh trưởng tế bào và động học tích lũy enzym. Sinh khối vi khuẩn tăng vọt từ 6 đến 42 giờ (đạt đỉnh OD từ 2,155 đến 2,89), sau đó hoạt tính enzym xenlulaza đạt đỉnh cực đại ở mốc 48 giờ (2,45 đến 2,6 IU/ml) trước khi bước vào pha suy thoái. Biểu đồ cột so sánh hiệu suất khử photpho ở hai ngưỡng 6 mg/l và 18 mg/l thể hiện rõ ưu thế hấp thụ vượt trội của chủng Bacillus licheniformis NT01.

So với các công trình khoa học trong và ngoài nước, kết quả này hoàn toàn tương thích với các phát hiện của các chuyên gia khi nghiên cứu xử lý nước thải tinh bột sắn bằng các chủng Bacillus, cũng như công trình của các nhà khoa học quốc tế về hiệu suất xử lý COD đạt trên 90% trong các hệ thống xử lý sinh học hiếu khí có bổ sung vi khuẩn đặc hiệu. Việc các chủng vi khuẩn chịu được nhiệt độ lên tới 50°C và dải pH từ 5 đến 8 là lợi thế rất lớn cho điều kiện khí hậu nhiệt đới tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy tối đa tiềm năng của bộ giống vi khuẩn tuyển chọn trong xử lý môi trường, 4 khuyến nghị và giải pháp hành động cụ thể được đề xuất:

  1. Thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm sinh học dạng lỏng và dạng bột: Tiến hành nhân giống cấp 1 và cấp 2 trên môi trường dịch thể có bổ sung 1% rỉ đường và pepton để đạt mật độ tế bào từ 10 mũ 9 CFU/ml trở lên. Phối trộn 3 chủng Bacillus licheniformis NT01, Bacillus subtilis NT03 và Bacillus megaterium NT05 theo tỷ lệ 1:1:1. Mục tiêu đạt sản lượng 500 lít dịch men/mẻ trong vòng 6 tháng tới. Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm vi sinh.

  2. Ứng dụng chế phẩm trong hệ thống xử lý nước thải giàu hữu cơ: Bổ sung chế phẩm vi sinh định kỳ với liều lượng từ 20 đến 50 ml/m3 nước thải vào bể sinh học hiếu khí hoặc bể bùn hoạt tính. Đặt mục tiêu giảm từ 85% đến 90% chỉ số COD và loại bỏ trên 80% hàm lượng nitơ, photpho tổng trong vòng 3 tháng vận hành liên tục. Chủ thể thực hiện: Kỹ sư môi trường và ban quản lý vận hành trạm xử lý nước thải tại các nhà máy chế biến rau quả, tinh bột.

  3. Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật vận hành bể sinh học: Duy trì nhiệt độ vận hành trạm xử lý trong khoảng 35°C đến 45°C, điều chỉnh độ pH nước thải duy trì ổn định từ 7,0 đến 8,0 và sục khí liên tục nhằm duy trì nồng độ oxy hòa tan DO từ 2,0 đến 4,0 mg/l. Thời gian hoàn thiện chuẩn hóa quy trình kỹ thuật trong vòng 2 tháng. Chủ thể thực hiện: Đội ngũ kỹ thuật vận hành trạm xử lý chất thải.

  4. Xây dựng mô hình điểm và nhân rộng công nghệ xử lý nước thải biogas: Triển khai ứng dụng thử nghiệm mở rộng tại 10 trang trại chăn nuôi lợn quy mô từ 50 đến 200 m3 nước thải/ngày đêm tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng như Hà Nội, Ninh Bình, Hà Nam trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tới. Chủ thể thực hiện: Sở Tài nguyên và Môi trường phối hợp với các Viện nghiên cứu chuyên ngành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng chính:

  1. Kỹ sư môi trường và cán bộ vận hành hệ thống xử lý nước thải: Giúp nắm vững cơ chế sinh học, các thông số pH tối ưu từ 7 đến 8, nhiệt độ từ 37°C đến 50°C và phương pháp kiểm soát bùn sinh học để nâng cao hiệu suất phân hủy chất hữu cơ khó tan trong các bể SBR hoặc Aerotank.

  2. Nhà nghiên cứu, giảng viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập vi khuẩn, kỹ thuật định lượng hoạt tính enzym bằng phương pháp DNSA, quy trình định danh vi khuẩn bằng kit chuẩn API 50 CHB kết hợp giải trình tự gen 16S rRNA.

  3. Chủ doanh nghiệp chế biến nông sản, thực phẩm và chủ trang trại chăn nuôi quy mô công nghiệp: Cung cấp giải pháp công nghệ sinh học an toàn, chi phí thấp, tận dụng nguồn vi khuẩn bản địa để xử lý triệt để nước thải sau biogas, giúp chất lượng nước xả thải đạt tiêu chuẩn QCVN 40:2011/BTNMT cột A hoặc B.

  4. Cơ quan quản lý nhà nước về tài nguyên môi trường và cán bộ khuyến nông: Sử dụng số liệu nghiên cứu làm cơ sở khoa học để xây dựng hướng dẫn kỹ thuật xử lý ô nhiễm hữu cơ và định hướng phát triển các mô hình kinh tế tuần hoàn, nông nghiệp xanh bền vững tại địa phương.

Câu hỏi thường gặp

  1. Ba chủng vi khuẩn trong luận văn được phân lập từ đâu và có tên khoa học là gì? Ba chủng vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được phân lập trực tiếp từ nguồn nước thải giàu chất hữu cơ tại Công ty Cổ phần Thực phẩm Xuất khẩu Đồng Giao (Ninh Bình). Bằng khóa phân loại Bergey, kit API 50 CHB và giải trình tự gen 16S rRNA, nghiên cứu xác định NT01 là Bacillus licheniformis, NT03 là Bacillus subtilis và NT05 là Bacillus megaterium.

  2. Hoạt tính enzym xenlulaza của các chủng vi khuẩn đạt mức bao nhiêu và điều kiện nào là tối ưu? Chủng Bacillus licheniformis NT01 đạt hoạt tính xenlulaza cao nhất là 2,6 IU/ml sau 48 giờ nuôi cấy, trong khi NT03 đạt 2,5 IU/ml và NT05 đạt 2,45 IU/ml. Điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp enzym là nhiệt độ 45°C, pH từ 7 đến 8, với nguồn cơ chất cacbon cảm ứng tốt nhất là carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc rỉ đường nồng độ 1%.

  3. Hiệu quả chuyển hóa photpho và nitơ của hệ vi khuẩn này như thế nào? Ở nồng độ photpho 6 mg/l, cả 3 chủng đều tích lũy 100% photphat sau 7 ngày nuôi cấy. Ở nồng độ photpho cao 18 mg/l, chủng NT01 hấp thụ làm giảm 29,12% photphat trong môi trường. Về nitơ amoni (NH4+), chủng NT01 làm giảm 33,34% hàm lượng nitơ sau 15 ngày nuôi cấy, thể hiện khả năng khoáng hóa chất dinh dưỡng rất tốt.

  4. Khi phối trộn cả 3 chủng vi khuẩn vào cùng một hệ thống xử lý có xảy ra hiện tượng ức chế lẫn nhau không? Kết quả thử nghiệm đối kháng vi sinh vật bằng phương pháp cấy đường giao nhau trên môi trường thạch MPA ở 37°C cho thấy các khuẩn lạc phát triển hoàn toàn bình thường tại các điểm giao cắt. Ba chủng vi khuẩn không sinh kháng sinh ức chế nhau mà có mối quan hệ cộng sinh, tương hỗ sinh trưởng khi xử lý nước thải.

  5. Quy mô thử nghiệm thực tế của đề tài được tiến hành như thế nào? Sau khi nghiên cứu đặc tính sinh học trong phòng thí nghiệm, đề tài đã tiến hành nhân giống cấp 1 và cấp 2 đạt mật độ tế bào 10 mũ 9 CFU/ml. Chế phẩm được ứng dụng thử nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ở Đan Phượng, Hà Nội trên hệ thống sục khí liên tục quy mô 2,5 m3/mẻ, cho kết quả giảm mùi và giảm chất hữu cơ rất rõ rệt.

Kết luận

  • Tuyển chọn thành công 3 chủng vi khuẩn bản địa gồm Bacillus licheniformis NT01, Bacillus subtilis NT03 và Bacillus megaterium NT05 có hoạt tính sinh học phân giải chất hữu cơ cao từ nước thải chế biến thực phẩm.
  • Chủng NT01 sở hữu hoạt lực thủy phân mạnh nhất với đường kính vòng phân giải xenluloza đạt 21,0 mm, tinh bột đạt 20,0 mm và hoạt tính enzym xenlulaza cực đại đạt 2,6 IU/ml sau 48 giờ ở 45°C.
  • Hệ vi khuẩn có khả năng loại bỏ 100% photpho hòa tan ở nồng độ 6 mg/l và chuyển hóa giảm trên 33% hàm lượng nitơ amoni sau 15 ngày nuôi cấy.
  • Ba chủng vi khuẩn thích ứng tuyệt vời với dải nhiệt độ rộng từ 37°C đến 50°C, dải pH từ 5 đến 8, nồng độ muối từ 1% đến 5% và hoàn toàn không đối kháng nhau khi phối hợp.
  • Xây dựng thành công quy trình nhân sinh khối đạt mật độ 10 mũ 9 tế bào/ml, ứng dụng hiệu quả trên hệ thống xử lý nước thải sau biogas quy mô 2,5 m3/mẻ.

Đóng góp quan trọng nhất của luận văn là cung cấp cơ sở dữ liệu sinh học và nguồn gen vi sinh vật bản địa chất lượng cao, mở ra hướng ứng dụng chế phẩm sinh học hiệu quả và kinh tế trong xử lý nước thải hữu cơ tại Việt Nam.

Kế hoạch phát triển tiếp theo trong 12 đến 24 tháng tới là hoàn thiện dạng bào chế vi sinh vật dạng bột bất hoạt có hạn sử dụng kéo dài và nâng quy mô thử nghiệm lên 50 đến 200 m3/ngày đêm tại các cụm công nghiệp. Các doanh nghiệp chế biến nông sản và trang trại chăn nuôi được khuyến khích áp dụng công nghệ vi sinh bản địa này để tối ưu hóa chi phí xử lý chất thải và kiến tạo mô hình phát triển xanh bền vững.