MỞ ĐẦU Nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao quá mức cho phép khi đƣợc thải ra sông, hồ sẽ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng làm nƣớc có màu, mùi khó chịu ảnh hƣởng đến môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khoẻ cộng đồng. Do vậy, việc phải loại bỏ nitơ đến mức tối thiểu từ các nguồn nƣớc ô nhiễm trƣớc khi đƣa ra môi trƣờng là cần thiết. Trong số các loại nƣớc thải ô nhiễm, nƣớc thải chăn nuôi là một trong những loại nƣớc thải có hàm lƣợng nitơ cao, có khả năng g y ô nhiễm môi trƣờng và là sinh sống phát triển của nhiều nhóm sinh vật gây bệnh và cũng là loại nƣớc thải ô nhiễm khó xử lý. Có nhiều phƣơng pháp xử lý nitơ khác nhau nhƣ áp dụng các phƣơng pháp hoá học, vật lý nhƣng phƣơng pháp xử lý mang tính bền vững, thân thiện với môi trƣờng vẫn là các phƣơng pháp sinh học với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật trong tự nhiên.
Trong tự nhiên, hầu hết các tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với nhau tạo thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới các hợp chất ngoại bào, hình thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm). Biofilm giúp cho vi sinh vật tồn tại và quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng sinh vật, có thể tận dụng đƣợc nhiều nguồn dinh dƣỡng. Việc nghiên cứu khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân giải nitơ trong nƣớc thải nói chung và nƣớc thải chăn nuôi nói riêng là một hƣớng đi mới nhằm nâng cao hiệu quả trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ góp phần tìm hiểu sự đa dạng sinh học trong tự nhiên. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại Việt Nam.” 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.
Giới thiệu chung về Biofilm Khái niệm màng sinh vật đƣợc hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trƣờng khác nhau thông qua mạng lƣới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra [32], [57]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trƣờng vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tƣợng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trƣởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám d nh của vi sinh vật là một quá trình phức tạp đƣợc điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trƣờng nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào [56].
Vi khu n bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động cụ thể từ môi trƣờng sống nhƣ nguồn chất dinh dƣỡng và oxy. Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [82]. Sự hình thành màng sinh vật đƣợc coi là một trong số những cơ chế tồn tại của vi sinh vật, tại đó vi khu n tận dụng đƣợc các nguồn dinh dƣỡng và nhận đƣợc sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi nhƣ khô hạn, bức xạ cực tím hoặc những chất độc hại. Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng lƣới nhiều gen, tại đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng đƣợc trao đổi qua lại giữa các tế bào vi sinh vật [65].
Biofilm có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác nhƣ nấm, tảo, xạ khu n, vi khu n. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khu n lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang 1.
Các dạng tồn tại của biofilm Biofilm là một dạng tồn tại của sinh vật không chỉ xuất hiện ở trong phòng thí nghiệm mà còn có ở nhiều nơi khác nhau. Biofilm thƣờng đƣợc tìm thấy trên bề mặt các vật liệu rắn (đất, đá, các vật liệu dạng rắn…) nơi ngập nƣớc hoặc bề mặt nơi tiếp xúc với dung dịch nƣớc. Biofilm có thể h nh thành tƣơng tự nhƣ mảng nổi trên bề mặt chất lỏng và trên bề mặt của lá, đặc biệt là ở nơi có độ m cao. Với đầy đủ các nguồn dinh dƣỡng cho quá tr nh sinh trƣởng, một biofilm sẽ nhanh chóng phát triển đạt k ch thƣớc lớn (có thể quan sát phát hiện thấy bằng mắt thƣờng).
Biofilm có thể đƣợc tạo thành bao gồm chỉ một loài vi sinh vật hoặc cũng có thể gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau, nhƣ vi khu n, nấm và tảo; mỗi nhóm thực hiện chức năng trao đổi chất ri ng, nhƣng có quan hệ chặt chẽ với nhau. Do vậy trong thực tế có thể bắt gặp nhiều dạng biofilm đƣợc tạo thành từ các vi sinh vật khác nhau [54]. Trong tự nhiên Biofilm có thể tồn tại ở khắp nơi. Chúng thƣờng đƣợc thấy ở những sinh cảnh có nƣớc, chất dinh dƣỡng và bề mặt.
Từ những sa mạc băng ở Nam Cực đến những khe đá s u hàng ngàn kilomet dƣới lòng đất cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật [67]. Các rừng mƣa nhiệt đới, nơi có độ m cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển phong phú của màng sinh vật, nhƣ r u và những cặn bám dƣới đáy ao, hồ, hay những mảng r u, địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt ao, hồ… [67]. Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá, vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu [67].
Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khu n có trong màng sinh vật bám ở rễ cây. Màng sinh vật đƣợc tạo ra bởi vi khu n cố định nitơ Rhizobium trong rễ cây có thể giúp ngăn ngừa bệnh cho cây trồng [82]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang 1. Trong hệ thống thiết bị nhân tạo Trong các thiết bị nhân tạo, màng sinh vật thƣờng xuất hiện ở các dụng cụ dẫn nƣớc và chứa nƣớc gây tắc nghẽn đƣờng ống, rò rỉ nƣớc hay ô nhiễm môi trƣờng.
Biofilm làm giảm nhiệt trong hệ thống làm mát hoặc hệ thống sƣởi nƣớc [21]. Biofilm trong hệ thống kỹ thuật biển, chẳng hạn nhƣ ống dẫn dầu ngoài khơi, ống dẫn ga công nghiệp có thể dẫn đến sự ăn mòn đáng kể. Ăn mòn chủ yếu là do các yếu tố vô sinh. Tuy nhiên, ít nhất 20% nguy n nh n g y ra ăn mòn là do các vi sinh vật đã bám vào bề mặt kim loại [72].
Trong cơ thể sinh vật Màng sinh vật có trong rất nhiều bệnh nhiễm trùng của cơ thể, ƣớc tính khoảng 80% các bệnh nhiễm trùng [61]. Các quá trình truyền nhiễm có li n quan đến biofilm nhƣ nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, nhiễm trùng ống thông, nhiễm trùng tai giữa, hình thành các mảng bám răng, vi m nƣớu, nhiễm trùng trong bệnh xơ nang. Một số nghiên cứu ghi nhận rằng màng sinh vật có thể giúp chữa lành vết thƣơng ở da và giảm tại chỗ hiệu quả kháng khu n trong chữa bệnh hoặc điều trị nhiễm trùng vết thƣơng da [28]. Màng sinh vật cũng có thể xuất hiện trên các bề mặt của các thiết bị cấy ghép nhƣ các ống thông, van tim nhân tạo…[52].
Thành phần và cấu trúc của biofilm 1. Thành phần của biofilm Về cơ bản màng sinh vật đƣợc cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lƣợng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lƣợng biofilm, 97% là nƣớc, 3-6% còn lại là các hợp chất polymer ngoại bào (EPS) và ion [13]. Các hợp chất ngoại bào Các hợp chất ngoại bào thƣờng có ở vi khu n và vi khu n cổ, tảo và nấm [79]. Đƣợc tiết ra bởi các vi sinh vật trong suốt quá tr nh sinh trƣởng hoặc ph n giải tế bào, EPS gồm có các hợp chất hữu cơ nhƣ polysaccharide, protein, axit nucleic, lipid, axit uronic và các đại phân tử sinh học khác [18], [79].
Sau nƣớc, 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nguyễn Thị Giang polysaccharide và protein là các thành phần chính của EPS và rất khác nhau về thành phần, cấu trúc, tính chất [35]. Phần lớn các polysaccharide của EPS là polyanion bởi sự có mặt của cả axit uronic (v dụ nhƣ D - glucuronic, D - galacturonic, và axit mannuronic)và liên kết ceton của pyruvate [74]. Ở những protein ngoại bào, nhiều axit amin khác nhau mang điện t ch m. Có nhiều nhóm chức hóa học nhƣ carboxyl, phosphate, sulfate trong các axit amin [79].
T nh chất này rất quan trọng bởi nó cho ph p các ph n tử polysaccarit ngoại bào li n kết đƣợc với các ion dƣơng hóa trị II nhƣ Ca2+ và Mg2+. Từ đó h nh thành li n kết ch o giữa các sợi polymer và tạo ra lực li n kết lớn hơn trong cấu trúc màng sinh vật. Trong trƣờng hợp của một số vi khu n gram dƣơng nhƣ Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lƣới ngoại bào có thể hoàn toàn khác nhau và gồm chủ yếu là các ion dƣơng. Sutherland đã ghi nhận hai thuộc t nh quan trọng của mạng lƣới ngoại bào.