Nghiên Cứu Vi Sinh Vật Đối Kháng Nấm Phytophthora Gây Bệnh Trên Cây Có Múi

Tài liệu nghiên cứu Luận văn sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora sp, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Nguyễn Thị Diệu Hương
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Hồng Hiển
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. MỞ ĐẦU
• 7. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
• 8. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
• 9. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 9.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI
• 9.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới
• 9.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam
• 9.2. Sâu bệnh hại trên cây có múi
• 9.2.1. Sâu đục cành
• 9.2.2. Sâu vẽ bùa
• 9.3. Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi
• 9.4. Cơ chế gây bệnh
• 9.5. Biện pháp phòng trừ
• 9.6. Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật
• 9.7. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước
• 9.7.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở ngoài nước
• 9.7.2. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong nước
• 10. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 10.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 10.2. Môi trường nghiên cứu
• 10.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng
• 10.4. Phương pháp nghiên cứu
• 10.4.1. Giữ giống vi sinh vật
• 10.4.2. Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh
• 10.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm
• 10.4.4. Phương pháp tái lây nhiễm
• 10.4.5. Đánh giá đặc điểm sinh học
• 10.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh vật
• 10.4.7. Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật
• 10.4.8. Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn
• 11. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 11.1. Phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 11.1.1. Lây nhiễm nhân tạo
• 11.1.2. Đặc điểm hình thái
• 11.1.3. Một số đặc điểm sinh học của chủng HDB và DB5
• 11.1.4. Định danh chủng nấm DB5
• 11.2. Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 11.2.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng
• 11.2.2. Một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn 38
• 11.2.3. Định danh chủng xạ khuẩn 38
• 11.2.4. Một số đặc điểm sinh học và phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2
• 11.2.5. Định danh 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2
• 11.3. Kết quả phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây
• 11.4. Kết quả sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi
• 12. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Nấm Phytophthora Trên Cây Có Múi

Nghiên cứu về nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi là một lĩnh vực quan trọng trong bảo vệ thực vật. Bệnh do nấm này gây ra, như bệnh thối rễ, bệnh loét sẹo, và bệnh chảy gôm, gây thiệt hại lớn cho ngành trồng cây có múi. Các biện pháp phòng trừ hiện tại thường gặp nhiều hạn chế, đặc biệt là khi bệnh đã phát triển mạnh. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế, thân thiện với môi trường hơn là vô cùng cần thiết. Một trong những hướng đi đầy hứa hẹn là sử dụng vi sinh vật đối kháng để kiểm soát nấm bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc sàng lọc và định danh các chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora, từ đó góp phần vào việc phát triển các biện pháp phòng trừ nấm Phytophthora bền vững và hiệu quả hơn cho cây có múi.

1.1. Tầm quan trọng của cây có múi trong nông nghiệp

Cây có múi đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, cung cấp nguồn trái cây giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, bệnh hại cây trồng, đặc biệt là các bệnh do nấm bệnh gây ra, đang là một thách thức lớn đối với người trồng. Việc phòng bệnh cho cây có múi hiệu quả là yếu tố then chốt để đảm bảo năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.2. Các bệnh hại chính do nấm Phytophthora gây ra

Nấm Phytophthora gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên cây có múi, bao gồm bệnh thối rễ, bệnh loét sẹo, và bệnh chảy gôm. Các bệnh này có thể gây suy yếu cây, giảm năng suất, và thậm chí gây chết cây. Việc điều trị bệnh cho cây có múi do nấm Phytophthora gây ra thường gặp nhiều khó khăn do nấm có khả năng tồn tại lâu trong đất và lây lan nhanh chóng.

1.3. Ưu điểm của biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh

Sử dụng vi sinh vật đối kháng là một phương pháp sinh học đầy tiềm năng để kiểm soát nấm Phytophthora. Kiểm soát sinh học mang lại nhiều ưu điểm so với các biện pháp hóa học, bao gồm tính an toàn cao, thân thiện với môi trường, và khả năng tạo ra sản phẩm nông nghiệp sạch. Ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong nông nghiệp đang ngày càng được quan tâm và phát triển.

II. Thách Thức Từ Nấm Phytophthora Gây Bệnh Cho Cây Có Múi

Nấm Phytophthora là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất trên cây có múi. Chúng gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả. Việc phòng trừ nấm Phytophthora gặp nhiều khó khăn do nấm có khả năng tồn tại lâu trong đất, lây lan nhanh chóng qua nước và gió, và có thể phát triển trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Các biện pháp hóa học thường không mang lại hiệu quả lâu dài và có thể gây hại cho môi trường. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), đặc biệt là sử dụng tác nhân sinh học, là vô cùng cần thiết để bảo vệ sức khỏe cây trồng và đảm bảo sản xuất cây có múi bền vững.

2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora gây bệnh

Nấm Phytophthora là một loại nấm bệnh thuộc lớp Oomycetes, có khả năng sinh sản hữu tính và vô tính. Chúng có thể tồn tại trong đất dưới dạng bào tử nghỉ, giúp chúng sống sót qua các điều kiện bất lợi. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm và xâm nhập vào rễ, thân, hoặc quả của cây có múi, gây ra các triệu chứng bệnh.

2.2. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm

Sự phát triển của nấm Phytophthora bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố môi trường, bao gồm độ ẩm, nhiệt độ, và pH đất. Nấm phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, nhiệt độ ấm áp, và đất có pH thấp. Việc cải tạo đất và quản lý dinh dưỡng hợp lý có thể giúp hạn chế sự phát triển của nấm.

2.3. Tác động kinh tế của bệnh do nấm Phytophthora gây ra

Bệnh do nấm Phytophthora gây ra có thể gây thiệt hại kinh tế lớn cho người trồng cây có múi. Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng quả, và thậm chí gây chết cây. Chi phí cho việc phòng trừ sâu bệnh cũng tăng lên đáng kể. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các biện pháp phòng trừ nấm Phytophthora hiệu quả là vô cùng quan trọng.

III. Phân Lập Vi Sinh Vật Đối Kháng Nấm Phytophthora Hiệu Quả

Việc phân lập vi sinh vật đối kháng là bước đầu tiên quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp kiểm soát sinh học nấm Phytophthora. Các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, và nấm có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora có thể được tìm thấy trong môi trường đất, trên bề mặt lá, hoặc trong rễ của cây có múi. Quá trình phân lập vi sinh vật đối kháng đòi hỏi các kỹ thuật chuyên môn và sự kiên nhẫn để chọn lọc ra các chủng có hoạt tính cao. Các chủng này sau đó sẽ được đánh giá về hiệu quả đối kháng và khả năng ứng dụng trong thực tế.

3.1. Phương pháp thu thập mẫu đất và cây trồng

Mẫu đất và cây trồng cần được thu thập từ các vùng trồng cây có múi bị nhiễm bệnh nấm Phytophthora. Mẫu đất nên được lấy từ vùng rễ cây, nơi nấm có mật độ cao. Mẫu cây trồng nên bao gồm rễ, thân, và lá có triệu chứng bệnh. Các mẫu cần được bảo quản và vận chuyển đúng cách để đảm bảo tính chính xác của quá trình phân lập vi sinh vật đối kháng.

3.2. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật từ mẫu

Có nhiều kỹ thuật phân lập vi sinh vật khác nhau, bao gồm phương pháp pha loãng liên tiếp, phương pháp trải đĩa, và phương pháp sử dụng môi trường chọn lọc. Phương pháp pha loãng liên tiếp và trải đĩa thường được sử dụng để phân lập các chủng vi khuẩn và nấm. Phương pháp sử dụng môi trường chọn lọc được sử dụng để phân lập các chủng xạ khuẩn.

3.3. Đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật phân lập

Sau khi phân lập vi sinh vật, cần tiến hành đánh giá hiệu quả đối kháng của chúng đối với nấm Phytophthora. Phương pháp thường được sử dụng là phương pháp đối kháng trên đĩa thạch, trong đó vi sinh vật được cấy cạnh nấm và quan sát khả năng ức chế sự phát triển của nấm. Các chủng có hoạt tính cao sẽ được chọn lọc để nghiên cứu tiếp.

IV. Định Danh Và Nghiên Cứu Đặc Điểm Vi Sinh Vật Đối Kháng

Sau khi phân lập và sàng lọc, việc định danh vi sinh vật đối kháng là bước quan trọng để xác định chính xác loài và chủng của chúng. Việc này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế đối kháng và khả năng ứng dụng của chúng trong thực tế. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi sinh vật đối kháng, như khả năng sinh trưởng, khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khác nhau, và khả năng sản xuất các chất kháng sinh, cũng rất quan trọng để đánh giá tiềm năng của chúng trong việc phòng trừ bệnh cho cây có múi.

4.1. Phương pháp định danh vi sinh vật đối kháng

Có nhiều phương pháp định danh vi sinh vật, bao gồm phương pháp hình thái, phương pháp sinh hóa, và phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp hình thái dựa trên các đặc điểm hình thái của vi sinh vật, như hình dạng tế bào, kích thước khuẩn lạc, và màu sắc. Phương pháp sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau và khả năng sản xuất các enzyme khác nhau. Phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc phân tích DNA của vi sinh vật.

4.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi sinh vật đối kháng

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi sinh vật đối kháng giúp hiểu rõ hơn về khả năng thích nghi và phát triển của chúng trong các điều kiện môi trường khác nhau. Các đặc điểm cần nghiên cứu bao gồm khả năng sinh trưởng ở các nhiệt độ và pH khác nhau, khả năng chịu đựng các chất độc hại, và khả năng sản xuất các chất kháng sinh.

4.3. Xác định cơ chế đối kháng của vi sinh vật

Việc xác định cơ chế đối kháng của vi sinh vật giúp hiểu rõ hơn về cách chúng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora. Các cơ chế đối kháng có thể bao gồm cạnh tranh dinh dưỡng, sản xuất các chất kháng sinh, ký sinh trực tiếp lên nấm, hoặc kích thích sức đề kháng của cây.

V. Ứng Dụng Vi Sinh Vật Đối Kháng Trong Sản Xuất Cây Có Múi

Việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong sản xuất cây có múi là một giải pháp nông nghiệp hữu cơ đầy tiềm năng để kiểm soát nấm Phytophthora. Các sản phẩm sinh học chứa vi sinh vật đối kháng có thể được sử dụng để xử lý đất, phun lên lá, hoặc nhúng rễ cây trước khi trồng. Việc sử dụng vi sinh vật đối kháng giúp giảm thiểu việc sử dụng các loại thuốc hóa học độc hại, bảo vệ môi trường đất, và tạo ra sản phẩm nông nghiệp sạch.

5.1. Phát triển các sản phẩm sinh học từ vi sinh vật đối kháng

Để ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong thực tế, cần phát triển các sản phẩm sinh học có chất lượng cao và dễ sử dụng. Các sản phẩm này có thể ở dạng lỏng, dạng bột, hoặc dạng hạt. Quá trình sản xuất cần đảm bảo vi sinh vật vẫn còn sống và có hoạt tính cao.

5.2. Thử nghiệm hiệu quả của sản phẩm trên đồng ruộng

Trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi, các sản phẩm sinh học cần được thử nghiệm trên đồng ruộng để đánh giá hiệu quả kinh tế và khả năng kiểm soát bệnh trong điều kiện thực tế. Các thử nghiệm cần được thực hiện theo quy trình khoa học và có đối chứng để đảm bảo tính chính xác.

5.3. Xây dựng quy trình sử dụng vi sinh vật đối kháng hiệu quả

Để đạt được hiệu quả cao nhất, cần xây dựng quy trình canh tác sử dụng vi sinh vật đối kháng một cách hợp lý. Quy trình này cần bao gồm các hướng dẫn về thời điểm sử dụng, liều lượng sử dụng, và cách sử dụng sản phẩm. Việc kết hợp vi sinh vật đối kháng với các biện pháp quản lý dinh dưỡng và kỹ thuật canh tác khác có thể giúp tăng cường hiệu quả kiểm soát bệnh.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Vi Sinh Vật Đối Kháng

Nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora trên cây có múi mở ra một hướng đi mới trong việc bảo vệ thực vật và sản xuất nông nghiệp bền vững. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm sinh học từ vi sinh vật đối kháng sẽ góp phần giảm thiểu sự phụ thuộc vào các loại thuốc hóa học độc hại, bảo vệ môi trường, và nâng cao sức khỏe cây trồng. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao hơn, hiểu rõ hơn về cơ chế đối kháng, và phát triển các quy trình canh tác sử dụng vi sinh vật đối kháng một cách hiệu quả.

6.1. Tổng kết các kết quả nghiên cứu chính

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và định danh một số chủng vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora. Các chủng này đã được nghiên cứu về đặc điểm sinh học và cơ chế đối kháng. Các kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn của vi sinh vật đối kháng trong việc phòng trừ bệnh cho cây có múi.

6.2. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo

Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao hơn, nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đối kháng, và phát triển các sản phẩm sinh học có chất lượng cao và dễ sử dụng. Ngoài ra, cần nghiên cứu về tác động của vi sinh vật đối kháng đến hệ vi sinh vật đất và sức khỏe cây trồng.

6.3. Tầm quan trọng của nghiên cứu đối với nông nghiệp bền vững

Nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển nông nghiệp bền vững. Việc sử dụng vi sinh vật đối kháng giúp giảm thiểu việc sử dụng các loại thuốc hóa học độc hại, bảo vệ môi trường, và tạo ra sản phẩm nông nghiệp sạch. Điều này góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế và an toàn sinh học cho ngành trồng cây có múi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây ăn quả có múi đóng vai trò chiến lược trong cơ cấu nông nghiệp toàn cầu với tổng sản lượng hàng năm dao động từ 123 đến 131 triệu tấn giai đoạn 2011-2016. Tại Việt Nam, nhóm cây này ghi nhận sự bứt phá mạnh mẽ khi diện tích năm 2017 tăng thêm 52.000 ha so với năm 2016, đưa sản lượng cam, quýt, bưởi năm 2018 đạt 1.697,9 nghìn tấn, tăng trưởng 10,9% so với năm trước. Tuy nhiên, sự thâm canh hóa ồ ạt đi kèm với diễn biến dịch bệnh phức tạp, đặc biệt là các hội chứng thối gốc chảy mủ, thối rễ, vàng lá và thối nâu quả do vi nấm thuộc chi Phytophthora gây ra, làm suy giảm ước tính 20% đến 30% năng suất tại nhiều vùng trồng trọng điểm. Các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học phổ biến như Aliette hay Ridomil mang lại hiệu quả hạn chế do mầm bệnh lưu tồn sâu trong đất, đồng thời gây suy thoái hệ sinh thái nông nghiệp và để lại tồn dư độc hại.

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Diệu Hương được thực hiện nhằm giải quyết triệt để bài toán trên thông qua mục tiêu sàng lọc, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật bản địa có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi. Đề tài được triển khai trong phạm vi thời gian từ tháng 4/2019 đến tháng 9/2019 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, xử lý 18 mẫu bệnh phẩm thu thập từ 4 tỉnh thành trọng điểm gồm Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái. Công trình mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi cung cấp nguồn giống vi sinh vật hữu ích gồm 1 chủng xạ khuẩn và 2 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế mầm bệnh vượt trội, tạo nền tảng sản xuất các chế phẩm sinh học an toàn thay thế hóa chất độc hại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Đề tài xây dựng trên nền tảng lý thuyết kiểm soát sinh học trong bảo vệ thực vật và lý thuyết tương tác đối kháng vi sinh vật. Trong hệ sinh thái đất và vùng rễ cây trồng, các vi sinh vật đối kháng cạnh tranh nguồn dinh dưỡng thiết yếu như nguyên tố sắt thông qua việc tiết siderophore, đồng thời chiếm lĩnh các vị trí bám trên rễ để ngăn chặn sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh. Cơ chế thứ hai là sự ức chế trực tiếp thông qua việc tổng hợp các hợp chất kháng sinh tự nhiên; trong đó, chi Streptomyces chiếm hơn 66% tổng số kháng sinh tự nhiên đã được phát hiện trên toàn cầu. Cơ chế thứ ba là sự phân giải cấu trúc thành tế bào vi nấm nhờ hệ enzyme ngoại bào như chitinase và glucanase.

Ba khái niệm học thuật cốt lõi được vận dụng xuyên suốt gồm: Vi nấm gây bệnh Phytophthora thuộc lớp nấm trứng Oomycetes có thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ glucan và cellulose; Nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật có khả năng kích kháng hệ thống; Nhóm xạ khuẩn đối kháng sinh chất trao đổi chất thứ cấp ức chế nấm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thu thập cỡ mẫu gồm 18 mẫu thực địa (12 mẫu đất, 2 mẫu rễ, 2 mẫu thân, 2 mẫu lá và 2 mẫu quả) từ những cây cam, chanh, bưởi có triệu chứng điển hình tại 4 vùng sinh thái. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm tối ưu hóa khả năng phân lập mầm bệnh từ tầng đất 10-30 cm theo hình chiếu tán cây. Nguồn vi sinh vật đối kháng gồm 80 chủng xạ khuẩn và 30 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Vi sinh.

Quy trình phân lập nấm bệnh sử dụng phương pháp bẫy sinh học bằng cánh hoa hồng kết hợp nuôi cấy trực tiếp trên môi trường PDA và thạch nước WA ở 30 độ C. Độc lực của các chủng nấm được thẩm định bằng phương pháp tái lây nhiễm nhân tạo qua vết rạch cơ giới dài 3-4 mm trên quả chanh, theo dõi liên tục trong 7 ngày. Khả năng đối kháng của vi sinh vật được đánh giá in vitro bằng phương pháp đồng nuôi cấy 4 góc trên đĩa thạch PGA và phương pháp khuếch tán đĩa thạch.

Để định danh chính xác ở mức độ loài, nghiên cứu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại: tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 30 chu kỳ khuếch đại vùng ITS rRNA bằng cặp mồi ITS1/ITS4 đối với nấm, và vùng 16S rRNA bằng cặp mồi 27F/1492R đối với vi khuẩn và xạ khuẩn. Trình tự gen được xử lý bằng công cụ Blast, gióng hàng qua ClustalX2 và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Maximum Parsimony với thuật toán Bootstrap 1000 lần lặp lại nhằm đảm bảo độ tin cậy khoa học cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 18 mẫu bệnh phẩm ban đầu, nghiên cứu đã phân lập thành công 5 chủng nấm ký hiệu là DB1, DB5, RB, HQC và HDB. Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh xác định chính xác 2 chủng nấm HDB và DB5 (chiếm 40% tổng số chủng nấm phân lập) có khả năng gây bệnh thực sự, làm quả chuyển hoàn toàn từ màu vàng sang nâu thối sau 7 ngày lây nhiễm.

Khảo sát đặc tính sinh học ghi nhận cả 2 chủng nấm này đều không sinh enzyme cellulase ngoại bào. Kết hợp hình thái sợi nấm không vách ngăn, bào tử hình quả chanh và phân tích trình tự ITS rRNA, chủng DB5 được định danh chính xác là Phytophthora colocasiae DB5.

Trong tập đoàn 110 chủng vi sinh vật sàng lọc (80 xạ khuẩn và 30 vi khuẩn), nghiên cứu đã tuyển chọn được 3 chủng có hoạt tính ức chế đối kháng mạnh mẽ nhất (đạt tỷ lệ khoảng 2,7%):

• Chủng xạ khuẩn số 38 tạo vòng ức chế nấm bệnh rõ rệt, khuẩn lạc chuyển màu xám sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Gause-I, cuống sinh bào tử dạng xoắn sau 24 giờ và duỗi thẳng sau 36 giờ. Phân tích gen 16S rRNA định danh chủng này là Streptomyces mutabilis 38.
• Chủng vi khuẩn VK1 là trực khuẩn Gram âm, khuẩn lạc tròn mép trơn bề mặt nhầy, được định danh là Pseudomonas aeruginosa VK1.
• Chủng vi khuẩn VK2 là trực khuẩn Gram dương, khuẩn lạc mép trơn bề mặt khô, được định danh là Bacillus velezensis VK2.

Thảo luận kết quả

Phát hiện về việc hai chủng nấm Phytophthora không có khả năng sinh enzyme cellulase mang ý nghĩa giải phẫu bệnh học sâu sắc. Kết quả này giải thích rõ tại sao trong các thí nghiệm đối chứng không tạo vết thương cơ giới, việc tưới dịch nấm không làm quả chanh bị nhiễm bệnh. Nấm Phytophthora bắt buộc phải xâm nhập qua các vết nứt, tổn thương cơ học do canh tác hoặc vết chích của côn trùng và tuyến trùng.

Dữ liệu nghiên cứu đối kháng có thể được trực quan hóa qua biểu đồ so sánh đường kính vòng kháng nấm trên đĩa thạch PGA sau 3 ngày và bảng tổng hợp các chỉ số sinh lý. Chủng Streptomyces mutabilis 38 thể hiện khả năng thích ứng sinh thái vượt trội khi phát triển tốt ở dải nhiệt độ 30-37 độ C và chịu được nồng độ muối NaCl lên tới 7%, xếp vào nhóm chịu mặn trung bình. Đây là đặc tính ưu việt giúp chủng xạ khuẩn này dễ dàng tồn tại trong nhiều điều kiện thổ nhưỡng khắc nghiệt, kể cả các vùng đất chuyển đổi nhiễm mặn nhẹ.

Bên cạnh đó, Bacillus velezensis VK2 và Pseudomonas aeruginosa VK1 thể hiện hoạt tính kháng nấm thông qua việc cạnh tranh sinh khối nhanh và tiết các hợp chất kháng sinh ngoại bào. Kết quả phân loại phân tử trên cây phát sinh MEGA7 với độ tin cậy bootstrap đạt mức cao đã củng cố tính chính xác tuyệt đối của quá trình định danh loài.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết luận thực nghiệm, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp mang tính ứng dụng cao cho sản xuất nông nghiệp:

1. Tối ưu hóa công nghệ lên men vi sinh: Các phòng thí nghiệm và cơ sở nghiên cứu vi sinh cần triển khai tối ưu hóa môi trường nuôi cấy lỏng cho chủng Bacillus velezensis VK2 và Streptomyces mutabilis 38, phấn đấu đạt mật độ tế bào hữu hiệu trên 10 mũ 9 CFU/ml trong khung thời gian 6 đến 12 tháng.

2. Sản xuất chế phẩm sinh học phức hệ: Doanh nghiệp sản xuất phân bón và thuốc sinh học cần phối hợp với Học viện Nông nghiệp Việt Nam để phối trộn tổ hợp vi sinh vật đối kháng VK2 và chủng 38 trên nền chất mang hữu cơ vi sinh, đặt mục tiêu giảm tỷ lệ bệnh thối gốc và thối quả từ 50% đến 70% trong các đợt thử nghiệm đồng ruộng kéo dài 18 tháng.

3. Hoàn thiện quy trình canh tác tổng hợp: Cán bộ khuyến nông cần hướng dẫn bà con nông dân kết hợp bón lót chế phẩm sinh học định kỳ 30 ngày một lần vào đầu mùa mưa, đồng thời tuyệt đối tránh gây tổn thương cơ giới ở phần gốc và rễ cây trong quá trình làm cỏ, bón phân nhằm triệt tiêu cửa ngõ xâm nhập của nấm.

4. Đánh giá an toàn sinh học môi trường: Cơ quan chuyên môn cần tiến hành khảo sát độc tính sinh thái và tính an toàn tuyệt đối của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa VK1 đối với động vật máu nóng trước khi đưa vào sản xuất thương phẩm diện rộng trong lộ trình 12 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là nguồn tài liệu khoa học chuyên sâu và hữu ích cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật: Tham khảo phương pháp luận chuẩn mực về quy trình bẫy nấm Oomycetes, kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo và các bước định danh vi sinh vật bằng công cụ sinh học phân tử MEGA7.

2. Chuyên viên nghiên cứu và phát triển tại các doanh nghiệp nông nghiệp sinh học: Ứng dụng nguồn gen các chủng vi sinh vật đối kháng bản địa như Streptomyces mutabilis 38 và Bacillus velezensis VK2 để phát triển dòng sản phẩm thuốc trừ bệnh sinh học thế hệ mới.

3. Cán bộ kỹ thuật nông nghiệp và khuyến nông viên cấp tỉnh, huyện: Khai thác hiểu biết về cơ chế xâm nhiễm của nấm Phytophthora qua vết thương cơ học để xây dựng tài liệu tập huấn phòng trừ dịch bệnh chuẩn xác cho các vùng chuyên canh cây ăn quả.

4. Chủ trang trại và hợp tác xã sản xuất quả có múi tiêu chuẩn VietGAP, GlobalGAP: Nắm bắt giải pháp kiểm soát sinh học an toàn nhằm thay thế dần thuốc bảo vệ thực vật hóa học, nâng cao chất lượng và giá trị xuất khẩu của nông sản.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nấm Phytophthora chỉ gây thối nhũn khi vỏ quả có vết thương cơ giới? Do chủng nấm Phytophthora phân lập không có khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase để tự phá vỡ lớp biểu bì thực vật. Thực nghiệm cho thấy chỉ những quả chanh có vết cắt 3-4 mm mới bị nấm xâm nhập và thối nâu sau 7 ngày, trong khi quả nguyên vẹn không bị nhiễm bệnh.

Chủng xạ khuẩn Streptomyces mutabilis 38 sở hữu những ưu điểm vượt trội nào? Chủng Streptomyces mutabilis 38 có hoạt tính ức chế mạnh nấm bệnh HDB và DB5, sinh trưởng tối ưu ở 30-37 độ C và chịu được nồng độ muối NaCl tới 7%. Đây là đặc tính giúp xạ khuẩn duy trì sức sống bền bỉ trong điều kiện đất đai khắc nghiệt tại Việt Nam.

Kỹ thuật bẫy nấm bằng cánh hoa hồng hoạt động theo nguyên lý nào? Đây là phương pháp bẫy sinh học hiệu quả để phân lập Phytophthora từ đất và mô bệnh. Cánh hoa hồng nổi trên mặt nước thu hút các động tử nấm bơi đến xâm nhiễm. Sau 3 ngày, cánh hoa chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh gián, giúp dễ dàng tách nấm thuần khiết trên môi trường PDA.

Chủng vi khuẩn Bacillus velezensis VK2 ức chế nấm bệnh bằng cơ chế gì? Bacillus velezensis VK2 là trực khuẩn Gram dương có tốc độ sinh trưởng nhanh, tạo màng sinh học chiếm giữ vùng rễ và tiết ra các chất kháng sinh thứ cấp cùng enzyme phân hủy vách tế bào nấm, từ đó ngăn chặn sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm Phytophthora.

Luận văn đã sử dụng phương pháp nào để định danh chính xác các chủng vi sinh vật? Tác giả đã kết hợp phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa với kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ITS rRNA cho nấm và 16S rRNA cho vi khuẩn, xạ khuẩn. Trình tự sau đó được phân tích trên hệ thống ngân hàng gen và dựng cây phân loại MEGA7 qua 1000 lần lặp bootstrap.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công 5 chủng nấm từ 18 mẫu thực địa tại 4 tỉnh miền Bắc, chứng minh 2 chủng HDB và DB5 có độc lực gây bệnh thối trên cây có múi.
• Khám phá đặc tính sinh học then chốt: nấm Phytophthora không sinh enzyme cellulase, khẳng định vết thương cơ giới là điều kiện bắt buộc để nấm xâm nhiễm gây hại.
• Tuyển chọn thành công 3 chủng vi sinh vật đối kháng xuất sắc gồm 1 chủng xạ khuẩn và 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế mạnh cả 2 chủng nấm bệnh.
• Định danh chính xác bằng sinh học phân tử các chủng nghiên cứu gồm Phytophthora colocasiae DB5, Streptomyces mutabilis 38, Bacillus velezensis VK2 và Pseudomonas aeruginosa VK1.
• Tạo tiền đề khoa học vững chắc để các đơn vị nghiên cứu tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học đa chủng trong giai đoạn 2020-2025.

Quý độc giả và các nhà khoa học quan tâm đến công nghệ sinh học nông nghiệp có thể tiếp tục khai thác dữ liệu từ công trình này để đẩy mạnh ứng dụng kiểm soát sinh học bền vững cho nền nông nghiệp xanh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Gần đây, diễn biến dịch bệnh trên cây có múi vẫn rất phức tạp mà nguyên nhân không phải là do bệnh mới. Trong những năm gần đây từ năm 2015, thế giới sản xuất 1.938 triệu tấn nước cam (chuyển đổi sang FCOJ), tỉ lệ này ngày càng giảm chủ yếu do dịch bệnh. Theo nghiên cứu dịch bệnh chủ yếu do nấm Phytophthora sp. gây ra là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất làm giảm sút sản lượng của cây có múi.

Bệnh thường xuất hiện và tấn công ở các vườn trồng trên nền đất thấp, kém thoát nước. Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở xung quanh gốc hay ở chản hai, chản ba của cây, sau đó vỏ cây bị thối có màu nâu hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ nhựa ra màu nâu đen và có mùi hôi. Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế bệnh dịch trên cây có múi nhưng chỉ dừng lại ở phòng bệnh là chính. Tuy nhiên, trong những trường hợp bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc phun để tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế bệnh lây lan như: Aliette, Ridomil, Phosacide.

Do tác nhân gây bệnh tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân sát mặt đất nên hiệu quả của các loại thuốc này còn thấp. Bên cạnh đó việc sử dụng thuốc hóa học để phòng hay trừ bệnh không những không đạt kết quả như mong đợi, chúng còn gây ra ảnh hưởng không tốt với sức khỏe con người, môi trường và các sinh vật sống khác. Do những tác động bất lợi kể trên của thuốc hóa học, việc sử dụng vi sinh vật thay thế các loại thuốc hóa học được coi là sự thay thế bền vững để kiểm soát sâu bệnh và mầm bệnh thực vật (Chandler et al. Kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các vi sinh vật đã và đang trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành công nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc mới, các hoạt chất kháng khuẩn mới, an toàn và thân thiện hơn.

Hơn nữa, tình hình biến động của chủng nấm cũng như bệnh dịch ngày một gia tăng. Đặc biệt ở nước vùng nhiệt đới như ở Việt Nam thì bệnh dịch ngày một lan rộng. Trước tình hình gây bệnh trên họ cam chanh của nấm Phytophthora sp chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi”.

MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập một số chủng nấm Phytophthora sp. có khả năng gây bệnh cây trên cây có múi.

Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng nấm đã phân lập được. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với chủng nấm phân lập được. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh. Định danh một số chủng nấm bệnh và một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh trên cây có múi.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI 2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới Sản xuất quả có múi trên thế giới vẫn tăng do giá trị kinh tế, giá trị dinh dưỡng cao và do tăng trưởng thu nhập của các nền kinh tế mới nổi. Tổng sản lượng quả có múi hàng năm trên thế giới dao động vào khoảng 123 - 131 triệu tấn trong giai đoạn 5 năm từ 2011 đến 2016 (FAO, 2017), trong đó cam chiếm trên 50% tổng sản lượng.

Sản xuất quả có múi vẫn đang tiếp tục tăng do thu nhập của người dân ở một số quốc gia tăng nhanh như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga, Ấn Độ, các nước Đông Âu, các nước ASEAN. Theo FAO, sản lượng quả có múi toàn cầu vào khoảng 131 triệu tấn năm 2015 và 124 triệu tấn năm 2016, bình quân đầu người khoảng 18kg năm 2016. Tiêu thụ bình quân ở các nước phát triển Tây Âu và Bắc Mỹ đạt trên 40 kg/người (Tổng cục Thống kê: Tình hình kinh tế - xã hội năm 2017; FAO, 2017). Trong đó có Mexico là một cường quốc sản xuất và xuất khẩu quả có múi; nằm ở vĩ độ Bắc 10o - 24o, có vị trí địa lý, khí hậu thích hợp với việc trồng cây có múi.

Sản lượng quả có múi của Mexico năm 2016 là 6,634 triệu tấn; với dân số xấp xỉ 130 triệu người. Bình quân sản lượng quả có múi vào khoảng 51,0 kg/người. Diện tích trồng cam cả nước không thay đổi trong 10 năm (2000 - 2010), tổng diện tích là 342.000ha, sản xuất mỗi năm khoảng 4,1 triệu tấn cam; chỉ sau Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ và Mỹ. Niên vụ 2016/2017, Mexico sản xuất khoảng 4,3 triệu tấn cam, năng suất trung bình toàn quốc khoảng 14,3 tấn/ha.

Bên cạnh cây cam, Mexico còn đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu chanh. Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ, niên vụ 2016/2017, sản xuất chanh toàn cầu đạt 7,3 triệu tấn, riêng Mexico đã chiếm 2,4 triệu tấn. Ở Trung Quốc, diện tích và sản lượng quả có múi liên tục tăng trong suốt 40 năm qua. Năm 2008, tổng sản lượng quả có múi ở Trung Quốc lục địa là khoảng 21,7 triệu tấn, 5 năm sau (2013) sản lượng tăng lên 34,3 triệu tấn; năm 2016 đạt khoảng 32,7 triệu tấn (trong đó chủ yếu là quýt).

Bình quân khoảng 23,7 kg/người với dân số 2016 vào khoảng 1,379 tỷ người (FAO, 2017). Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam Tình hình trồng các loại cây ăn quả đặc biệt là cây có múi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta nằm ở trung tâm phát sinh cây ăn quả có múi, có vị trí địa lý thuận lợi, ở vùng thích hợp cho phát sinh và phát triển của nhiều loài quả có múi. Từ Quảng Nam trở vào là diện tích vùng nóng đối với cây có múi.

Bưởi, cam sành và chanh thường phát triển tốt hơn ở vùng này do chịu được nhiệt. Khi nhiệt độ cao quanh năm, cây có múi có thể ra hoa vài lần trong năm. Cây thuộc họ cam chanh là những cây mang giá trị thương mại cao. Theo Bộ NN-PTNT, diện tích cây ăn quả nước ta tăng mạnh đặc biệt là ở các tỉnh phía bắc.

Năm 2017 đã tăng 52000ha so với năm 2016, trong đó diện tích cam tăng 10000ha, diện tích bưởi tăng 13000ha. Trong đó, phần lớn cam chiếm diện tích trồng và sản lượng thu hoạch lớn. Theo Tổng cục thống kê, năm 2017 sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%. Năm 2018, nhóm cây ăn quả nói chung và cây ăn quả có múi nói riêng đạt sản lượng thu hoạch khá do nhiều cây trồng tăng về diện tích và có thị trường tiêu thụ ổn định, tiếp tục tăng mạnh.

Sản lượng cam, quýt, bưởi đạt 1697,9 nghìn tấn tăng 10,9% so với năm trước. Tuy nhiên, cùng với sự thâm canh hóa và gia tăng về diện tích trồng họ cam chanh thì dịch bệnh đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và sự phát triển bền vững của nghề trồng. Sâu bệnh hại trên cây có múi Sâu đục cành Đặc tính sâu bệnh hại: Đây là bệnh phổ biến nhất trên nhóm cây có múi. Sâu đục cành có màu vàng dài khoảng 50mm.

Chúng một khi xâm nhập được vào cây sẽ khoét lỗ và làm tổ trong cành khiến cành bị úa vàng, sinh trưởng kém rồi dần dần héo và chết. Sâu trưởng thành đẻ trứng rải rác khắp nách lá và trên vỏ thân cây. Cứ thế khiến cây bị suy kiệt khô héo mà chết. Cách phòng và trị: tăng cường biện pháp đốn tỉa cây giúp cây được thông thoáng hơn.

Để hạn chế việc xâm nhập của sâu, cần quét vôi lên trên thân cây. Loại bỏ những cành bị sâu bệnh tấn công để chúng không lan rộng ra cả cây. Ngoài ra nếu có quá nhiều thì có thể phun xịt một số loại thuốc kháng sâu bệnh. 4 Sâu vẽ bùa Đặc tính sâu bệnh: Loại sâu này đẻ trứng trên thân cây và khi sâu non nở chúng sẽ tấn công lá ăn hết lớp biểu bì trên bề mặt lá và khiến lá quang hợp kém.

Cây từ đó mà phát triển kém hơn đồng thời làm cho cây còi cọc chậm lớn. Loại sâu vẽ bùa này được hình thành nhiều nhất sau các đợt mưa dài ngày. Cách phòng và trị: Cần theo dõi chặt chẽ những đợt ra lộc của cây. Vì thời điểm này sâu vẽ bùa phát triển khá mạnh sau đợt mưa hoặc khi tưới nước.

Cần sử dụng một số loại thuốc phun đều lên cây như Sumicidin 50EC 0,2%, Polytrin 50EC 0,2%. Chia làm 2 lần phun mỗi lần cách nhau khoảng 10 ngày. Nếu thấy thuyên giảm thì ngừng phun. Theo cẩm nang bệnh cây Texas các nhà khoa học cũng đã lập danh sách các bệnh trên cây có múi.

Bệnh thối đen Nguyên nhân: Bệnh do nấm Alternaria citri xảy ra trên trái cam. Triệu chứng: Ban đầu xuất hiện những đốm nhỏ màu nâu, sau đó vết bệnh phát triển rất nhanh và chuyển dần sang màu đen. Quả bị nhiễm bệnh sẽ đổi màu và có thể rụng sớm. Bệnh vàng lá gân xanh Nguyên nhân: Do vi khuẩn Triệu chứng: Bệnh xảy ra trên cây còn nhỏ gây ra triệu chứng đốm vàng, loang lổ trên lá làm phiến là chuyển màu vàng chỉ còn gân lá màu xanh.

Khi bệnh nặng cây không phát triển, tán lá không đều, các lá mọc thẳng đứng, cứng. Còn cây lớn bị mắc bệnh vàng lá trái nhỏ, méo mó, khi bổ dọc trái thấy tâm trái bị lệch hẳn sang một bên và hạt bị hỏng có màu nâu. Bệnh do nấm Phytophthora Nguyên nhân: bệnh do nấm Phytophthora citrophthora, P. parasitica và các loại Phytophthora sp khác.

Triệu chứng: Thối nâu: Trái cây mọc gần mặt đất bị nhiễm bệnh đầu tiên và sau đó sẽ lây đến những quả mọc cao hơn trên cây. Xuất hiện các vết đốm nâu nhỏ trên 5 quả, sau đó lan rộng thành một vùng. Quả bị nhiễm bệnh có mùi hăng, ôi. Nếu nhiễm qua rễ cây, xâm nhập vào qua vỏ rễ, lan mạnh khắp cây.

Cây bị nhiễm bệnh làm giảm năng xuất và chất lượng quả. Thối gốc chảy mủ: Với loại bệnh này rễ sẽ có biểu hiện như bị thối cả phần lông hút và phần vỏ rễ.