Tổng quan luận án

Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra là một trong những dịch hại nguy hiểm trên cây cao su (Hevea brasiliensis) tại các quốc gia trồng cao su trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Nấm C. cassiicola có phổ ký chủ rộng với hơn 400 loài thực vật, có phương thức sống phức tạp bao gồm hoại sinh, ký sinh và nội sinh. Tại Việt Nam, nấm được ghi nhận lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại Bàu Bàng, tỉnh Bình Dương. Từ năm 2009 đến năm 2010, các đợt dịch bùng phát trên diện rộng tại Tây Nguyên, miền Trung và Đông Nam Bộ đã gây hại hàng chục ngàn hecta cao su, đặc biệt trên các dòng vô tính (DVT) như RRIV 4 và RRIV 3, dẫn đến hiện tượng rụng lá nghiêm trọng, làm giảm sản lượng mủ và gây chết cây. Trước đây, nhiều dòng vô tính cao su được đánh giá là kháng bệnh nhưng sau đó đã bị nhiễm bệnh, cho thấy nấm có khả năng hình thành các nòi sinh lý mới để phá vỡ tính kháng của ký chủ.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: các nghiên cứu về nấm C. cassiicola tại Việt Nam trước đây còn hạn chế về số lượng mẫu phân lập, chủ yếu thu thập cục bộ tại một số tỉnh thuộc vùng Đông Nam Bộ; chưa có nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism) cũng như chưa xác định rõ sự phân bố của các gen mã hóa độc tố cassiicolin (gen Cas) trong quần thể nấm trên phạm vi nhiều vùng địa lý trồng cao su ở Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

  1. Đánh giá sự đa dạng di truyền của 76 mẫu phân lập (MPL) C. cassiicola gây hại trên cây cao su ở Việt Nam bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học và phương pháp hiện đại dựa trên các chỉ thị phân tử.
  2. Xác định khả năng gây bệnh của một số MPL C. cassiicola đại diện cho các phân nhóm di truyền và vùng địa lý khác nhau, từ đó chọn lọc nguồn nấm sử dụng trong nghiên cứu tạo tuyển giống kháng bệnh.
  3. Đánh giá mức độ mẫn cảm bệnh của một số DVT cao su nhằm phục vụ công tác khuyến cáo giống cho sản xuất.

Đối tượng, thời gian và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

  • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 11 năm 2019.
  • Đối tượng nghiên cứu: 76 mẫu phân lập nấm C. cassiicola thu thập từ lá cao su bị nhiễm bệnh của 16 dòng vô tính cao su trên nhiều vùng địa lý trồng cao su ở Việt Nam.
  • Phạm vi nghiên cứu: Định danh hình thái khuẩn lạc và bào tử; phân tích đa dạng di truyền bằng giải trình tự vùng rDNA-ITS, chỉ thị phân tử SRAP và PCR khuếch đại gen mã hóa độc tố Cas; đánh giá tính gây bệnh của 76 mẫu phân lập trên 2 dòng vô tính RRIV 4 và PB 260 bằng phương pháp lá cắt rời; đánh giá mức độ gây bệnh của 6 mẫu phân lập đại diện trên 12 dòng vô tính cao su trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến nấm C. cassiicola và bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su theo các hướng chính:

  • Lịch sử phát sinh và tác hại dịch bệnh: Bệnh được ghi nhận lần đầu trên cây cao su tại Sierra Leone bởi Mason và Deighton vào năm 1936 (Wei, 1950), sau đó xuất hiện tại Ấn Độ (Ramakrishnan và Pillay, 1961), Malaysia (Newsam, 1961), Nigeria (Awoderu, 1969), Indonesia (Teoh, 1983), Brazil (Junqueira và ctv, 1985), Thái Lan (Pongthep, 1987), Sri Lanka và Cameroon (Liyanage và ctv, 1986; Jayasinghe và ctv, 1996), Bangladesh (Rahman, 1988), Việt Nam (Phan Thanh Dung và Nguyen Thai Hoan, 2000), Trung Quốc (Jinji và ctv, 2007). Các vụ dịch nghiêm trọng gây thiệt hại lớn được ghi nhận tại Malaysia năm 1975 trên DVT RRIM 725 (RRIM, 2000), Sri Lanka giai đoạn 1986–1988 trên DVT RRIC 103 buộc tiêu hủy hơn 4.000 ha với chi phí đền bù hơn 530.000 USD (Liyanage và ctv, 1989), Indonesia thập niên 1980 gây thiệt hại hơn 200 tỉ Rupiah (Liyanage và ctv, 1989), Ấn Độ năm 1999 trên DVT RRII 105 gây hại 5.000 ha (Jacob, 2006). Tại Việt Nam, dịch bùng phát năm 2000 tại Lộc Ninh làm rụng lá 200 ha DVT RRIC 104; năm 2009 tại Kon Tum và Quảng Nam trên 1.700 ha RRIV 4; năm 2010 gây hại trên 6.500 ha vườn cây công ty và 17.000 ha cao su tiểu điền tại miền Đông Nam Bộ (Phan Thanh Dung và Nguyen Anh Nghia, 2011).

  • Đặc điểm hình thái, sinh lý và dịch tễ học: Nghiên cứu phân loại của Wei (1950), Ellis và Holliday (1971); biến thiên hình thái bào tử và khuẩn lạc của Spencer và Walter (1969), Onesirosan và ctv (1974), Chee (1988), Phan Thanh Dung (1995), Darmono và ctv (1996), Silva và ctv (1998), Nguyen Anh Nghia và ctv (2008). Phổ ký chủ trên hơn 400 loài thực vật được Farr và Rossman (2019) tổng hợp. Các nghiên cứu về điều kiện xâm nhiễm, nhiệt độ (tối thích 28°C), ẩm độ (>80%), mùa vụ và giai đoạn lá non mẫn cảm được thực hiện bởi Situmorang và ctv (2000), Pawirosoemardjo và Purwantara (1987), Radziah và ctv (1996), Nguyễn Thái Hoan và ctv (2007).

  • Đa dạng di truyền bằng chỉ thị sinh học phân tử: Các kỹ thuật phân tử đã được áp dụng gồm RFLP, RAPD, rDNA-ITS, ISSR. Tại Indonesia, Darmono và ctv (1996) dùng RAPD chỉ ra độ tương đồng di truyền 95% giữa các mẫu. Tại Thái Lan, Romruensukharom và ctv (2005) chia các mẫu nấm thành 11 nhóm độc tính. Tại Sri Lanka, Silva và ctv (1995, 1998, 2003) phân tích vùng rDNA-ITS và RAPD. Tại Malaysia, Ismail và Jeyanayagi (1999), Atan và Hamid (2003) xác định sự tồn tại của 2 nòi sinh lý; Nguyen Anh Nghia và ctv (2008) dùng chỉ thị ISSR chia 21 mẫu nấm thành 3 nhóm di truyền tương ứng với các nòi nấm. Tại Việt Nam, Nguyen Anh Nghia và ctv (2010b) phân tích 34 mẫu nấm bằng ISSR và rDNA-ITS phát hiện đột biến tại vị trí nucleotide 135; Nguyen Don Hieu và ctv (2014) phân tích 38 mẫu nấm bằng ITS và ISSR chỉ ra 2 nhóm di truyền.

  • Độc tố cassiicolin và gen mã hóa độc tố (gen Cas): Breton và ctv (2000) chứng minh cassiicolin là glycoprotein gây hoại tử tế bào chất tạo triệu chứng "xương cá". Lamotte và ctv (2007) xác định cassiicolin gồm 27 acid amin, khối lượng phân tử 2,3 kDa. Déon và ctv (2012a, 2012b, 2014) phát hiện và phân loại các dạng gen mã hóa độc tố cassiicolin thành 6 nhóm (Cas1 đến Cas6, cùng nhóm không có gen Cas ký hiệu Cas0). Liu và ctv (2015) ghi nhận nấm tại Trung Quốc mang gen Cas2 và Cas5. Shuib và ctv (2015) ghi nhận nấm tại Malaysia mang gen Cas5 và Cas4. Ribeiro và ctv (2019) chứng minh cassiicolin đóng vai trò độc lực chính trong giai đoạn ký sinh trên DVT mẫn cảm.

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống về quy mô thu thập mẫu trên toàn quốc (76 mẫu nấm từ 16 DVT), áp dụng chỉ thị phân tử SRAP lần đầu tiên trên đối tượng C. cassiicola, sàng lọc toàn diện gen mã hóa độc tố Cas, và cung cấp số liệu thực nghiệm so sánh tính gây bệnh giữa điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới trên 12 dòng vô tính cao su chủ lực.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Thuyết "gen đối gen" (gen for gen): Đề xuất bởi Flor (1971), phát triển bởi Dangl và Jones (2001) và Bùi Chí Bửu (2002). Tương tác giữa cây chủ và mầm bệnh dựa trên sự nhận diện giữa phân tử thụ thể (receptor) do gen kháng (R) của cây chủ mã hóa và phân tử kích kháng (elicitor) do gen không độc tính (avr) của mầm bệnh mã hóa, kích hoạt phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive response - HR) để ức chế mầm bệnh.
  • Tính kháng của ký chủ: Phân định tính kháng chất lượng (qualitative resistance) và tính kháng số lượng (quantitative resistance); tính kháng chuyên tính theo nòi (race-specific) và không chuyên tính.
  • Cơ chế độc tố chọn lọc ký chủ: Độc tố cassiicolin (glycoprotein 27 acid amin) do C. cassiicola tiết ra tác động phá hủy màng tế bào, gây hoại tử mô lá tạo triệu chứng hình xương cá dọc theo gân lá, đóng vai trò quyết định độc lực trong pha ký sinh chuyên biệt.

Phương pháp nghiên cứu

  • Phân lập và khảo sát hình thái: 76 mẫu nấm được phân lập từ vết bệnh trên lá cao su thu thập tại nhiều vùng địa lý, nuôi cấy đơn bào tử trên môi trường PSA (Potato Sucrose Agar), PDA (Potato Dextrose Agar) và MEA (Malt Extract Agar). Đánh giá màu sắc, kết cấu tản nấm sau 7 ngày nuôi cấy; đo chiều dài, chiều rộng và đếm số vách ngăn giả của 50 bào tử ngẫu nhiên cho mỗi mẫu phân lập dưới kính hiển vi quang học.
  • Phương pháp sinh học phân tử:
    • Ly trích DNA: Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm nuôi cấy bằng phương pháp CTAB cải tiến.
    • Khuếch đại vùng rDNA-ITS: Sử dụng cặp mồi chuẩn ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') và ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Sản phẩm PCR được giải trình tự, hiệu chỉnh bằng BioEdit, căn hàng bằng ClustalW và xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA.
    • Phân tích chỉ thị SRAP: Sử dụng 30 cặp mồi SRAP (kết hợp từ các mồi xuôi Me1–Me5 và mồi ngược Em1–Em6). Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide, ghi nhận ma trận nhị phân (1/0). Tính toán ma trận khoảng cách di truyền Nei & Li (1979) và thiết lập cây phân nhóm UPGMA với kiểm định Bootstrap 1.000 lần lặp trên phần mềm NTSYS-pc và FreeTree.
    • Nhận diện gen mã hóa độc tố Cas: Sử dụng 7 cặp mồi chuyên biệt khuếch đại các nhóm gen Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6 theo công bố của Déon và ctv (2012a, 2014).
  • Phương pháp khảo sát tính gây bệnh:
    • Thí nghiệm trên lá cắt rời (phòng thí nghiệm): Khảo sát 76 mẫu nấm trên 2 dòng vô tính RRIV 4 (mẫn cảm) và PB 260 (chống chịu), và khảo sát 6 mẫu đại diện trên 12 dòng vô tính (RRIV 1, RRIV 4, RRIV 106, RRIV 109, RRIV 114, RRIV 124, RRIV 206, RRIV 209, RRIV 230, PB 255, PB 260, PB 312). Lá cao su tầng lá ổn định (tầng B) được gây vết thương vi mô, nhỏ giọt huyền phù bào tử (nồng độ $1 \times 10^5$ bào tử/ml), ủ ẩm ở 28°C. Ghi nhận kích thước vết bệnh sau 7 ngày, tính chỉ số bệnh (CSB / PDI) theo thang phân cấp bệnh 0–4.
    • Thí nghiệm lây bệnh trong nhà lưới: Khảo sát 6 mẫu nấm đại diện (CoryLK02, CoryDP03, CoryDN39, CoryKT04, CoryBT17, CorySL02) trên cây con 12 dòng vô tính cao su trong bầu đất. Phun đều dịch huyền phù bào tử ($1 \times 10^5$ bào tử/ml) lên tầng lá non (15–20 ngày tuổi), giữ ẩm 100% trong 48 giờ đầu. Đánh giá tỷ lệ và diện tích lá bị bệnh sau 10 ngày, tính chỉ số bệnh (CSB) và phân cấp mức gây bệnh: rất nhẹ, nhẹ, trung bình, nặng, rất nặng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý luận và các kết quả nghiên cứu đã công bố:

  • Trình bày vị trí kinh tế của cây cao su tại Việt Nam với diện tích 966.800 ha, sản lượng đạt hơn 1 triệu tấn, năng suất bình quân 1.650 kg/ha năm 2018 (Hiệp hội Cao su Việt Nam, 2020).
  • Hệ thống hóa các đợt bùng phát dịch bệnh Corynespora trên thế giới và tại Việt Nam từ năm 1999 đến năm 2011; mô tả chi tiết các dạng triệu chứng hình xương cá, đốm mắt chim, đốm tròn có quầng vàng và khô ngọn chồi non.
  • Phân loại học nấm C. cassiicola thuộc họ Corynesporascaceae, bộ Pleosporales, lớp Ascomycetes; sinh thái phát sinh bệnh chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ (20–30°C), ẩm độ (>80%), lượng mưa và tầng tuổi lá.
  • So sánh các hệ thống chỉ thị phân tử: RFLP, RAPD, ISSR, rDNA-ITS và SRAP; phân tích cấu tạo bộ mồi SRAP nhân bản vùng mã hóa mở ORFs.
  • Trình bày bản chất hóa học, cấu trúc không gian 3D của độc tố cassiicolin, 6 nhóm gen mã hóa độc tố (Cas1 đến Cas6) và hiện tượng tương tác ký sinh – ký chủ theo thuyết "gen đối gen" của Flor.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

  • Bảng danh mục 76 mẫu phân lập nấm C. cassiicola thu thập từ 16 dòng vô tính (RRIV 1, RRIV 2, RRIV 3, RRIV 4, RRIV 5, RRIV 106, RRIV 114, RRIV 124, PB 235, PB 255, PB 260, RRIC 103, RRIC 104, RRIC 110, RRIC 121, GT 1) tại các tỉnh: Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận, Gia Lai, Đắk Lắk, Kon Tum, Quảng Trị, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Sơn La, Lai Châu, Phú Thọ.
  • Bảng thiết kế 30 cặp mồi SRAP (kết hợp từ mồi Me1 đến Me5 và Em1 đến Em6) và 7 cặp mồi khuếch đại gen Cas.
  • Thành phần hóa chất, chu trình nhiệt phản ứng PCR cho vùng rDNA-ITS, chỉ thị SRAP và gen Cas.
  • Phương pháp đánh giá cấp bệnh (0: không bệnh; 1: đốm bệnh < 1 mm; 2: vết bệnh 1–3 mm; 3: vết bệnh 3,1–5 mm; 4: vết bệnh > 5 mm hoặc lan rộng) và công thức tính chỉ số bệnh (CSB / PDI):

$$\text{CSB (%)} = \frac{\sum (n_i \times v_i)}{N \times V} \times 100$$

(Trong đó: $n_i$ là số lá ở cấp bệnh $i$; $v_i$ là cấp bệnh thứ $i$; $N$ là tổng số lá khảo sát; $V$ là cấp bệnh cao nhất).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và thảo luận các số liệu thực nghiệm thu được:

1. Đặc điểm hình thái

  • Hình thái tản nấm: Màu sắc tản nấm trên môi trường PSA sau 7 ngày cấy có sự biến thiên từ xám nhạt, xám tro, xám đậm đến nâu sẫm; kết cấu tản nấm có dạng sợi mịn mọc sát mặt thạch hoặc dạng bông xốp phân lớp đồng tâm; một số mẫu phân lập tiết sắc tố màu hồng vào môi trường dinh dưỡng.
  • Hình thái bào tử: Kích thước bào tử đính biến thiên rất lớn trong cùng một mẫu phân lập và giữa các mẫu phân lập khác nhau. Chiều dài bào tử dao động từ 17,5 µm đến 248,3 µm; chiều rộng dao động từ 4,2 µm đến 18,6 µm; số lượng vách ngăn giả (pseudosepta) biến thiên từ 1 đến 22 vách ngăn.

2. Đa dạng di truyền ở mức độ phân tử

  • Trình tự vùng rDNA-ITS: Cả 76 mẫu phân lập đều khuếch đại được đoạn DNA có kích thước 559 bp. Trình tự nucleotide tương đồng cao ngoại trừ 2 vị trí đa hình nucleotide đơn (SNPs) tại vị trí 135 (vùng ITS1) và vị trí 474 (vùng ITS2), chia 76 mẫu thành 3 nhóm di truyền:
Nhóm di truyền rDNA-ITS Đặc điểm nucleotide Số lượng mẫu phân lập Tỷ lệ (%)
Nhóm 1 Cytosine (C) tại vị trí 135 38 50,0
Nhóm 2 Thymine (T) tại vị trí 135 35 46,1
Nhóm 3 Adenine (A) tại vị trí 474 3 3,9

  • Chỉ thị phân tử SRAP: 30 cặp mồi SRAP khuếch đại tổng cộng 223 băng DNA, trong đó có 208 băng đa hình, đạt tỷ lệ đa hình 93,3%. Phân tích UPGMA dựa trên hệ số Nei & Li chia 76 mẫu nấm thành 2 nhóm chính với hệ số tương đồng di truyền 67%:

    • Nhóm I (54 mẫu phân lập, bootstrap 61%): gồm phân nhóm IA (51 mẫu) và phân nhóm IB (3 mẫu).
    • Nhóm II (22 mẫu phân lập, bootstrap 100%): gồm phân nhóm IIA (20 mẫu) và phân nhóm IIB (2 mẫu).
    • Kết quả chỉ ra sự phân nhóm di truyền theo chỉ thị SRAP tương quan chặt chẽ với vùng địa lý thu thập mẫu hơn là dòng vô tính ký chủ.

  • Nhận diện gen mã hóa độc tố Cas:

    • 40/76 mẫu phân lập (chiếm 52,6%) mang gen Cas2.
    • 36/76 mẫu phân lập còn lại (chiếm 47,4%) không phát hiện được gen mã hóa độc tố cassiicolin đã biết, được xếp vào nhóm Cas0.
    • Luận án không phát hiện sự hiện diện của các nhóm gen Cas1, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6 trong tập hợp 76 mẫu nấm thu thập tại Việt Nam.

3. Khảo sát tính gây bệnh

  • Khảo sát 76 mẫu phân lập trên lá cắt rời (RRIV 4 và PB 260): Cả 76 mẫu đều có khả năng lây nhiễm trên cả 2 dòng vô tính. Dòng RRIV 4 biểu hiện mức độ nhiễm bệnh nghiêm trọng hơn dòng PB 260: CSB trên RRIV 4 dao động từ 25,7% đến 100%; CSB trên PB 260 dao động từ 9,7% đến 76,7%.
  • Khảo sát 6 mẫu phân lập đại diện trên 12 dòng vô tính cao su: 6 mẫu gồm CoryLK02 (Đông Nam Bộ), CoryDP03 (Đông Nam Bộ), CoryDN39 (Đông Nam Bộ), CoryKT04 (Tây Nguyên), CoryBT17 (Duyên hải miền Trung), CorySL02 (Tây Bắc).
Dòng vô tính (DVT) CSB trung bình PTN (Lá cắt rời, 7 ngày) Mức gây bệnh PTN CSB trung bình Nhà lưới (Cây con, 10 ngày) Mức gây bệnh Nhà lưới
RRIV 4 94,6% Rất nặng 95,4% Rất nặng
RRIV 1 72,4% Nặng 33,7% Trung bình
RRIV 106 75,6% Nặng 32,6% Trung bình
RRIV 206 68,2% Nặng 18,5% Nhẹ
RRIV 114 64,1% Nặng 17,2% Nhẹ
PB 260 58,3% Nặng 15,4% Nhẹ
PB 255 56,7% Nặng 16,1% Nhẹ
RRIV 209 52,5% Nặng 19,2% Nhẹ
RRIV 109 44,8% Trung bình 11,3% Nhẹ
RRIV 124 38,5% Trung bình 9,8% Nhẹ
PB 312 35,2% Trung bình 8,7% Nhẹ
RRIV 230 31,7% Trung bình 6,4% Rất nhẹ / Nhẹ

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

  1. Phát hiện phân nhóm di truyền mới dựa trên vùng rDNA-ITS: Luận án xác định được 3 nhóm di truyền trên 76 mẫu nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Ngoài 2 nhóm mang nucleotide C và T tại vị trí 135 đã biết, luận án phát hiện thêm nhóm di truyền thứ 3 gồm 3 mẫu phân lập mang nucleotide Adenine (A) tại vị trí 474.
  2. Ứng dụng chỉ thị phân tử SRAP trong phân tích nấm C. cassiicola: Đây là công trình đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR-SRAP (với 30 cặp primer chuyên biệt khuếch đại vùng ORFs) để đánh giá đa dạng di truyền loài nấm C. cassiicola. Phương pháp đã chứng minh hiệu quả phân loại cao với tỷ lệ đa hình 93,3%, chia quần thể nấm thành 2 nhóm chính tương quan theo vùng địa lý thu thập.
  3. Làm rõ phân bố gen mã hóa độc tố cassiicolin (Cas) tại Việt Nam: Xác định được 40/76 mẫu phân lập mang gen Cas2 và 36/76 mẫu thuộc nhóm Cas0. Các nhóm gen Cas1, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6 không hiện diện trong tập hợp mẫu nghiên cứu.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

  1. Tuyển chọn nguồn mẫu nấm chuẩn phục vụ công tác chọn giống: Chọn lọc được 6 mẫu phân lập nấm (CoryLK02, CoryDP03, CoryDN39, CoryKT04, CoryBT17, CorySL02) đại diện cho các vùng sinh thái và phân nhóm di truyền khác nhau làm nguồn vật liệu chuẩn để lây nhiễm nhân tạo, đánh giá tính kháng bệnh của các dòng vô tính cao su mới.
  2. Đánh giá mức độ mẫn cảm bệnh của cơ cấu giống cao su sản xuất:
    • Khẳng định DVT RRIV 4 là giống rất mẫn cảm với bệnh rụng lá Corynespora ở cả điều kiện phòng thí nghiệm (CSB 94,6%) và nhà lưới (CSB 95,4%).
    • Các DVT RRIV 1 và RRIV 106 nhiễm bệnh ở mức trung bình trong điều kiện nhà lưới (CSB 32,6% – 33,7%).
    • Các DVT RRIV 109, RRIV 124, RRIV 206, RRIV 114, RRIV 209, RRIV 230, PB 255, PB 260, PB 312 biểu hiện tính chống chịu tốt hơn trong điều kiện nhà lưới (CSB 6,4% – 19,2%), cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc quy hoạch cơ cấu giống tại các vùng có nguy cơ dịch hại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu chỉ tập trung sàng lọc 6 nhóm gen mã hóa độc tố cassiicolin đã được công bố trên thế giới (Cas1 đến Cas6), do đó chưa xác định được bản chất di truyền quy định độc tính của 36 mẫu nấm thuộc nhóm Cas0 (nhóm vẫn có khả năng gây bệnh trên lá cao su nhưng không bắt cặp với 7 cặp primer gen Cas đã dùng).
  • Số lượng mẫu phân lập được khảo sát tính gây bệnh chi tiết trên 12 dòng vô tính cao su chỉ giới hạn ở 6 mẫu đại diện do điều kiện thực nghiệm nhà lưới và phòng thí nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Giải trình tự toàn bộ hệ gen (whole-genome sequencing) hoặc giải trình tự hệ transcriptome của các mẫu phân lập nấm thuộc nhóm Cas0 nhằm phát hiện các biến thể gen mã hóa độc tố mới hoặc các yếu tố độc lực khác ngoài cassiicolin.
  • Mở rộng khảo sát độc lực của các phân nhóm nấm trên tập đoàn dòng vô tính cao su triển vọng trong chương trình chọn tạo giống quốc gia.
  • Nghiên cứu dịch tễ học phân tử chuyên sâu để theo dõi sự di chuyển và biến động tần số xuất hiện của gen Cas2 tại các vùng trồng cao su trọng điểm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Di truyền - Chọn giống cây trồng: Tham khảo quy trình tách chiết DNA nấm sợi, thiết kế và tối ưu hóa phản ứng PCR-SRAP nhân bản vùng ORFs, phân tích phát sinh loài bằng UPGMA và Neighbor-Joining, quy trình lây bệnh nhân tạo trên lá cắt rời và trên cây con nhà lưới.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu bệnh học thực vật: Cung cấp tài liệu giảng dạy về cơ chế tương tác ký sinh – ký chủ, vai trò của độc tố thực vật chuyên biệt và sự đa dạng nòi sinh lý của nấm gây bệnh cây công nghiệp nhiệt đới.
  • Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp và nhà quản lý kỹ thuật ngành cao su: Dữ liệu phản ứng kháng/nhiễm của 12 dòng vô tính cao su đối với các phân nhóm nấm C. cassiicola là căn cứ thực tế để xây dựng cơ cấu giống an toàn dịch bệnh và định hướng biện pháp quản lý tổng hợp bệnh rụng lá Corynespora tại từng vùng địa lý.

Câu hỏi thường gặp

1. Chỉ thị phân tử SRAP đã phân chia 76 mẫu phân lập nấm C. cassiicola thành bao nhiêu nhóm và dựa trên các chỉ số thống kê nào?

Chỉ thị phân tử SRAP với 30 cặp mồi đã khuếch đại 223 băng DNA (tỷ lệ đa hình 93,3%). Phân tích UPGMA dựa trên hệ số khoảng cách di truyền Nei và Li đã phân chia 76 mẫu nấm thành 2 nhóm chính:

  • Nhóm 1 gồm 54 mẫu (phân nhóm 1A có 51 mẫu, phân nhóm 1B có 3 mẫu) với giá trị Bootstrap 61%.
  • Nhóm 2 gồm 22 mẫu (phân nhóm 2A có 20 mẫu, phân nhóm 2B có 2 mẫu) với giá trị Bootstrap 100%. Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 nhóm chính là 67%. Sự phân nhóm này tương quan theo vùng địa lý thu thập hơn là dòng vô tính ký chủ.

2. Trình tự vùng rDNA-ITS của 76 mẫu nấm nghiên cứu có đặc điểm gì nổi bật?

Tất cả 76 mẫu nấm đều cho sản phẩm khuếch đại rDNA-ITS dài 559 bp. Trình tự các mẫu hoàn toàn tương đồng ngoại trừ 2 vị trí đa hình nucleotide đơn (SNPs): vị trí 135 (vùng ITS1) và vị trí 474 (vùng ITS2). Dựa vào 2 vị trí này, quần thể nấm được chia thành 3 nhóm di truyền:

  • Nhóm 1 (38 mẫu): mang nucleotide Cytosine (C) tại vị trí 135.
  • Nhóm 2 (35 mẫu): mang nucleotide Thymine (T) tại vị trí 135.
  • Nhóm 3 (3 mẫu): mang nucleotide Adenine (A) tại vị trí 474.

3. Tỷ lệ hiện diện của gen mã hóa độc tố cassiicolin (Cas) trong 76 mẫu nấm tại Việt Nam được ghi nhận như thế nào?

Khi sử dụng 7 cặp mồi PCR chuyên biệt để khuếch đại các dạng gen Cas:

  • Có 40/76 mẫu phân lập (chiếm 52,6%) mang gen mã hóa protein đồng dạng Cas2.
  • 36/76 mẫu phân lập còn lại (chiếm 47,4%) không phát hiện được gen mã hóa độc tố Cas, được xếp vào nhóm Cas0.
  • Không phát hiện các nhóm gen Cas1, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6 trong các mẫu nấm khảo sát.

4. Dòng vô tính cao su nào mẫn cảm nhất và dòng nào chống chịu tốt nhất với 6 mẫu nấm đại diện trong điều kiện thực nghiệm?

  • Mẫn cảm nhất: Dòng vô tính RRIV 4 biểu hiện mức độ nhiễm bệnh rất nặng ở cả 2 điều kiện: chỉ số bệnh trung bình trong phòng thí nghiệm là 94,6% và trong nhà lưới là 95,4%.
  • Chống chịu tốt nhất: Dòng vô tính RRIV 230 biểu hiện chỉ số bệnh thấp nhất trong phòng thí nghiệm (31,7%) và trong nhà lưới (6,4%), thuộc nhóm gây bệnh nhẹ/rất nhẹ. Các dòng RRIV 109, RRIV 124, PB 312 cũng thể hiện mức độ nhiễm bệnh nhẹ trong điều kiện nhà lưới (CSB từ 8,7% đến 11,3%).

Kết luận

Luận án đã phân tích toàn diện 76 mẫu phân lập nấm Corynespora cassiicola thu thập từ 16 dòng vô tính cao su trên nhiều vùng sinh thái tại Việt Nam giai đoạn 2016–2019. Kết quả nghiên cứu đã làm sáng tỏ sự đa dạng hình thái, xác định 3 phân nhóm di truyền theo vùng rDNA-ITS (phát hiện mới đột biến tại vị trí 474), chứng minh hiệu quả phân nhóm địa lý của chỉ thị SRAP (223 băng DNA, đa hình 93,3%), và xác định tỷ lệ phân bố của gen mã hóa độc tố Cas2 (52,6%) cùng nhóm Cas0 (47,4%). Nghiên cứu độc lực trên 12 dòng vô tính cao su khẳng định tính mẫn cảm cao của dòng RRIV 4 và mức độ chống chịu tốt hơn của các dòng như RRIV 230, PB 312, RRIV 124, cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu chuẩn phục vụ công tác chọn tạo giống và khuyến cáo cơ cấu giống cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora tại Việt Nam.