Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc họ Cà (Solanaceae) là một trong những loại cây gia vị có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, cung cấp nhiều vitamin A, vitamin C, folate, rutin và hoạt chất capsaicin. Trong canh tác thương phẩm, bệnh thán thư do các loài nấm thuộc chi Colletotrichum gây ra là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm nhất ở cả giai đoạn trước và sau thu hoạch, làm suy giảm nghiêm trọng sản lượng từ 50% đến 80% (Poonpolgul et al., 2007). Bên cạnh đó, bệnh còn làm giảm khối lượng chất khô, giảm phẩm chất quả cũng như hàm lượng capsaicin và oleoresin (Mistry et al., 2010).

Việc phòng trừ bệnh thán thư gặp nhiều trở ngại do chi Colletotrichum có tính đa ký chủ phức tạp và độ mẫn cảm khác nhau giữa các loài đối với thuốc bảo vệ thực vật hóa học (Mongkolporn et al., 2010). Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào đặc điểm hình thái và phạm vi ký chủ bộc lộ nhiều hạn chế, dẫn đến sự nhầm lẫn lớn trong phân loại học (Hyde et al.; Crouch et al.). Do đó, đề tài "Phân lập và định danh nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt tại tỉnh Tiền Giang" được thực hiện nhằm định danh chính xác tác nhân gây bệnh ở cấp độ loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp hình thái học, tạo tiền đề khoa học cho công tác kiểm soát dịch hại hiệu quả tại địa phương.

Mục tiêu và các yêu cầu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

  1. Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập, định danh và tuyển chọn được giống nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt; phát hiện những dòng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh tại các vùng dịch hại thuộc các huyện trên địa bàn tỉnh Tiền Giang.
  2. Yêu cầu nghiên cứu:
    • Thu thập và phân lập nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư từ các mẫu quả ớt nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng.
    • Định danh đặc điểm hình thái của các chủng nấm Colletotrichum spp. đã thu thập và phân lập.
    • Định danh cấp độ loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên trình tự 3 vùng gen: ITS, TUB2 và ApMat.
    • Đánh giá khả năng gây bệnh của các dòng nấm Colletotrichum spp. đối với giống ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
  3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
    • Đối tượng nghiên cứu: 30 mẫu bệnh thán thư thu thập trên 2 giống ớt gồm ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens) và ớt sừng vàng Châu Phi (Capsicum annuum).
    • Phạm vi không gian: Mẫu bệnh được thu thập tại 4 vườn thuộc 3 địa bàn vùng chuyên canh ớt của tỉnh Tiền Giang gồm huyện Gò Công Đông (xã Tân Thành, xã Tăng Hòa), huyện Chợ Gạo (xã Tân Thuận Bình) và thị xã Cai Lậy (xã Mỹ Phước Tây). Các thí nghiệm phân lập, sinh học phân tử và lây nhiễm nhân tạo được tiến hành tại phòng thí nghiệm RIBE 302 - 304 (Bệnh học và Chẩn đoán) và nhà màng thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
    • Phạm vi thời gian: Khóa luận được thực hiện từ tháng 8 năm 2023 đến tháng 2 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý luận về phân loại học nấm bệnh thực vật, sử dụng kết hợp giữa khóa định danh hình thái kinh điển và phân tích trình tự DNA đa gen. Tác giả vận dụng khóa phân loại của Sutton (1995) để đánh giá cấu trúc tản nấm, hình thái và kích thước bào tử phân sinh, giác bám. Để khắc phục hiện tượng trùng lặp hoặc biến thiên hình thái, nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử gồm vùng đệm phiên mã nội phần (Internal Transcribed Spacer - ITS) cùng hai gen chức năng là gen $\beta$-tubulin (TUB2) và vùng liên gen ApMat (Silva et al., 2012). Việc đánh giá mức độ hại và phân cấp chỉ số bệnh tuân thủ quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-160:2014/BNNPTNT.

Hạng mục phương pháp Quy trình và thông số kỹ thuật áp dụng
Phân lập và làm thuần Phương pháp mô bệnh kết hợp cấy đơn bào tử (Cai et al., 2009; Than et al., 2008). Khử trùng bề mặt bằng cồn 70%, cắt mẫu $2 \times 2\text{ mm}$ ở ranh giới mô khỏe - bệnh, nuôi cấy trên môi trường thạch nước cất (WA) và thạch khoai tây Dextrose (PDA) ở 25°C.
Định danh hình thái Cấy mẫu tản nấm đường kính 5 mm lên PDA ở 27°C, ủ tối 7 ngày; quan sát hệ sợi, bào tử và nuôi cấy vi thể mảnh PDA $1\text{ cm}^2$ kẹp lamen ở 25°C trong 7 ngày để thu nhận giác bám (Cai et al., 2009; Sutton, 1995).
Tách chiết DNA tổng số Phương pháp Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol (PCI). Nghiền $0{,}1 - 0{,}5\text{ g}$ sợi nấm với Lysis buffer, ủ 65°C trong 1 giờ, chiết tách bằng PCI và Chloroform, kết tủa bằng Isopropanol, rửa cồn 70% và hòa tan trong đệm TE.
Khuếch đại gen (PCR) Khuếch đại 3 đoạn gen bằng DreamTaq Green 2X PCR Master Mix (thể tích $25\ \mu\text{L}$):
- Vùng ITS: Cặp mồi ITS4/ITS5 ($T_a = 56^\circ\text{C}$, 35 chu kỳ).
- Vùng TUB2: Cặp mồi Bt2a/Bt2b ($T_a = 56^\circ\text{C}$, 35 chu kỳ).
- Vùng ApMat: Cặp mồi AM-F/AM-R ($T_a = 54^\circ\text{C}$, 35 chu kỳ).
Phân tích phát sinh loài Giải trình tự DNA, so khớp bằng công cụ BLAST trên NCBI GenBank; xây dựng cây phát sinh loài trên phần mềm MEGA 11 theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình Tamura-Nei, bootstrap 1000 lần lặp lại).
Thử nghiệm tính gây bệnh Thí nghiệm đơn yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 5 nghiệm thức (4 nhóm nấm + đối chứng nước cất), 6 quả/nghiệm thức, 3 lần lặp lại. Nhỏ $20\ \mu\text{L}$ huyền phù $10^8\text{ bào tử/mL}$ lên quả ớt chỉ thiên (xử lý có/không gây vết thương cơ giới), ủ ẩm 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến cây ớt và chi nấm Colletotrichum:

  • Tổng quan về cây ớt: Cung cấp thông tin nguồn gốc phân loại học (269 loài thuộc chi Capsicum), đặc điểm hình thái học thực vật (hệ rễ cọc kết hợp rễ chùm tầng $0 - 30\text{ cm}$, thân phân cành cấp 1-3, hoa lưỡng tính có tỷ lệ thụ phấn chéo $10 - 40%$), yêu cầu sinh thái (nhiệt độ tối thích $20 - 30^\circ\text{C}$, độ ẩm $70 - 80%$, độ dài chiếu sáng $9 - 10\text{ giờ/ngày}$ làm tăng năng suất $21 - 24%$) và giá trị dược liệu của capsaicin, rutin.
  • Tổng quan về nấm Colletotrichum spp.: Hệ thống hóa đặc điểm sinh học và chu trình phát sinh bệnh hại; cơ chế xâm nhiễm qua giác bám và hai phương thức ký sinh (bán ký sinh nội bào hoặc hoại sinh dưới lớp cutin); khả năng tồn tại qua đông dưới dạng sợi nấm, hạch nấm hoặc hậu bào tử (chlamydospores) trong đất và tàn dư thực vật.
  • Các loài Colletotrichum chính gây hại trên ớt: Tổng hợp đặc điểm của C. gloeosporioides (gây hại chủ yếu trên quả xanh và quả chín), C. acutatum (sức tàn phá mạnh trên mọi giai đoạn quả) và C. truncatum / C. capsici (bào tử hình lưỡi liềm).
  • Chỉ thị DNA và vùng gen ITS: Phân tích ưu thế của mã vạch DNA và nguyên nhân vùng gen ITS đơn lẻ có thể dẫn đến tỷ lệ định danh sai lên tới 86% đối với các loài nấm có bào tử hình liềm (Crouch et al.), qua đó nhấn mạnh tính tất yếu của việc giải trình tự đa gen kết hợp ITS, TUB2 và ApMat.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai:

  • Trình bày thông tin thu thập 30 mẫu bệnh tại 4 địa điểm thuộc tỉnh Tiền Giang: xã Tân Thành (9 mẫu: TT1.1 - TT3.3), xã Tăng Hòa (9 mẫu: TH1.1 - TH3.3), xã Tân Thuận Bình (9 mẫu: TTB1.1 - TTB3.3) và xã Mỹ Phước Tây (9 mẫu: MPT1.1 - MPT3.3).
  • Chi tiết hóa công thức môi trường WA, PDA, quy trình cấy đơn bào tử từ đỉnh nảy mầm sau 18 giờ nuôi cấy.
  • Trình bày cụ thể quy trình tách chiết DNA bằng dung dịch PCI, bảng thành phần phản ứng PCR $25\ \mu\text{L}$, trình tự các đoạn mồi (ITS4/ITS5, Bt2a/Bt2b, AM-F/AM-R) và thông số các chu trình nhiệt biến tính, bắt cặp, kéo dài.
  • Mô tả phương pháp bố trí thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên quả ớt chỉ thiên (giống Hai mũi tên đỏ) và công thức tính toán tỷ lệ bệnh (TLB %), chỉ số bệnh (CSB %) theo thang phân cấp từ cấp 1 (<5%) đến cấp 9 (>50% diện tích bị bệnh) dựa trên tiêu chuẩn QCVN 01-160:2014/BNNPTNT.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và thảo luận các số liệu thực nghiệm thu được:

  • Kết quả phân lập và phân nhóm hình thái: Thu nhận thành công 30 mẫu nấm thuần khiết (22 mẫu từ ớt chỉ thiên, 8 mẫu từ ớt sừng vàng). Dựa trên đặc điểm tản nấm, bào tử và giác bám sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA, 30 mẫu được chia thành 4 nhóm hình thái rõ rệt:
Nhóm hình thái Số lượng mẫu Đặc điểm tản nấm và hệ sợi Kích thước bào tử ($\mu\text{m}$) và hình thái Kích thước giác bám ($\mu\text{m}$) và hình thái Phức hợp loài quy chiếu
Nhóm I 12 Sợi trắng mọc sát mặt thạch; tản trắng đến cam hồng; mặt dưới hồng cam đến cam đậm; có chấm đen nhỏ. $9{,}13 - 14{,}33 \times 2{,}17 - 5{,}00$; hình trụ 2 đầu tròn hoặc 1 đầu nhọn, hoặc hình thoi. $7{,}33 - 13{,}33 \times 2{,}77 - 5{,}33$; hình elip đến hình trứng ngược, có/không phân thùy. Phức hợp Colletotrichum acutatum
Nhóm II 10 Sợi trắng chuyển nâu đến cam hồng, mọc sát thạch; mặt dưới xanh đen đến hồng cam đậm. $7{,}75 - 14{,}08 \times 3{,}42 - 6{,}75$; hình trụ hoặc hình thoi nhọn 2 đầu. $7{,}00 - 12{,}67 \times 4{,}08 - 7{,}75$; hình elip đến hình trứng ngược. Phức hợp Colletotrichum acutatum
Nhóm III 6 Sợi mảnh màu trắng xám đến đen mọc bung cao; tản xám đen có vòng đồng tâm; mặt dưới nâu đen đến đen. $5{,}50 - 14{,}38 \times 3{,}63 - 6{,}63$; hình trụ ngắn, 2 đầu hơi tròn hoặc 1 đầu hơi nhọn. $6{,}25 - 12{,}38 \times 6{,}00 - 7{,}88$; hình trứng ngược hoặc hình chùy, vách mỏng. Phức hợp Colletotrichum gloeosporioides
Nhóm IV 2 Sợi trắng mọc sát/hơi bung; tản trắng có vòng đồng tâm, xuất hiện hạch nấm đen và giọt dầu cam; mặt dưới cam đậm. $16{,}0 \pm 1{,}6 \times 4{,}8 \pm 0{,}4$; hình trụ hoặc hình hạt gạo thon dài. $10{,}3 \pm 1{,}4 \times 6{,}7 \pm 1{,}3$; hình trứng, gần tròn hoặc hình chùy, không phân thùy. Phức hợp Colletotrichum gloeosporioides
  • Kết quả điện di PCR và giải trình tự phân tử:
    • Điện di sản phẩm PCR cho thấy kích thước đoạn khuếch đại của 3 vùng gen đạt chuẩn: vùng ITS đạt kích thước khoảng $590\text{ bp}$, gen $\beta$-tubulin (TUB2) đạt khoảng $550\text{ bp}$ và vùng gen ApMat đạt khoảng $910\text{ bp}$.
    • Giải trình tự đoạn gen ITS trên 4 chủng đại diện và so sánh BLAST trên GenBank cho kết quả:
      • Chủng TH3.1 nằm cùng nhánh với Colletotrichum gloeosporioides isolate F26 (MK816458.1) với độ tương đồng $92{,}13%$ (bootstrap 92%).
      • Chủng TTB2.1 nằm cùng nhánh với Colletotrichum gloeosporioides strain LCM 878.01 với độ tương đồng $99{,}83%$ (bootstrap 94%).
      • Chủng TT3.3 nằm cùng nhánh với Colletotrichum scovillei TG633 (LC488878.1) với độ tương đồng $99{,}15%$ (bootstrap 91%).
      • Chủng MPT2.2 nằm cùng nhánh với Colletotrichum scovillei isolate PHPG12 (KY799004.1) với độ tương đồng $98{,}89%$ (bootstrap 91%).
  • Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh: Sau 6 ngày lây nhiễm nhân tạo trên quả ớt chỉ thiên, cả 4 nhóm nấm đều thể hiện triệu chứng bệnh thán thư điển hình (vết đốm trũng lõm hoại tử, hình thành các ổ đĩa cành dạng vòng đồng tâm). Tỷ lệ bệnh dao động từ $31{,}49%$ đến $77{,}24%$ và chỉ số bệnh dao động từ $19{,}92%$ đến $32{,}56%$. Kết quả này khẳng định có sự sai khác rõ rệt về độc tính và mức độ mẫn cảm giữa các chủng nấm thuộc các nhóm phân lập khác nhau.

Kết quả và đóng góp

  • Kết quả khoa học cụ thể:
    • Thu thập và phân lập thuần khiết được 30 chủng nấm Colletotrichum spp. từ các vùng trồng ớt trọng điểm tại Tiền Giang.
    • Phân loại hình thái thành 4 nhóm rõ rệt, trong đó 22 mẫu thuộc phức hợp loài C. acutatum (Nhóm I và Nhóm II) và 8 mẫu thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides (Nhóm III và Nhóm IV).
    • Tối ưu hóa phản ứng PCR khuếch đại thành công 3 đoạn gen mã vạch với kích thước chuẩn: ITS ($590\text{ bp}$), TUB2 ($550\text{ bp}$) và ApMat ($910\text{ bp}$).
    • Định danh chính xác cấp độ loài cho các chủng đại diện: xác định loài Colletotrichum scovillei (độ tương đồng $>98%$) và các loài thuộc phức hợp Colletotrichum gloeosporioides (độ tương đồng từ $92{,}13%$ đến $99{,}83%$) là tác nhân chính gây bệnh thán thư trên ớt tại Tiền Giang.
    • Định lượng độc tính gây bệnh của các nhóm nấm trên giống ớt chỉ thiên với tỷ lệ bệnh đạt $31{,}49% - 77{,}24%$ và chỉ số bệnh đạt $19{,}92% - 32{,}56%$.
  • Đóng góp học thuật và thực tiễn: Khóa luận đã cung cấp dẫn liệu phân loại học phân tử cập nhật về thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại tỉnh Tiền Giang, giải quyết tình trạng nhầm lẫn khi chỉ dựa vào quan sát hình thái học đơn thuần. Dữ liệu này là cơ sở phục vụ công tác lai tạo giống ớt kháng bệnh và xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) thích ứng cho từng nhóm loài.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu mới chỉ tiến hành giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài dựa trên chỉ thị đơn vùng gen ITS cho 4 chủng đại diện, chưa hoàn thiện giải trình tự kết hợp đồng thời cả hai vùng gen TUB2 và ApMat để phân tích phát sinh loài đa gen (multilocus phylogenetic analysis).
    • Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo mới thực hiện trên một giống ớt chỉ thiên trong điều kiện phòng thí nghiệm, chưa đánh giá phản ứng gây bệnh mở rộng trên nhiều bộ giống thương phẩm khác ngoài đồng ruộng.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Hoàn thiện giải trình tự chuỗi gen TUB2 và ApMat cho toàn bộ các chủng còn lại nhằm lập bản đồ đa gen chi tiết.
    • Mở rộng phạm vi điều tra thu thập mẫu tại các vùng sinh thái trồng ớt khác ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
    • Đánh giá tính kháng bệnh của các giống ớt địa phương và thử nghiệm hiệu lực của các hoạt chất sinh học, hóa học đối với từng loài nấm đã được định danh.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp và Bệnh học Thực vật. Những nội dung có giá trị tham khảo cao bao gồm:

  • Quy trình tách chiết DNA sợi nấm bằng dung dịch PCI và điều kiện luân nhiệt phản ứng PCR cho 3 cặp mồi chuyên biệt ITS4/ITS5, Bt2a/Bt2b, AM-F/AM-R.
  • Khóa phân loại hình thái đối chiếu giữa hệ sợi, bào tử và giác bám dựa trên hệ thống phân loại của Sutton (1995).
  • Phương pháp cấy đơn bào tử làm thuần và kỹ thuật bố trí lây nhiễm nhân tạo đánh giá độc tính nấm bệnh theo thang đo chuẩn QCVN 01-160:2014/BNNPTNT.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã phân lập được bao nhiêu mẫu nấm và thu thập trên những giống ớt nào tại Tiền Giang?
Nghiên cứu đã thu thập và phân lập thuần khiết được 30 mẫu nấm Colletotrichum spp. từ 4 vườn ớt thuộc 3 địa phương (huyện Gò Công Đông, huyện Chợ Gạo và thị xã Cai Lậy), bao gồm 22 mẫu ký sinh trên giống ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens) và 8 mẫu trên giống ớt sừng vàng Châu Phi (Capsicum annuum).

2. Ba mươi mẫu nấm thu thập được chia thành mấy nhóm hình thái và thuộc những phức hợp loài nào?
Dựa vào màu sắc tản nấm, hình thái bào tử phân sinh và giác bám theo khóa phân loại của Sutton (1995), 30 mẫu được chia làm 4 nhóm: Nhóm I (12 mẫu) và Nhóm II (10 mẫu) thuộc phức hợp loài Colletotrichum acutatum; Nhóm III (6 mẫu) và Nhóm IV (2 mẫu) thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides.

3. Kích thước các sản phẩm PCR khi khuếch đại 3 vùng gen định danh phân tử là bao nhiêu?
Sản phẩm điện di phản ứng PCR ghi nhận kích thước đoạn khuếch đại của 3 vùng gen lần lượt là: vùng gen ITS có kích thước khoảng $590\text{ bp}$, vùng gen $\beta$-tubulin (TUB2) có kích thước khoảng $550\text{ bp}$, và vùng gen ApMat có kích thước khoảng $910\text{ bp}$.

4. Kết quả giải trình tự vùng gen ITS đã định danh được các mẫu đại diện thuộc những loài cụ thể nào?
Kết quả đối soát trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank cho thấy: chủng TH3.1 tương đồng $92{,}13%$ với C. gloeosporioides isolate F26; chủng TTB2.1 tương đồng $99{,}83%$ với C. gloeosporioides strain LCM 878.01; chủng TT3.3 tương đồng $99{,}15%$ với C. scovillei TG633; và chủng MPT2.2 tương đồng $98{,}89%$ với C. scovillei isolate PHPG12.

5. Khả năng gây bệnh của các nhóm nấm trên quả ớt chỉ thiên được ghi nhận với mức độ như thế nào?
Sau 6 ngày lây nhiễm nhân tạo với mật độ huyền phù $10^8\text{ bào tử/mL}$, tất cả 4 nhóm nấm đều có khả năng gây bệnh thán thư điển hình trên quả ớt chỉ thiên giống Hai mũi tên đỏ; tỷ lệ bệnh giữa các nghiệm thức dao động từ $31{,}49%$ đến $77{,}24%$ và chỉ số bệnh dao động từ $19{,}92%$ đến $32{,}56%$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trương Công Minh đã hoàn thành việc thu thập 30 mẫu bệnh thán thư trên ớt tại tỉnh Tiền Giang, phân loại hình thái thành 4 nhóm và làm rõ kích thước các phân đoạn gen định danh phân tử ITS, TUB2 và ApMat. Phân tích trình tự đoạn gen ITS đã xác định sự hiện diện của loài Colletotrichum scovillei cùng các dòng thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên hai giống ớt địa phương. Kết quả thử nghiệm độc tính khẳng định khả năng gây bệnh mạnh mẽ của các chủng phân lập với tỷ lệ bệnh lên đến $77{,}24%$, cung cấp luận cứ khoa học tin cậy phục vụ nghiên cứu dịch tễ học và định hướng quản lý nấm bệnh trong sản xuất nông nghiệp.