Đặt vấn đề. - - + s1 2121121121111 211211112121111212211212111 2122112122111 re 1 IMG TOUS BET GỮ caeeenaenoessessisggeiEbEESESSRGGESSSGGSHGSSESSG09599998SE2NNĐ7S313.08120551000 0085 2 Ct ThusestsstsvienrtssntsntgginsBtiepioElsispiGiygizplisifsntoigttpgftorgrsifiptiiissrtetgiggdtsgglotstssrjositrsitiEib 2 Giới hạn đề tài. 3 WaT Bei in mg Wane VỗÏlbeeeesoeednetenrinebecitttongs36i2499010400000564001080008/0)0060646101E. xi 4 [1X EẾc tinh errr oreo 5 1.5 Gia tri dinh dưởng và công dụng CUA Ớt.2 Téng quan vé nam 22//272/7:7/77,.1 Phần loại khoa HQGi sceacte csai ecgib ii sicg ho pecs saw sensqinus cose ceimusameus tomas sy pavenste tverenis pamneran wavered 6 1.2 Phân bố ký CHU o.cccccccscccsessessessessessessessecsessessessessessessessesseesessessessessessessessesseeseeeeess 6 155 ịk ck .hhthHhHgHh hghogigH0NG108-G)ảgEdĐigiinEudboddEggiiochinmdidaoEmuổ 7 1:24 Dac tinh sink hoe-wal Stal Hi ssscsssssssenseseiotendsicudstitoynkidEsigil9NSEISBUGGHSSIGB/GU20E4Ei8ti38EngiG00000ni585 7 12.1 Dae tinhisinh HỢC sssesssacceceeencassaeensdeneexaastezeeuaseaeeaesinevaxseiaaeen as 34582385338 mada 4883535408558 Ỷ 1.
Dae ttn SINH KHẢ ¡s68 axoxaexe gi ng ng gS68011616441361554843516493ã33843554882838358348XAS8858388435.5 Nghiên cứu về các loài nam Colletotrichum spp. gây bệnh than thu trên ot .1 Nghiên cứu về nam Colletotrichum gloeosporioides.2 Nghiên cứu về nắm Colletotrichum đCHE@fMI.3 Nghiên cứu về nam Colletotrichum IFMWHCAfHH.6 Dac dim gay Wai 0 iâ445.trình phat sinh bệnh.8 Giới thiệu về chỉ thi DNA và vùng gen ITS.1 Tổng quan về chỉ thị DNA. 2-22 ©2222222E22E22EE22E22EE2232221273222222122222xe.2 Vùng trong được sao mã (Internal Transcribed đệm Spacer - [TS).9 Các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại.10 lễ oe aen 20 MT TIEIT VÀ PHƯƠNG PAP INGEN (0 saisssnscaxsinsowsnncansasccunanaarensacasaansnice 20 2.1 Nội dung nghiên cứu đề tài.3 Đối tượng Va, Vat liệu HOMISH CU sassstisesisisssatiiSigttiglg19SSESSSSSGSAESGEEEISGSSESIHDEGSSHESSSIS08g8 20 2.1 Đối tượng nghiên COU. cece cee ccseseeesecsecseessesessesesstsnesssessessessessessnsseseesseeseeees 20 22,352, Vat LOU AEMICH CU secre.
scarsancnenyenes series semaine seasuunecsa anennemcarueenaresvonsemmensruaness 20 2.4 Phuong phap nghién 00000022.1 Phương Pháp thu thập mau bệnh than thư trên ớt.2 Phương pháp phân lập va làm thuần nam Colletotrichum spp. từ mau bénh.1 Phương pháp chuẩn bị một số môi trường cho quá trình phân lập .2 Phương pháp phân lập và làm thuần nắm Colletotrichum Spp.3 Định danh hình thái các chủng nam Colletotrichum spp. gây bệnh than thư trên ớt E8SXSBSHGHSS605650808SE04S3HSSUSSEEHESSHĐEGBSHEEHSSEESSETGLERBSGESEEEI20/G16GG008GTESESE-GRAHGGGHHIDEHSUSESERUSGESIGOEIGEESIXSHS.4 Định danh phân tử các chủng nắm Colletotrichum spp. gây bệnh than thư trên ớt 4385D2253882H00I0550IGR#95SOSHHEEDEHSOEIGSIĐGGB-GNEHGISLSEUNGENEHGEGHSEEESRIIRURIGBSUIRBIGGGERGSIHCIIGSGRGRSPERSESGBE0-ir3ANReet 23 2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ nắm .2 Phản ứng PCR với cặp môi ITS (ITS4, ITS5 ),TUB2 (Bt2a và Bt2b), ApMat 24 2AALA Phần tích phat sinh ÏgãÏ-<‹s¿ee-eesseesbsieseskiiiBA6-LSS08530130nnggH2tE0inEGHEN ĐHSESHE48004503060300g8e 26 2.5 Đánh giá khả năng lây bệnh của các dòng nắm Colletotrichum spp.- 26 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm .---- 2-2 ©22©2222S22E£2EE£EEE2EE£EEEEEE2EE22EE22E22EE222 22.
26 Tiến hành thí nghiệm.- -- 2-2222 +S2SE£SE22E22E£2E22121121121121121121121121121121121221 21 xe 26 Chỉ tiểu theo đổi segseanansssisiibeiSSGSSBSSSSSSSNSSESSEAIG.DSTRMSSEI2S858958 380290 27 CUO 3 cá0cs2xsgnoitis19316101 G8607 6580330468384556830GGG0ESVIAGIESHRSGEGHGAIG4G110U8005GS78SEHSGGH64G38955:044866ã8820088 29 KET QUA VÀ THẢO LUẬN.1 Thu thập, phân lập nam colletotrichum spp.2 Định danh Colletotrichum sp. bằng đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử.1 Định danh nam Colletotrichum sp. bằng đặc điểm hình thái.2 Định danh nam Colletotrichum sp. bằng kĩ thuật phân tử.---------- 36 Vv DI RUN Luổ: TH | heea 37 Đối với cặp mồi -tubulin và ApMat .3 Đánh giá kha năng gây bệnh của nấm Colletotrichum Spp.-------------5--- 42 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ,.-2- 222 +S2EE2E2EE2121121212112121211211111111 112111 xe.
47 a 52 vi DANH SÁCH CHU VIET TAT Cs : Cộng sự Ctv :Cộng tác viên DNA :Deoxyribonucleic acid ITS ‘Internal Transcribed spacer EL : Lan lặp lại NCBI :National Center for Biotechnology Information NSC : Ngày sau cay PCI : Phenol Chloroform Isoamyl PCR : Polymerase Chain Reaction PDA : Potato Dextro Agar rDNA : Ribosome deoxyribonucleic acid WA :Water Agar vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 bản đồ phân bố của nắm colletotrichum spp.trên thới gới.2 hình thái của các chủng nam colletotrichum khi được cây trên dia petri quan BẵI tưới eth Te VŨ nguuagggtgt nghgiog cet te es mre 7 Hình 1. Triệu chứng đặc trưng của bệnh than thư gây hai ớt cây trên đồng rudng.Vòng đời của Colletotrichum SpỤ.1 Phân cấp chỉ số bệnh thán thư trên ớt (Theo QCVN 01-160:2014/BNNPTNT) ee 28 Hình 3. Triệu chứng bệnh than thư trên Ot .-- - ---- -- 5 --++++2*£++eE++eeezeeezeeeses 29 Hình 3.2 Phân lập Sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.3 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm I.4 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm ÏI.5 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm III.6 Đặc điểm hình thái của các mẫu nắm nhóm I'V.7: (A) Kết qua điện di tong số, (B) Kết quả điện di DNA bằng cặp mỗi ITS đối với bon mẫu nam Colletotrichum spp. ( M: Ladder 1 Kb, (-): Đối chứng ,1: TH3.1, we Se eee NIP TT re 37 Hình 3.8: (A) Kết quả điện di DNA bang cặp mồi B-tubulin, (B) Kết qua điện di DNA bằng cặp moi ApMat đối với các mẫu nắm Colletotrichum spp.
( M: Ladder 1 Kb, (-): Đối chứng ,1: TH3.10 Cây phat sinh loài dựa trên môi ITS của bốn mẫu nắm TH3.2 phân lập với một số mẫu trên ngân hang Gen. Các giá tri bootstrap sau 1000 lần lặp lại là thé hiện dưới dạng phan trăm .-- 2-2 22222222E++2E2Ezz2xzzzzzzxzex 39 Hình 3.11 Kết quả giải trình tự gene mẫu TH3.1 được so sánh với các chủng trên cơ sở dữ Genbank bằng công cụ Blast.12 Kết quả giải trình tự gene mẫu TTB2.1 được so sánh với các chủng trên cơ sở dit Genbank bằng công cu Blast.13 Kết quả giải trình tự gene mẫu TT3.3 được so sánh với các chủng trên cơ sở at Genbarilt bằng cũng cụ HE se coseesoeksiesdobitiGu200GllnyEHGA00384660060000450053/40010/03g0/08 006 40 Hình 3.14 Kết quả giải trình tự gene mẫu MPT2.2 được so sánh với các chủng trên cơ sở dit Genbank bằng công cụ Blast.3 Đánh giá khả năng gây bệnh của nắm Colletotrichum Spp.13 Triệu chứng bệnh do nam Colletotrichum spp. sau 6 ngày trên quả ớt chỉ thiểm ELA TO TÊH/HÔoesrceoasnotetiitiatottS3guiBUGGESAGEGIENHGBUGEESGRDGSESSGTONHGHGEVGSIGDEGNURDRiGidSgSaaRtosogeoidi 44 DANH SÁCH CÁC BANG Bảng 2.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt ở tỉnh Tiền HTDi c0 166 10E))E2SPSCEEEUCBCEEEIDIEEEEGSSEBIEEIESHO-BSESSG/PHEEHGCESDSESESERPGGG-G/210IEGGI2IEEGi22/720E30003123000 10C 22 Bang 2. Thanh phần phản ứng PCR với priimer.
Danh sách các đoạn primer va trình tự. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer ITS1/ ITS4, Bt2a/Bt2b. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với primer AM-EF/AM-R. Loài Colletotrichum spp.
phan lập từ ớt (Capsicum spp.) ở tinh Tiền Giang GIỚI THIỆU Đặt vần đề Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) là một trong những cây gia vị có giá trị dinh dưỡng cao chứa nhiều vitamin, capsaicin. được sử dụng phổ biến. Bệnh than thư do nam Colletotrichum spp. gây ra là một trong những bệnh gây hại nặng nhất trong giai đoạn trước và sau thu hoạch ở những vùng trồng ớt trên toàn thế giới (Isaac, 1992).
Năng suất ớt có thé làm giảm đến 50 - 80% khi ớt nhiễm bệnh than thu (Poonpolgul et al, 2007). Ngoài ra bệnh còn làm giảm chất lượng ớt, giảm trọng lượng khô, hàm lượng capsaicin và oleoresin trong quả ớt (Mistry et al, 2010). Nên xác định thành phần cũng như định danh đến loài của nam Colletotrichum spp. có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn là yếu tố quan trọng dé kiểm soát mầm bệnh hiệu quả vì quan hệ giữa nam với cây ký chủ cũng như tính man cảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài (Mongkolporn et al, 2010).
Tùy nhiên, việc xác định định danh nam Colletotrichum hại ớt ở trên (cũng như các loài Colletotrichum khác) chủ yếu dựa vào nguồn gốc ký chủ và các đặc điểm hình thái bao gồm màu sắc, tốc độ phát triển và cấu trúc tản nấm; hình dang và kích thước bào tử phân sinh; hình dang và kích thước đĩa ap, có hay không có lông gai của đĩa cành; hình thành hay không hình thành hạch nam; hình thành hay không hình thành giai đoạn sinh sản hữu tinh. Do các đặc điểm hình thái không đủ dé phân loại tới mức loài nên đã có quá nhiều nhằm lẫn trong phân loại nam Colletotrichum (Hyde et al. Do đó, việc định danh chính xác cấp độ loài bằng kỹ thuật phân tử đối với các giống ớt hiện nay là cần thiết. Chính vì vậy đề tài “Phân lập và định danh nắm Colletotrichum spp.
gây bệnh than thư trên ót tại tỉnh Tiền Giang”. được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh và tuyên chọn được giống nam Colletotrichum spp. gây bệnh than thư trên ớt.
Nhằm mục đích phát hiện những dòng nam Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ở các vùng dịch bệnh ở các huyện trong tỉnh Tiền Giang. Yêu cầu Thu thập và phân lập nắm Colletotrichum spp. gây bệnh than thư trên ớt Định danh hình thái các chủng nam Colletotrichum spp.
gây bệnh than thư trên ớt đã thu thập được. Định danh bằng kỹ thuật phân tử trên trình tự 3 vùng gen: ITS, TUB2, và ApMat từ các chủng nam Colletotrichum spp. gây bệnh than thư trên ớt đã thu thập được. Đánh giá khả năng gây bệnh của nắm Colletotrichum spp.d6i với giỗng ớt chỉ thién(Capsicum frutescens) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Giới hạn đề tài Đề tài đã được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8 năm 2023 đến tháng 2 năm 2024, các thí nghiệm được tiến hành tai phòng thí nghiệm RIBE 302 — 304 (Bệnh học và Chân đoán) thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm TP. Hỗ Chi Minh. Mẫu bệnh được thu thập trên quả ớt tại huyện Gò Công Đông, huyện Chợ Gạo, thị xã Cai Lậy Định danh hình thái va sinh học phân tử. Đánh giá kha năng gây bệnh của nam Colletotrichum spp.déi với giỗng ớt chỉ thién(Capsicum frutescens) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Tổng quan về cây ót 1.1INguồn gốc Từ châu Mỹ, đầu tiên, cây ớt đã được Christopher Columbus du nhập vào châu Âu sau khi ông khám phá ra châu Mỹ vào thế kỷ 15. Diego Alvarez Chanca, một được sĩ trong chuyến đi thứ hai của Columbus đến West Indies năm 1493, đã mang những hạt ớt đầu tiên về Tây Ban Nha và đã lần đầu viết về các tác dụng dược lý của chúng vào năm 1494. Từ Mexico, Tây Ban Nha các thương lái đã nhanh chóng chuyền ớt qua Ấn Độ, Philippines và sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản với sự trợ giúp của các thủy thủ châu Âu. Gia vị mới này đã nhanh chóng được sử dụng trong chế biến thức ăn của các quốc gia này.
Do giao thương phát triển, cây ớt đã dần phân bố khắp thé giới, chủ yếu nhờ các nhà buôn và thủy thủ người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha. Khả năng phân bồ rộng của cây ớt một phần cũng nhờ khả năng thích ứng khí hậu khá tốt của loài này.2 Phân loại khoa học Giới (Kingdom): Plantae; Nganh (Phylum): Spermatophyta; Phan nganh (Subphylum): Angiospermae; Lớp (Class): Dicotyledonae; Bộ (Oder): Solanales; Ho (Family): Solanaceae Chi (Genus): Capcicum L. Loài (Species): Có khoảng 269 loài 1.3 Đặc điểm học thực vật Rễ: Cây ớt có cả 2 loại rễ cọc và rễ chùm, ở giai đoạn đầu cây phát triển rễ cọc, sau đó nhiều rễ phụ phát triển mạnh tạo thành hệ thống rễ chùm, phát triển ăn sâu và phân nhánh mạnh về bốn phía, nhưng chủ yếu tập trung ở tang đất mặt 0 - 30cm. Phân bổ theo chiều ngang với đường kính 50 — 70cm.
Rễ ớt có khả năng chịu hạn nhưng không chịu được ngập ung. Khi tưới nước day đủ, bộ rễ ăn nông phân bố rộng và ngược lại khi gặp hạn, rễ ăn sâu và phân bó hẹp.