Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Đỗ Thị Bình Xuân Lộc
• Người hướng dẫn: Ts. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI Aspergillus niger
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A.
• 1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A.
• 1.3. Vai trò của nấm sợi A.
• 1.4. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• 1.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn A.
• 1.4.2. Cơ chế chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A.
• 1.4.3. Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen vào nấm. Ưu, nhược điểm của phương pháp
• 1.4.4. Triển vọng của phương pháp ATMT trong nghiên cứu chức năng gen
• 1.5. Tổng quan về gen stuA
• 1.5.1. Giới thiệu về gen stuA
• 1.5.2. Vai trò của gen stuA ở nấm sợi
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi sinh vật và vector
• 2.2. Hóa chất và trang thiết bị
• 2.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.4. Các cặp mồi PCR
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thu nhận bào tử nấm
• 2.5.2. Tách chiết DNA hệ gen
• 2.5.3. Thành phần của phản ứng PCR
• 2.5.4. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A.
• 2.5.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
• 2.5.6. Chuyển gen vào nấm sợi A. niger thông qua vi khuẩn A.
• 2.5.7. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A.
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Protein mã hóa bởi gen stuA có mức độ tương đồng cao trong chi Aspergillus và Penicillium
• 3.2. Xóa thành công gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng marker kháng kháng sinh
• 3.3. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A. Tạo thành công cấu trúc xóa gen stuA. niger sử dụng marker kháng kháng sinh
• 3.4. Xóa thành công gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
• 3.5. Tạo cấu trúc xóa gen stuA sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
• 3.6. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG từ A.
• 3.7. Phục hồi thành công gen stuA ở chủng xóa gen
• 3.8. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A.
• 3.9. Gen stuA ảnh hưởng đến hình thái, cấu trúc cuống sinh bào tử của A.
• 3.10. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các nguồn cacbon khác nhau
• 3.11. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các nguồn nitơ khác nhau
• 3.12. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng stress của A.
• 3.13. Nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử ở chủng A. niger xóa gen stuA
• 3.14. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh axit hữu cơ của A.
• 3.15. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase của A.
• 3.16. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của A.
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Nấm Aspergillus niger là một trong những loài nấm quan trọng trong nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học. Gen stuA đóng vai trò chủ chốt trong quá trình phát triển và biệt hóa tế bào của nấm. Nghiên cứu vai trò của gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học mà còn mở ra hướng đi mới trong ứng dụng công nghệ sinh học.

1.1. Giới thiệu về gen stuA và nấm Aspergillus niger

Gen stuA là một gen quan trọng trong quá trình phát triển của nấm Aspergillus niger. Nó tham gia vào việc hình thành bào tử và phát triển sợi nấm. Nghiên cứu về gen này giúp làm sáng tỏ các cơ chế di truyền và sinh lý của nấm.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen stuA

Nghiên cứu gen stuA không chỉ có ý nghĩa trong việc hiểu biết về sinh học nấm mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất enzym và axit hữu cơ. Việc xác định vai trò của gen này có thể giúp cải thiện quy trình sản xuất trong công nghiệp.

II. Thách thức trong nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Mặc dù gen stuA đã được nghiên cứu ở nhiều loài nấm khác, nhưng việc xác định vai trò của nó ở Aspergillus niger vẫn còn nhiều thách thức. Các vấn đề như sự phức tạp trong cơ chế di truyền và sự đa dạng trong các chủng nấm gây khó khăn cho việc nghiên cứu.

2.1. Các vấn đề trong việc xác định chức năng gen

Việc xác định chức năng của gen stuA gặp khó khăn do sự tương tác phức tạp giữa các gen và môi trường. Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen này.

2.2. Khó khăn trong phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens mặc dù hiệu quả nhưng vẫn có những hạn chế. Việc tối ưu hóa điều kiện chuyển gen là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất trong nghiên cứu.

III. Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens trong nghiên cứu gen stuA

Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens đã được áp dụng thành công trong nghiên cứu gen stuA ở nấm Aspergillus niger. Phương pháp này cho phép tạo ra các chủng nấm đột biến để nghiên cứu vai trò của gen một cách hiệu quả.

3.1. Giới thiệu về phương pháp chuyển gen

Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens là một kỹ thuật tiên tiến trong sinh học phân tử. Nó cho phép chuyển gen vào tế bào nấm một cách hiệu quả và chính xác.

3.2. Quy trình thực hiện chuyển gen

Quy trình chuyển gen bao gồm các bước chuẩn bị chủng nấm, vi khuẩn Agrobacterium và môi trường nuôi cấy. Sự tối ưu hóa từng bước trong quy trình là rất quan trọng để đạt được tỷ lệ thành công cao.

IV. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen stuA có ảnh hưởng lớn đến hình thái và khả năng sinh trưởng của nấm Aspergillus niger. Việc xóa gen này đã làm thay đổi đáng kể các đặc điểm sinh lý của nấm.

4.1. Ảnh hưởng của gen stuA đến hình thái nấm

Nghiên cứu cho thấy việc xóa gen stuA dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc cuống sinh bào tử và hình thái của nấm. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của gen trong sự phát triển của nấm.

4.2. Tác động đến khả năng sinh trưởng và phát triển

Gen stuA cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm trên các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Việc nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện năng suất sản xuất enzym và axit hữu cơ.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc hiểu rõ hơn về gen này sẽ giúp cải thiện quy trình sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã xác định rõ vai trò của gen stuA trong sự phát triển và sinh trưởng của nấm Aspergillus niger. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học.

5.2. Triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện chuyển gen và ứng dụng gen stuA trong sản xuất enzym và axit hữu cơ, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này có thể được tìm thấy khắp nơi trên Trái Đất, từ đất, thức ăn, các sản phẩm thực vật và ngay cả trong không khí. niger đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn và sản phẩm do nó sinh ra được sử dụng phổ biến trong công nghệp thực phẩm và đồ uống. niger có khả năng tiết nhiều loại enzym vào môi trường nuôi cấy, do đó loài nấm này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các axit hữu cơ và các enzym ngoại bào, điển hình là axit citric, axit gluconic, các enzym quan trọng như phytase, amylase, protease, α-galactosidae và hàng loạt các enzym khác.

Nghiên cứu chức năng gen ở nấm sợi đã có những bước tiến lớn trong những năm gần đây. Năm 1998, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được áp dụng thành công lần đầu tiên ở nấm sợi. Phương pháp này với ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, áp dụng được trên nhiều loại nấm khác nhau làm cho phương pháp này trở thành một công cụ hữu hiệu trong các thí nghiệm nghiên cứu tạo đột biến gen đích và điều tra chức năng gen ở nấm sợi. Xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng là giải pháp toàn diện để điều tra và đánh giá một cách cụ thể chức năng của gen, đồng thời cho phép quan sát kiểu hình liên quan đến gen đã bị xóa một cách chính xác.

Gần đây, hệ gen của A. niger đã được giải trình tự hoàn toàn, những dữ liệu thu được đã hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền để điều tra vai trò của các gen mong muốn. Gen stuA là gen chủ chốt của quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, hình thành bào tử, hình thành sợi, trao đổi chất bậc một và trao đổi chất bậc hai. Vai trò của gen stuA đã được nghiên cứu ở nhiều nấm sợi khác như Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum… Tuy nhiên, vai trò của gen này ở A.

niger vẫn chưa được điều tra. Do đó, đề tài luận văn với tiêu đề: ―Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens‖ được xây dựng và thực hiện với những nội dung chính như sau: - Xóa gen stuA ở A. niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và marker chọn lọc là gen kháng kháng sinh hoặc gen trợ dưỡng uridine/uracil.

- Phục hồi sự biểu hiện của gen stuA ở chủng A. niger đột biến đã xóa gen stuA. - Điều tra, so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng A. niger xóa gen stuA so với chủng nấm gốc và chủng phục hồi.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Chƣơng 1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger 1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A. niger Chi Aspergillus là một chi nấm sợi gồm hàng trăm loài phân bố ở các điều kiện khí hậu khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm một số tác nhân gây bệnh cơ hội (A.

terreus), sản xuất độc tố (A. parasiticus) và các loài được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, trong đó nổi bật hơn cả là A. Năm 1867, lần đầu tiên A.

niger được mô tả bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem trong bản thảo ―Physiologie des mucédinées”. Khi đó, ông phân lập được Aspergillus sp. có bào tử tương tự như Aspergillus glaucus nhưng có màu đen trên các môi trường khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên cho loài nấm này là A.

niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm Nigri hay tên gọi khác là phân nhóm Aspergillus đen [45]. niger phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, nó có thể được phân lập trên tất cả các châu lục và không có sự chọn lọc nào với điều kiện môi trường, chúng sinh trưởng một cách tự nhiên trên vật chất hữu cơ [92]. Loài nấm này phát triển mạnh trong đất và rác, phân compost và nguyên liệu thực vật đang phân rã, thậm chí có thể được tìm thấy trong môi trường băng giá và môi trường biển. niger là vi sinh vật hiếu khí, sinh trưởng và phát triển khi có mặt oxy.

Chúng có thể sinh trưởng ở các điều kiện môi trường đa dạng từ nhiệt độ đến pH. niger phát triển ở nhiệt độ từ 6 - 47°C, tối ưu ở khoảng 35 - 37°C. Nó có thể sống sót ở 60°C nhưng sẽ bị loại bỏ ở 63°C trong vòng 25’. Khoảng pH cho phép A.

niger sinh trưởng rất rộng, từ 1,5 - 9,8 và tối ưu nhất là ở pH = 6 [7, 41, 57]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Hình 1. Hình thái nấm sợi A. niger trên đĩa và dưới kính hiển vi [43, 120] (A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, (B) Mép ngoài khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử.

(E) Bào tử của nấm sợi A. niger dưới kính hiển vi. Thanh tỉ lệ = 10 µm Ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của A. niger tăng khoảng 0,25 mm trong vòng 1 giờ với điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng.

Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy rằng vùng mép ngoài của khuẩn lạc A. niger 7 ngày tuổi chỉ gồm một lớp sợi nấm duy nhất. Một vài milimet phía trong vùng ngoại vi thì hệ sợi dày hơn và có thể lên đến sáu lớp sợi nấm chồng lên nhau. Sáu lớp sợi nấm này chia thành 3 lớp riêng biệt: lớp trên cùng, lớp dưới cùng và các lớp ở giữa gồm mạng lưới hệ sợi mỏng và dày.

Cấu trúc hệ sợi với ba lớp riêng biệt cũng được quan sát thấy ở trung tâm của khuẩn lạc [47]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Hình 1. Quá trình phát triển của A. niger được theo dõi dưới kính hiển vi điện tử quét [47] (A) Sợi nấm khí sinh tương tự với sợi nấm sinh dưỡng.

(C, D) Đỉnh sợi khí sinh phồng lên để tạo thành bọng bào tử. (E) Các chồi hình thành trên các bọng bào tử. (F, G) Chồi phát triển thành thể bình sơ cấp. (H) Thể bình thứ cấp hình thành trên đỉnh của thể bình thứ cấp.

(I, J) Các chuỗi bào tử được tạo thành trên thể bình thứ cấp. Thanh tỷ lệ từ hình A-F tương tự như hình G Sau thời kì tăng trưởng sinh dưỡng, A. niger tạo thành hai loại sợi nấm khí sinh. Một loại khá giống với sợi nấm sinh dưỡng và có đường kính khoảng 2 - 3 µm, loại còn lại có đường kính khoảng 6 - 7 µm.

Các sợi nấm khí sinh đường kính 2 - 3 µm của được hình thành sau khi cấy bào tử trên môi trường đầy đủ khoảng 8 giờ. Mặc dù thời gian hình thành sợi nấm khí sinh dường như không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy nhưng mật độ của chúng trên môi trường tối thiểu thấp hơn so 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc với môi trường đầy đủ. Sự hình thành của hệ sợi khí sinh bắt đầu ở trung tâm khuẩn lạc, di chuyển ra ngoài và dừng lại khi cách mép hệ sợi nấm vài milimet. Điều này có nghĩa rằng khả năng hệ sợi hình thành hệ sợi khí sinh sẽ nhanh hơn khi khuẩn lạc già hơn [4].

Quá trình sinh trưởng khí sinh đã được đề xuất là liên quan đến tín hiệu mật độ tế bào của sợi nấm sinh dưỡng [112, 114]. Phân tử tín hiệu sẽ cảm ứng gen kị nước. Những gen này mã hóa protein làm giảm sức căng bề mặt nước để cho phép sợi nấm xuyên qua mặt phân cách để phát triển trong không khí và làm cho các cấu trúc như cấu trúc sinh bào tử và bào tử có tính kị nước. Tính kị nước này đảm bảo rằng cấu trúc sinh sản không rơi trở lại cơ chất trong điều kiện ẩm ướt và giúp bào tử phân tán bằng gió hoặc vector.

Tuy nhiên, những protein kị nước nào được tiết vào môi trường nuôi cấy để làm giảm sức căng bề mặt vẫn chưa được biết đến [111, 113]. niger cũng như phần lớn các loài thuộc chi Aspergillus được biết mới chỉ có hình thức sinh sản vô tính với cấu trúc sinh bào tử khá đặc trưng [5]. Cấu trúc sinh bào tử được biệt hóa từ cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử đầu tiên của A.

niger hình thành sau 10 giờ và cấu trúc sinh bào tử hình thành sau 20 giờ nuôi cấy ở 30°C. Khi cuống sinh bào tử đạt đến chiều cao tối đa của nó, phần đỉnh sợi sẽ phồng lên và hình thành bọng bào tử có đường kính 10 μm. Trên các bọng bào tử này sẽ hình thành các chồi, từ đó phát triển thành thể bình. Thể bình gồm hai lớp, lớp thể bình sơ cấp hình tam giác cân ngược, lớp thể bình thứ cấp hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 µm [27].

Các chuỗi bào tử đính được tạo thành trên thể bình thứ cấp và có tới hơn 10000 bào tử có thể được tạo ra từ một cấu trúc sinh bào tử [47]. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger Kích thước hệ gen của A. niger ước tính vào khoảng từ 35,5 - 38,5 megabase (Mb) gồm tám nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau, dao động từ 3,5 - 6,6 Mb.

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Năm 2007, trình tự toàn bộ hệ gen của chủng A.88 đã được công bố và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại http://www. So sánh các nhóm protein chức năng ở A. niger với một số loài nấm khác [79]. Sce, Saccharomyces cerevisiae; Mgi, Magnaporthe grisea; Ncr, Neurospora crassa; Sno, Stagonospora nodulum; Ani, Aspergillus nidulans; Afu, Aspergillus fumigatus; Aor, Aspergillus oryzae; Ang, Aspergillus niger.

Chuyển hóa (01): chuyển hóa cacbon và hợp chất carbohydrate (01.05), chuyển hóa lipit, axit béo và isoprenoid (01.06), chuyển hóa thứ cấp (01. Vận chuyển nội bào (08): vận chuyển bằng bóng bào (08.07), vận chuyển ngoại bào, xuất bào và quá trình tiết (08. Số phận protein (06): quá trình tiết protein và số phận (06.04) và vận chuyển nội bào (06. Độ dài của các thanh tỷ lệ thuận với số lượng gen trong mỗi nhóm.