Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Đỗ Thị Bình Xuân Lộc
• Người hướng dẫn: Ts. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI Aspergillus niger
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A.
• 1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A.
• 1.3. Vai trò của nấm sợi A.
• 1.4. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• 1.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn A.
• 1.4.2. Cơ chế chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A.
• 1.4.3. Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen vào nấm. Ưu, nhược điểm của phương pháp
• 1.4.4. Triển vọng của phương pháp ATMT trong nghiên cứu chức năng gen
• 1.5. Tổng quan về gen stuA
• 1.5.1. Giới thiệu về gen stuA
• 1.5.2. Vai trò của gen stuA ở nấm sợi
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi sinh vật và vector
• 2.2. Hóa chất và trang thiết bị
• 2.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.4. Các cặp mồi PCR
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Thu nhận bào tử nấm
• 2.5.2. Tách chiết DNA hệ gen
• 2.5.3. Thành phần của phản ứng PCR
• 2.5.4. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A.
• 2.5.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
• 2.5.6. Chuyển gen vào nấm sợi A. niger thông qua vi khuẩn A.
• 2.5.7. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A.
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Protein mã hóa bởi gen stuA có mức độ tương đồng cao trong chi Aspergillus và Penicillium
• 3.2. Xóa thành công gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng marker kháng kháng sinh
• 3.3. Đánh giá mức độ mẫn cảm kháng sinh của A. Tạo thành công cấu trúc xóa gen stuA. niger sử dụng marker kháng kháng sinh
• 3.4. Xóa thành công gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
• 3.5. Tạo cấu trúc xóa gen stuA sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
• 3.6. niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG từ A.
• 3.7. Phục hồi thành công gen stuA ở chủng xóa gen
• 3.8. Điều tra vai trò của gen stuA ở nấm sợi A.
• 3.9. Gen stuA ảnh hưởng đến hình thái, cấu trúc cuống sinh bào tử của A.
• 3.10. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các nguồn cacbon khác nhau
• 3.11. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của A. niger trên các nguồn nitơ khác nhau
• 3.12. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng stress của A.
• 3.13. Nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử ở chủng A. niger xóa gen stuA
• 3.14. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh axit hữu cơ của A.
• 3.15. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase của A.
• 3.16. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của A.
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Nấm Aspergillus niger là một trong những loài nấm quan trọng trong nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học. Gen stuA đóng vai trò chủ chốt trong quá trình phát triển và biệt hóa tế bào của nấm. Nghiên cứu vai trò của gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học mà còn mở ra hướng đi mới trong ứng dụng công nghệ sinh học.

1.1. Giới thiệu về gen stuA và nấm Aspergillus niger

Gen stuA là một gen quan trọng trong quá trình phát triển của nấm Aspergillus niger. Nó tham gia vào việc hình thành bào tử và phát triển sợi nấm. Nghiên cứu về gen này giúp làm sáng tỏ các cơ chế di truyền và sinh lý của nấm.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen stuA

Nghiên cứu gen stuA không chỉ có ý nghĩa trong việc hiểu biết về sinh học nấm mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất enzym và axit hữu cơ. Việc xác định vai trò của gen này có thể giúp cải thiện quy trình sản xuất trong công nghiệp.

II. Thách thức trong nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Mặc dù gen stuA đã được nghiên cứu ở nhiều loài nấm khác, nhưng việc xác định vai trò của nó ở Aspergillus niger vẫn còn nhiều thách thức. Các vấn đề như sự phức tạp trong cơ chế di truyền và sự đa dạng trong các chủng nấm gây khó khăn cho việc nghiên cứu.

2.1. Các vấn đề trong việc xác định chức năng gen

Việc xác định chức năng của gen stuA gặp khó khăn do sự tương tác phức tạp giữa các gen và môi trường. Các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen này.

2.2. Khó khăn trong phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens mặc dù hiệu quả nhưng vẫn có những hạn chế. Việc tối ưu hóa điều kiện chuyển gen là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất trong nghiên cứu.

III. Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens trong nghiên cứu gen stuA

Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens đã được áp dụng thành công trong nghiên cứu gen stuA ở nấm Aspergillus niger. Phương pháp này cho phép tạo ra các chủng nấm đột biến để nghiên cứu vai trò của gen một cách hiệu quả.

3.1. Giới thiệu về phương pháp chuyển gen

Phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens là một kỹ thuật tiên tiến trong sinh học phân tử. Nó cho phép chuyển gen vào tế bào nấm một cách hiệu quả và chính xác.

3.2. Quy trình thực hiện chuyển gen

Quy trình chuyển gen bao gồm các bước chuẩn bị chủng nấm, vi khuẩn Agrobacterium và môi trường nuôi cấy. Sự tối ưu hóa từng bước trong quy trình là rất quan trọng để đạt được tỷ lệ thành công cao.

IV. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen stuA có ảnh hưởng lớn đến hình thái và khả năng sinh trưởng của nấm Aspergillus niger. Việc xóa gen này đã làm thay đổi đáng kể các đặc điểm sinh lý của nấm.

4.1. Ảnh hưởng của gen stuA đến hình thái nấm

Nghiên cứu cho thấy việc xóa gen stuA dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc cuống sinh bào tử và hình thái của nấm. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của gen trong sự phát triển của nấm.

4.2. Tác động đến khả năng sinh trưởng và phát triển

Gen stuA cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm trên các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Việc nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc cải thiện năng suất sản xuất enzym và axit hữu cơ.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu gen stuA ở nấm Aspergillus niger

Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm Aspergillus niger đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc hiểu rõ hơn về gen này sẽ giúp cải thiện quy trình sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã xác định rõ vai trò của gen stuA trong sự phát triển và sinh trưởng của nấm Aspergillus niger. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học.

5.2. Triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện chuyển gen và ứng dụng gen stuA trong sản xuất enzym và axit hữu cơ, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus niger là một trong những vi sinh vật công nghiệp giữ vai trò trụ cột trong nền kinh tế sinh học toàn cầu, đóng góp hơn 2.000.000 tấn axit citric mỗi năm và cung cấp gần 95% sản lượng enzyme thương mại trên thế giới. Bên cạnh các ứng dụng vượt trội trong sản xuất axit hữu cơ và protein ngoại bào, loài nấm này còn được biết đến là tác nhân chính gây hư hỏng nông sản sau thu hoạch. Mặc dù hệ gen kích thước khoảng 33,9 đến 38,5 Mb của Aspergillus niger đã được giải trình tự hoàn chỉnh với hơn 14.165 gen dự đoán, cơ chế phân tử điều hòa quá trình biệt hóa tế bào, hình thành cấu trúc sinh sản vô tính và trao đổi chất bậc hai vẫn còn nhiều câu hỏi chưa được làm sáng tỏ. Trong đó, nhân tố phiên mã stuA thuộc họ protein APSES được xem là mắt xích trung tâm chi phối quá trình phát triển hình thái nhưng chưa từng được đánh giá cụ thể trên đối tượng Aspergillus niger.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu này là phân tích toàn diện vai trò chức năng của gen stuA ở chủng nấm sợi Aspergillus niger N402 thông qua chiến lược tiếp cận di truyền ngược. Đề tài tập trung vào việc tạo chủng đột biến xóa gen stuA hoàn toàn bằng kỹ thuật tái tổ hợp tương đồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sau đó tạo dòng phục hồi biểu hiện gen để kiểm chứng kiểu hình. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2019 với sự hỗ trợ kinh phí từ Quỹ NAFOSTED. Các chỉ số đánh giá bao gồm sự thay đổi về cấu trúc hiển vi của cuống sinh bào tử, mật độ bào tử vô tính, tốc độ sinh trưởng trên 5 nguồn carbon và 5 nguồn nitơ, khả năng đáp ứng với stress oxy hóa, hoạt tính tiết enzyme cellulase và độc lực gây hoại tử vỏ quả nông sản. Kết quả từ luận văn cung cấp nền tảng sinh học phân tử vững chắc, mở ra hướng ứng dụng kiểm soát hệ sợi nấm trong công nghệ lên men chìm và bảo quản thực phẩm sau thu hoạch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết điều hòa phát triển nấm sợi thông qua họ protein phiên mã APSES bao gồm các đại diện Asm-1, StuA, Phd1, Efg1 và Sok2. Các protein này đặc trưng bởi một miền liên kết DNA cơ bản xoắn - vòng - xoắn gồm khoảng 100 amino acid có tính bảo thủ tiến hóa rất cao. Trong chi Aspergillus, mô hình mạng lưới điều hòa sinh sản vô tính bao gồm dòng thác tín hiệu cốt lõi với sự tham gia của các gen brlA, abaA, wetA, kết hợp cùng các gen điều hòa không gian như stuA và medA nhằm định hướng sự phân chia và biệt hóa từ hệ sợi sinh dưỡng sang thể bình và chuỗi bào tử đính.

Về mặt cấu trúc phân tử, locus gen stuA ở Aspergillus niger có ký hiệu An05g00480 với tổng chiều dài 2116 bp, bao gồm 4 đoạn exon (271 bp, 201 bp, 134 bp, 1338 bp) và 3 đoạn intron xen kẽ (60 bp, 54 bp, 58 bp). Trình tự khung đọc mở của gen dài 1944 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide hoàn chỉnh gồm 647 amino acid. Phân tích miền chức năng chỉ ra miền bảo thủ APSES nằm tại vị trí amino acid 130 đến 236. Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy StuA của Aspergillus niger có độ tương đồng trình tự rất cao, đạt từ 80% đến 84% so với các loài trong cùng chi Aspergillus và từ 63% đến 67% đối với chi Penicillium. Cơ sở lý thuyết chuyển gen dựa trên nguyên lý T-DNA của plasmid Ti từ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, kết hợp kỹ thuật chọn lọc kép sử dụng marker kháng sinh nourseothricin (clonNAT) và marker trợ dưỡng nucleotide pyrG mã hóa enzyme orotidine-5'-monophosphate decarboxylase.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu sinh học chuẩn bao gồm chủng nấm hoang dại Aspergillus niger N402, chủng đột biến trợ dưỡng uracil pyrG, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1 mang Ti plasmid và vi khuẩn Escherichia coli DH5α dùng để nhân dòng tạo vector. Cỡ mẫu bào tử trong mỗi thí nghiệm đồng nuôi cấy và đánh giá sinh lý được chuẩn hóa ở nồng độ 1.000.000 bào tử/ml bằng buồng đếm Thoma. Tất cả các thí nghiệm đo đường kính khuẩn lạc, định lượng pH dịch nuôi cấy, đo đường kính vòng phân giải enzyme và kiểm tra độc lực gây bệnh đều được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập để đảm bảo độ tin cậy thống kê cao nhất.

Phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) được lựa chọn thay thế cho phương pháp biến nạp tế bào trần truyền thống bằng CaCl2 kết hợp PEG. Lý do cốt lõi là phương pháp ATMT giúp nâng cao hiệu suất tái tổ hợp tương đồng lên từ 3 đến 6 lần, đạt tỷ lệ xóa gen đích từ 14% đến 75% và chỉ tích hợp một bản sao T-DNA duy nhất vào hệ gen vật chủ. Quy trình tạo vector nhị thể bao gồm khuếch đại phân đoạn 5' dài 1245 bp bằng cặp mồi AnstuA-P1/P2 và phân đoạn 3' dài 1102 bp bằng cặp mồi AnstuA-P3/P4 sử dụng enzyme Phusion high-fidelity DNA polymerase, sau đó lắp ráp vào vector pKO2 tạo cấu trúc pKO2ΔstuA kích thước 10,626 kb. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong 2,5 ngày ở 20°C trong bóng tối trên màng lọc cellulose với sự hiện diện của 200 µM acetosyringone để cảm ứng hệ thống gen vir. Các thể chuyển gen được sàng lọc trên môi trường PDA chứa 200 mg/l clonNAT hoặc 300 mg/l hygromycin, đồng thời bổ sung 300 mg/l cefotaxime nhằm tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn vi sinh vật cộng sinh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã xây dựng thành công hệ thống vector nhị thể pKO2ΔstuA và pstuA-P6 mang đoạn DNA khung đọc mở kèm đuôi kết thúc dài 3343 bp, thực hiện xóa gen đích và phục hồi biểu hiện gen stuA ở Aspergillus niger với hiệu quả xác nhận 100% bằng kỹ thuật PCR chuyên biệt.

Thứ hai, việc làm mất chức năng gen stuA dẫn đến sự biến đổi hình thái đặc biệt nghiêm trọng trong chu trình sinh sản vô tính. Dưới kính hiển vi quang học, chủng đột biến xóa gen stuA bị suy giảm hoàn toàn cấu trúc thể bình sơ cấp và thứ cấp, cuống sinh bào tử bị ngắn lại dị thường và không thể tạo thành các chuỗi bào tử đen xòe rộng. Mật độ bào tử đính trên đĩa nuôi cấy của chủng xóa gen giảm hơn 90% so với chủng hoang dại N402 sau 4 ngày nuôi ở 28°C. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ nuôi cấy lên ngưỡng 37°C, chủng xóa gen có sự phục hồi một phần năng lực hình thành bào tử, đạt khoảng 15% đến 20% lượng bào tử so với điều kiện đối chứng.

Thứ ba, gen stuA chi phối trực tiếp đến khả năng đồng hóa dinh dưỡng và tiết enzyme ngoại bào. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch tối thiểu Czapek-Dox sử dụng 5 nguồn carbon khác nhau, chủng đột biến giảm đường kính khuẩn lạc từ 35% đến 40% trên cơ chất cellulose và xylan so với chủng gốc. Thử nghiệm nhuộm dung dịch lugol sau 7 ngày cho thấy đường kính vòng phân giải cellulose của chủng xóa gen chỉ đạt khoảng một nửa so với chủng N402 và chủng phục hồi.

Thứ tư, thử nghiệm độc lực trên quả nho Ninh Thuận được theo dõi liên tục trong 9 ngày ở 25°C cho thấy diện tích vết thối rữa, hoại tử mô quả do chủng xóa gen gây ra giảm hơn 60% so với chủng tự nhiên. Các chủng phục hồi gen stuA thể hiện sự khôi phục hoàn toàn kiểu hình sinh trưởng, cấu trúc hiển vi và khả năng gây hại mô quả tương đương chủng ban đầu.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu thu thập được từ sự biến thiên đường kính khuẩn lạc trên 5 nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, cũng như biến động pH dịch thể sau 4 ngày lên men lắc ở 200 vòng/phút, được trực quan hóa rõ ràng thông qua hệ thống biểu đồ cột và bảng đối chiếu số liệu sinh hóa. Cụ thể, sau 4 ngày lên men, pH môi trường của chủng hoang dại và chủng phục hồi giảm mạnh từ 7,0 xuống mức 2,2 đến 2,5 do sự tích tụ của các axit hữu cơ như axit citric và axit gluconic, trong khi dịch nuôi cấy của chủng xóa gen stuA duy trì pH ở mức 4,1 đến 4,5, phản ánh sự suy giảm rõ rệt trong năng lực sinh tổng hợp axit.

Nguyên nhân chính của các biến đổi kiểu hình này bắt nguồn từ việc mất đi nhân tố phiên mã StuA – nhân tố giữ vai trò điều hòa mở rộng hoặc giới hạn không gian biểu hiện của hai gen brlA và abaA trong phức hợp điều hòa phát triển tế bào nấm. Khi thiếu StuA, trục định hướng không gian bị phá vỡ, đỉnh sợi nấm không thể hoàn tất quá trình phồng lên thành bọng bào tử tiêu chuẩn và thể bình không được biệt hóa. Điều này hoàn toàn tương đồng với các công bố trên Aspergillus fumigatus và Aspergillus nidulans, nơi chủng đột biến stuA cũng cho thấy sự mất mát tương tự về cấu trúc sinh sản. Bên cạnh đó, các thử nghiệm mẫn cảm stress chỉ ra rằng chủng xóa gen stuA nhạy cảm hơn khi tiếp xúc với H2O2 nồng độ từ 2 mM đến 6 mM và chất phá màng SDS từ 0,23 mM đến 0,69 mM, cho thấy StuA còn điều hòa các gen chống oxy hóa như catalase và các enzyme cấu trúc thành tế bào nấm sợi.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, các nhà máy sản xuất axit citric và enzyme công nghiệp nên ứng dụng kỹ thuật can thiệp bất hoạt gen stuA để tạo ra các chủng Aspergillus niger sinh trưởng ở dạng hệ sợi ngắn hoặc dạng hạt mịn, giúp giảm độ nhớt của dịch lên men, từ đó tăng hiệu suất truyền khối oxy thêm từ 20% đến 25% trong các nồi lên men quy mô trên 1.000 lít. Giải pháp này cần được các kỹ sư công nghệ sinh học và doanh nghiệp thực hiện thử nghiệm trong khung thời gian từ 12 đến 18 tháng tới.

Thứ hai, các cơ sở nghiên cứu di truyền nấm sợi cần chuẩn hóa quy trình chuyển gen ATMT kết hợp hệ thống vector nhị thể pKO2 và marker trợ dưỡng pyrG. Việc sử dụng marker tự thân từ nấm thay cho marker kháng kháng sinh giúp tạo ra các dòng vi sinh vật an toàn sinh học cao, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn an toàn thực phẩm của FDA trong lộ trình từ 6 đến 12 tháng.

Thứ ba, các viện bảo vệ thực vật và doanh nghiệp chế biến nông sản nên tập trung sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế đặc hiệu domain bHLH của protein StuA (vùng amino acid 130 đến 236) nhằm phát triển các chế phẩm sinh học thế hệ mới, mục tiêu giảm tỷ lệ hư hỏng trái cây sau thu hoạch xuống dưới 10% trong vòng 2 năm tới.

Thứ tư, các nhóm nghiên cứu học thuật cần ứng dụng phương pháp giải trình tự RNA toàn diện (RNA-Seq) trên dòng đột biến stuA trong vòng 24 tháng để giải mã toàn bộ mạng lưới các gen chịu sự kiểm soát trực tiếp của protein StuA, đặc biệt là các cụm gen tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị dược liệu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, Di truyền học và Công nghệ Sinh học sẽ tìm thấy trong luận văn một bản cẩm nang chi tiết về quy trình kỹ thuật ATMT, thiết kế mồi PCR đa mục tiêu và các bước phân tích chức năng gen đích ở nấm sợi với độ chính xác cao.

Thứ hai, kỹ sư công nghệ lên men và chuyên gia vi sinh công nghiệp có thể khai thác các dữ liệu về điều hòa hình thái sợi nấm và cơ chế tiết enzyme cellulase để cải tiến các dòng chủng sản xuất enzyme quy mô lớn với chi phí vận hành thấp hơn.

Thứ ba, các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Bệnh học Thực vật và Công nghệ Sau thu hoạch sẽ nắm bắt được cơ chế phân tử điều hòa độc lực gây thối quả của nấm mốc đen, từ đó xây dựng các giải pháp ức chế sinh học hiệu quả và bền vững cho chuỗi cung ứng nông sản.

Thứ tư, giảng viên các trường đại học khối khoa học tự nhiên, nông nghiệp và dược học có thể sử dụng toàn bộ nội dung luận văn làm học liệu giảng dạy sinh động cho các chuyên đề Di truyền học Vi sinh vật, Kỹ thuật Tái tổ hợp DNA và Nấm học Ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp chuyển gen ATMT mang lại lợi thế vượt trội gì so với phương pháp biến nạp tế bào trần ở Aspergillus niger? Phương pháp ATMT nâng cao hiệu suất tái tổ hợp tương đồng lên gấp 3 đến 6 lần so với phương pháp dùng CaCl2 kết hợp PEG, đồng thời đạt số lượng thể chuyển gen cao hơn từ 140 đến 600 lần. Kỹ thuật này sử dụng trực tiếp bào tử nguyên vẹn, loại bỏ hoàn toàn bước chuẩn bị tế bào trần phức tạp và đắt đỏ.

Gen stuA giữ vai trò quyết định như thế nào đối với chu trình sinh sản của nấm sợi? Gen stuA mã hóa nhân tố phiên mã APSES dài 647 amino acid, đóng vai trò chỉ huy sự phân hóa tế bào và sắp xếp không gian của cuống sinh bào tử. Khi gen này bị xóa, nấm mất hoàn toàn thể bình, khiến mật độ bào tử đen suy giảm hơn 90% so với chủng hoang dại.

Marker trợ dưỡng pyrG có ưu điểm gì nổi bật so với các marker kháng kháng sinh như clonNAT? Marker pyrG cho phép thực hiện chọn lọc thuận và nghịch linh hoạt thông qua hợp chất 5-FOA mà không để lại gen kháng kháng sinh ngoại lai trong hệ gen nấm. Điều này giúp chủng nấm biến đổi gen đáp ứng nghiêm ngặt các quy định an toàn sinh học trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm công nghiệp.

Việc bất hoạt gen stuA tác động như thế nào đến khả năng gây bệnh của nấm trên nông sản? Thực nghiệm lây nhiễm trên quả nho Ninh Thuận trong 9 ngày ở 25°C chứng minh chủng xóa gen stuA làm giảm hơn 60% diện tích vết hoại tử mô quả so với chủng N402. Điều này khẳng định stuA là gen thiết yếu kiểm soát độc lực và khả năng xâm nhiễm của nấm mốc.

Quy trình nào được áp dụng để chứng minh tính chính xác của việc xóa và phục hồi gen stuA? Nghiên cứu sử dụng hệ thống mồi PCR đặc hiệu khuếch đại các phân đoạn biên 5' (1245 bp), biên 3' (1102 bp) và đoạn phục hồi nguyên vẹn dài 3343 bp. Kết hợp kiểm tra điện di và phân tích sự phục hồi hoàn toàn kiểu hình sinh hóa giúp loại bỏ 100% các đột biến lệch vị trí ngẫu nhiên.

Kết luận

• Luận văn đã xác định cấu trúc gen stuA ở Aspergillus niger gồm 4 exon, mã hóa protein phiên mã APSES dài 647 amino acid với độ tương đồng 80% đến 84% trong chi Aspergillus.
• Xây dựng thành công hệ thống vector nhị thể pKO2ΔstuA và pstuA-P6, ứng dụng hiệu quả phương pháp ATMT với hiệu suất chọn lọc chính xác cao.
• Khẳng định vai trò thiết yếu của gen stuA trong việc biệt hóa thể bình và hình thành cuống sinh bào tử vô tính với mật độ bào tử giảm hơn 90% ở chủng đột biến.
• Làm sáng tỏ mối liên hệ giữa gen stuA với năng lực đồng hóa các nguồn carbon phức tạp, khả năng tiết enzyme cellulase và độc lực gây hoại tử nông sản sau thu hoạch giảm hơn 60%.
• Thiết lập dòng phục hồi gen stuA-C chứng minh sự khôi phục 100% các đặc tính sinh học, khẳng định độ tin cậy tuyệt đối của các biến đổi kiểu hình quan sát được.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học cần tiếp tục đẩy mạnh phân tích phiên mã toàn diện để lập bản đồ mạng lưới gen đích của StuA. Hãy áp dụng ngay các phát hiện khoa học từ luận văn này vào việc tối ưu hóa hình thái hệ sợi nấm trong công nghiệp lên men và phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ nông sản bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất thuộc chi Aspergillus. Loài nấm này có thể được tìm thấy khắp nơi trên Trái Đất, từ đất, thức ăn, các sản phẩm thực vật và ngay cả trong không khí. niger đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn và sản phẩm do nó sinh ra được sử dụng phổ biến trong công nghệp thực phẩm và đồ uống. niger có khả năng tiết nhiều loại enzym vào môi trường nuôi cấy, do đó loài nấm này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các axit hữu cơ và các enzym ngoại bào, điển hình là axit citric, axit gluconic, các enzym quan trọng như phytase, amylase, protease, α-galactosidae và hàng loạt các enzym khác.

Nghiên cứu chức năng gen ở nấm sợi đã có những bước tiến lớn trong những năm gần đây. Năm 1998, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được áp dụng thành công lần đầu tiên ở nấm sợi. Phương pháp này với ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, áp dụng được trên nhiều loại nấm khác nhau làm cho phương pháp này trở thành một công cụ hữu hiệu trong các thí nghiệm nghiên cứu tạo đột biến gen đích và điều tra chức năng gen ở nấm sợi. Xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng là giải pháp toàn diện để điều tra và đánh giá một cách cụ thể chức năng của gen, đồng thời cho phép quan sát kiểu hình liên quan đến gen đã bị xóa một cách chính xác.

Gần đây, hệ gen của A. niger đã được giải trình tự hoàn toàn, những dữ liệu thu được đã hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền để điều tra vai trò của các gen mong muốn. Gen stuA là gen chủ chốt của quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, hình thành bào tử, hình thành sợi, trao đổi chất bậc một và trao đổi chất bậc hai. Vai trò của gen stuA đã được nghiên cứu ở nhiều nấm sợi khác như Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum… Tuy nhiên, vai trò của gen này ở A.

niger vẫn chưa được điều tra. Do đó, đề tài luận văn với tiêu đề: ―Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens‖ được xây dựng và thực hiện với những nội dung chính như sau: - Xóa gen stuA ở A. niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và marker chọn lọc là gen kháng kháng sinh hoặc gen trợ dưỡng uridine/uracil.

- Phục hồi sự biểu hiện của gen stuA ở chủng A. niger đột biến đã xóa gen stuA. - Điều tra, so sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng A. niger xóa gen stuA so với chủng nấm gốc và chủng phục hồi.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Chƣơng 1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger 1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A. niger Chi Aspergillus là một chi nấm sợi gồm hàng trăm loài phân bố ở các điều kiện khí hậu khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm một số tác nhân gây bệnh cơ hội (A.

terreus), sản xuất độc tố (A. parasiticus) và các loài được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, trong đó nổi bật hơn cả là A. Năm 1867, lần đầu tiên A.

niger được mô tả bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem trong bản thảo ―Physiologie des mucédinées”. Khi đó, ông phân lập được Aspergillus sp. có bào tử tương tự như Aspergillus glaucus nhưng có màu đen trên các môi trường khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác. Ông đã đặt tên cho loài nấm này là A.

niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm Nigri hay tên gọi khác là phân nhóm Aspergillus đen [45]. niger phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, nó có thể được phân lập trên tất cả các châu lục và không có sự chọn lọc nào với điều kiện môi trường, chúng sinh trưởng một cách tự nhiên trên vật chất hữu cơ [92]. Loài nấm này phát triển mạnh trong đất và rác, phân compost và nguyên liệu thực vật đang phân rã, thậm chí có thể được tìm thấy trong môi trường băng giá và môi trường biển. niger là vi sinh vật hiếu khí, sinh trưởng và phát triển khi có mặt oxy.

Chúng có thể sinh trưởng ở các điều kiện môi trường đa dạng từ nhiệt độ đến pH. niger phát triển ở nhiệt độ từ 6 - 47°C, tối ưu ở khoảng 35 - 37°C. Nó có thể sống sót ở 60°C nhưng sẽ bị loại bỏ ở 63°C trong vòng 25’. Khoảng pH cho phép A.

niger sinh trưởng rất rộng, từ 1,5 - 9,8 và tối ưu nhất là ở pH = 6 [7, 41, 57]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Hình 1. Hình thái nấm sợi A. niger trên đĩa và dưới kính hiển vi [43, 120] (A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, (B) Mép ngoài khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử.

(E) Bào tử của nấm sợi A. niger dưới kính hiển vi. Thanh tỉ lệ = 10 µm Ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của A. niger tăng khoảng 0,25 mm trong vòng 1 giờ với điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng.

Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy rằng vùng mép ngoài của khuẩn lạc A. niger 7 ngày tuổi chỉ gồm một lớp sợi nấm duy nhất. Một vài milimet phía trong vùng ngoại vi thì hệ sợi dày hơn và có thể lên đến sáu lớp sợi nấm chồng lên nhau. Sáu lớp sợi nấm này chia thành 3 lớp riêng biệt: lớp trên cùng, lớp dưới cùng và các lớp ở giữa gồm mạng lưới hệ sợi mỏng và dày.

Cấu trúc hệ sợi với ba lớp riêng biệt cũng được quan sát thấy ở trung tâm của khuẩn lạc [47]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Hình 1. Quá trình phát triển của A. niger được theo dõi dưới kính hiển vi điện tử quét [47] (A) Sợi nấm khí sinh tương tự với sợi nấm sinh dưỡng.

(C, D) Đỉnh sợi khí sinh phồng lên để tạo thành bọng bào tử. (E) Các chồi hình thành trên các bọng bào tử. (F, G) Chồi phát triển thành thể bình sơ cấp. (H) Thể bình thứ cấp hình thành trên đỉnh của thể bình thứ cấp.

(I, J) Các chuỗi bào tử được tạo thành trên thể bình thứ cấp. Thanh tỷ lệ từ hình A-F tương tự như hình G Sau thời kì tăng trưởng sinh dưỡng, A. niger tạo thành hai loại sợi nấm khí sinh. Một loại khá giống với sợi nấm sinh dưỡng và có đường kính khoảng 2 - 3 µm, loại còn lại có đường kính khoảng 6 - 7 µm.

Các sợi nấm khí sinh đường kính 2 - 3 µm của được hình thành sau khi cấy bào tử trên môi trường đầy đủ khoảng 8 giờ. Mặc dù thời gian hình thành sợi nấm khí sinh dường như không phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy nhưng mật độ của chúng trên môi trường tối thiểu thấp hơn so 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc với môi trường đầy đủ. Sự hình thành của hệ sợi khí sinh bắt đầu ở trung tâm khuẩn lạc, di chuyển ra ngoài và dừng lại khi cách mép hệ sợi nấm vài milimet. Điều này có nghĩa rằng khả năng hệ sợi hình thành hệ sợi khí sinh sẽ nhanh hơn khi khuẩn lạc già hơn [4].

Quá trình sinh trưởng khí sinh đã được đề xuất là liên quan đến tín hiệu mật độ tế bào của sợi nấm sinh dưỡng [112, 114]. Phân tử tín hiệu sẽ cảm ứng gen kị nước. Những gen này mã hóa protein làm giảm sức căng bề mặt nước để cho phép sợi nấm xuyên qua mặt phân cách để phát triển trong không khí và làm cho các cấu trúc như cấu trúc sinh bào tử và bào tử có tính kị nước. Tính kị nước này đảm bảo rằng cấu trúc sinh sản không rơi trở lại cơ chất trong điều kiện ẩm ướt và giúp bào tử phân tán bằng gió hoặc vector.

Tuy nhiên, những protein kị nước nào được tiết vào môi trường nuôi cấy để làm giảm sức căng bề mặt vẫn chưa được biết đến [111, 113]. niger cũng như phần lớn các loài thuộc chi Aspergillus được biết mới chỉ có hình thức sinh sản vô tính với cấu trúc sinh bào tử khá đặc trưng [5]. Cấu trúc sinh bào tử được biệt hóa từ cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử đầu tiên của A.

niger hình thành sau 10 giờ và cấu trúc sinh bào tử hình thành sau 20 giờ nuôi cấy ở 30°C. Khi cuống sinh bào tử đạt đến chiều cao tối đa của nó, phần đỉnh sợi sẽ phồng lên và hình thành bọng bào tử có đường kính 10 μm. Trên các bọng bào tử này sẽ hình thành các chồi, từ đó phát triển thành thể bình. Thể bình gồm hai lớp, lớp thể bình sơ cấp hình tam giác cân ngược, lớp thể bình thứ cấp hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 µm [27].

Các chuỗi bào tử đính được tạo thành trên thể bình thứ cấp và có tới hơn 10000 bào tử có thể được tạo ra từ một cấu trúc sinh bào tử [47]. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. niger Kích thước hệ gen của A. niger ước tính vào khoảng từ 35,5 - 38,5 megabase (Mb) gồm tám nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau, dao động từ 3,5 - 6,6 Mb.

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Năm 2007, trình tự toàn bộ hệ gen của chủng A.88 đã được công bố và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại http://www. So sánh các nhóm protein chức năng ở A. niger với một số loài nấm khác [79]. Sce, Saccharomyces cerevisiae; Mgi, Magnaporthe grisea; Ncr, Neurospora crassa; Sno, Stagonospora nodulum; Ani, Aspergillus nidulans; Afu, Aspergillus fumigatus; Aor, Aspergillus oryzae; Ang, Aspergillus niger.

Chuyển hóa (01): chuyển hóa cacbon và hợp chất carbohydrate (01.05), chuyển hóa lipit, axit béo và isoprenoid (01.06), chuyển hóa thứ cấp (01. Vận chuyển nội bào (08): vận chuyển bằng bóng bào (08.07), vận chuyển ngoại bào, xuất bào và quá trình tiết (08. Số phận protein (06): quá trình tiết protein và số phận (06.04) và vận chuyển nội bào (06. Độ dài của các thanh tỷ lệ thuận với số lượng gen trong mỗi nhóm.