MỞ ĐẦU Aspergillus là chi nấm sợi phổ biến trong tự nhiên và có vai trò quan trọng trong sản xuất thực tiễn. Một số loài nấm thuộc chi này đã đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (Generally Regarded as Safe, GRAS) dùng trong sản xuất công nghiệp nhƣ A. sojae, … Trong đó, hai loài A. oryzae với khả năng tiết mạnh enzyme vào môi trƣờng nuôi cấy nên đã đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất nhiều loại enzyme thƣơng mại cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp.
Gần đây, hệ gen của A. oryzae đã đƣợc giải trình tự hoàn toàn và là tiền đề cho cải biến di truyền nâng cao hiệu suất biểu hiện các gen mong muốn ở hai loài nấm này. Hiện nay, hai phƣơng pháp chuyển gen phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phƣơng pháp chuyển gen bằng tế bào trần là khá phức tạp với chi phí cao và hiệu quả không ổn định ở những lần lặp lại.
Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT) lần đầu tiên đƣợc áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều ƣu điểm nhƣ dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu suất ổn định. Tuy nhiên, phƣơng pháp chuyển gen ATMT vẫn chủ yếu sử dụng các gen kháng kháng sinh nên khó áp dụng vào điều kiện sản xuất thực tế vì nguy cơ phát tán gen kháng thuốc vào môi trƣờng. Chính vì vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dƣỡng (marker trợ dƣỡng) là hƣớng tiếp cận an toàn, hiệu quả về chi phí và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cao cho nấm sợi Aspergillus sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens và marker trợ dƣỡng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gene ở nấm sợi Aspergillus bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với những nội dung chính nhƣ sau: 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Tạo chủng A. niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG. - Tạo một số vector nhị thể dùng để chuyển gen và biểu hiện gen ở cả hai loài nấm sợi A.
- Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu cho nấm sợi A. niger sử dụng chủng trợ dƣỡng uridine/uracil và marker trợ dƣỡng pyrG. - Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng gen chỉ thị huỳnh quang đỏ DsRed. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1.
Tổng quan về nấm sợi 1. Đặc điểm sinh học Nấm sợi (nấm mốc) là những vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng tiết enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong môi trƣờng. Chúng phân bố rộng khắp trên trái đất và đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên cũng nhƣ trong đời sống của con ngƣời. Nấm thƣờng sinh trƣởng trên các bề mặt cơ chất tạo thành các dạng sợi nhƣ lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông đƣợc gọi là hệ sợi [23].
Hình thái của một số loài nấm mốc điển hình. (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100] Từ một bào tử nảy mầm, sợi nấm sẽ phát triển và phân nhánh hình thành nên khuẩn lạc nấm. Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trƣởng ở đỉnh sợi và phân nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì nhƣ bông. Hệ sợi nấm cũng có thể phát triển từ một đoạn sợi nấm sinh dƣỡng.
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt. Tuy nhiên, ở một số loài, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc đặc trƣng hoặc hệ sợi tiết ra sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển. Một số loài có hiện tƣợng tiết ra các hợp chất hữu cơ tạo nên những tinh thể trên bề mặt hệ sợi 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, đƣợc bao phủ bởi một lớp thành cứng, bên trong chứa nguyên sinh chất có khả năng di chuyển.
Chiều dài của sợi nấm thƣờng không xác định, nhƣng đƣờng kính ống sợi tƣơng đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy thuộc vào loài và điều kiện sinh trƣởng. Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa ra xung quanh, phủ trên bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên các khuẩn lạc nấm dạng tròn, đồng thời ăn sâu vào trong cơ chất [35]. Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trƣởng. Tuy nhiên, ở một số loài, ánh sáng lại là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành bào tử.
Nấm sợi có khoảng giới hạn nhiệt độ tƣơng đối rộng. Giới hạn dƣới của một số loài nấm sợi là từ 2oC - 5oC, giới hạn trên là từ 47oC - 53oC. Một số loài nấm có thể sống sót dƣới điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt ở 0oC và 60oC. Khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của nấm sợi là từ 22oC - 37oC.
Nhìn chung, các loài nấm sợi có thể phát triển trong môi trƣờng axit. Một số loài phát triển tốt ở môi trƣờng pH nhỏ hơn 3, một số ít loài phát triển đƣợc ở điều kiện pH lớn hơn 9, nhƣng hầu hết các loài nấm sợi phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 5 - 6,5. Vì là nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc nên ôxi là yếu tố không thể thiếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi [23, 35]. Nấm sợi có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính bao gồm sinh sản sinh dƣỡng bằng đoạn sợi nấm và sinh sản bằng hình thành bào tử đính (conidia). Quá trình sinh sản hữu tính ở một số loài với sự tham gia của giao tử đực và giao tử cái trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân, dung hợp tế bào chất và quá trình giảm phân để hình thành bào tử đơn bội [3, 35]. Ngoài ra, ở một số loài nấm sợi còn có hình thức sinh sản cận hữu tính (parasexual). Năm 1956, hình thức sinh sản này lần đầu tiên đƣợc mô tả bởi nhà di truyền học ngƣời Ý Guido Pontecorvo trong các nghiên cứu về Aspergillus nidulans.
Chu trình sinh sản cận hữu tính này đƣợc bắt đầu khi một nhân đơn bội dung hợp vào tế bào sinh dƣỡng của hệ sợi sau đó tiếp tục phân chia. Trong chu trình sinh sản cận hữu tính có thể xảy ra trao đổi chéo giữa các vùng tƣơng đồng trên nhiễm sắc thể (NST). 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đặc điểm này đƣợc sử dụng để lập bản đồ gen hoặc gắn thêm những gen mới vào trong các nhóm gen liên kết của loài [18]. Vai trò của nấm sợi Nấm sợi có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên và đời sống của con ngƣời.
Nhờ khả năng sinh trƣởng tốt trên cả những môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng và khả năng tổng hợp những hợp chất hữu cơ quan trọng, nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp. Các sản phẩm tạo ra từ nấm sợi vô cùng phong phú, từ axit hữu cơ đến các enzyme hay các chất chuyển hóa phức tạp đƣợc ứng dụng nhiều mặt trong cuộc sống. Nấm sợi đƣợc coi là các nhà máy tế bào lý tƣởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme. Khoảng 40% enzyme thƣơng mại trên thị trƣờng có nguồn gốc từ nấm sợi.
Chúng đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp then chốt nhƣ công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15]. Phần lớn các enzyme này đƣợc sản xuất từ các loài thuộc chi Aspergillus và Trichoderma bởi chúng có khả năng tiết một lƣợng lớn enzyme, protein vào môi trƣờng. Nhiều loài nấm mốc đã đƣợc công nhận là an toàn tiêu biểu nhƣ A. Ngoài các enzyme, nấm sợi còn đƣợc dùng làm nhà máy sản xuất các axit hữu cơ.
Các axit hữu cơ chủ yếu đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm sợi là axit citric, axit gluconic, axit itaconic với sản lƣợng hàng nghìn tấn mỗi năm. Các axit này đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may và y dƣợc [15]. Trong các hệ sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ và không thể thiếu trong các chu trình chuyển hóa vật chất. Ngoài ra, nấm còn đƣợc sử dụng làm sinh vật mô hình trong di truyền học, hóa sinh học và nhiều lĩnh vực khác.
Bên cạnh đó, cũng có một số loài nấm gây hại nhƣ Aspergillus fumigatus gây bệnh cơ hội ở ngƣời, Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay một số loại nấm sợi gây hỏng rau quả sau thu hoạch và gây bệnh cây trồng [14]. Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus Aspergillus là một chi nấm sợi phổ biến phân bố trên toàn cầu. Hiện Aspergillus có khoảng trên 250 loài với các đại diện tiêu biểu nhƣ A. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30]. Các loài trong chi Aspergillus có mức độ tƣơng đồng cao về hình thái nên khó để phân biệt một cách chính xác và đều có khả năng sinh sản vô tính bằng hình thành bào tử. Bào tử Aspergillus nhẹ, xốp có khả năng phát tán dễ dàng trong không khí. Khi gặp bề mặt chất rắn hoặc lỏng, chúng đƣợc giữ lại và sẽ nảy mầm khi gặp điều kiện phù hợp.
Chính khả năng này khiến chúng phân bố rộng khắp trên thế giới [14]. Hai đại diện tiêu biểu của chi Aspergillus là A. oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất tƣơng, soyu, rƣợu sake ở các nƣớc Châu Á, đặc biệt là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippine và Việt Nam. niger đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất axit citric phục vụ cho các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, đồ uống, y dƣợc, dệt may với sản lƣợng 1,6 triệu tấn mỗi năm.
niger cũng đƣợc sử dụng để khai thác enzyme protease, amylase, phytase và một số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp quan trọng khác [14, 15]. Các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus rất phù hợp cho các nghiên cứu về kiểm soát biểu hiện gen và quá trình tiết protein ở tế bào sinh vật nhân thực do có thể dễ dàng phân lập và tạo ra các chủng đột biến [16]. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae 1.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A. oryzae Aspergillus oryzae hay còn có tên gọi khác là nấm Koji.
Đây là loài nấm phổ biến của chi Aspergillus đƣợc sử dụng lâu đời trong ngành công nghiệp lên men ở các nƣớc châu Á tiêu biểu là Nhật và Trung Quốc. Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus trong họ Trichocomaceae.