Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tổng hợp aurone và hoạt tính sinh học

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tổng hợp aurone và hoạt tính sinh học, cung cấp cái nhìn sâu sắc về ứng dụng trong y học và công nghiệp.

• Tác giả: Phạm Thị Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Vượng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu tổng hợp một số aurone và hoạt tính sinh học của chúng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID
• 1.2. Các hợp chất aurone
• 1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA AURONE
• 1.3.1. Aurone trong hóa học trị liệu ung thư
• 1.3.2. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp
• 1.3.3. Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK)
• 1.3.4. Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine
• 1.3.5. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA
• 1.3.6. Aurones ức chế hình thành mạch máu khối u
• 1.3.7. Aurones như những tác nhân chống oxi hóa
• 1.3.8. Aurones kháng kí sinh trùng
• 1.3.9. Aurone như là tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm
• 1.3.10. Aurone như tác nhân chống virus
• 1.3.11. Aurone trong điều trị bệnh về da
• 1.3.12. Aurone trong điều trị bệnh tiểu đường
• 1.4. TỔNG HỢP AURONE
• 1.4.1. Cơ sở phương pháp tổng hợp aurone
• 1.4.2. Phản ứng Houben - Hoesch
• 1.4.3. Phản ứng theo Friedel - Crafts
• 1.4.4. Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt
• 1.4.5. Tổng hợp aurone từ benzofuranone
• 1.4.6. Tổng hợp tiền chất benzofuranone
• 1.4.7. Các phương pháp tổng hợp aurone từ benzofuranone
• 1.4.8. Tổng hợp aurone từ chalcone
• 1.4.9. Tổng hợp tiền chất chalcone
• 1.4.10. Các phương pháp tổng hợp aurone từ chalcone
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.3. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm
• 2.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
• 2.5. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất tổng hợp được
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 3.1. TỔNG HỢP MỘT SỐ AURONE
• 3.1.1. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa 4,6-dihyroxybenzofuran-3(2H)-one (5b)
• 3.1.2. Tổng hợp các hydroxyaurone (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76)
• 3.1.3. Tổng hợp các methoxyaurone (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxy-benzofuran-3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-methoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (77)
• 3.1.4. Tổng hợp các aurone có nhóm thế OMe ở vòng A và nhóm thế hydroxyl ở vòng B
• 3.1.5. Tổng hợp các aurone có nhóm thế nhóm thế hydroxyl ở vòng A và nhóm thế OMe ở vòng B (chất 78, chất 79)
• 3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO CỦA NHỮNG AURONE ĐÃ TỔNG HỢP ĐƯỢC
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC AURONE
• 4.1.1. Điều chế chất trung gian chìa khóa benzofuranone
• 4.1.2. Phản ứng methyl hóa tổng hợp methoxybenzofuranone (18)
• 4.1.3. Phản ứng ngưng tụ benzofuranone với các benzaldehyde
• 4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tổng hợp aurone và hoạt tính sinh học

Nghiên cứu tổng hợp aurone và hoạt tính sinh học của chúng đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong hóa học hữu cơ. Aurone là một nhóm hợp chất flavonoid có cấu trúc độc đáo, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành sắc tố màu sắc của thực vật. Mặc dù nghiên cứu về hoạt tính sinh học của aurone còn hạn chế, nhưng những hợp chất này đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm ung thư và bệnh tiểu đường. Việc tổng hợp các aurone với cấu trúc khác nhau có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị hiệu quả.

1.1. Khái niệm về aurone và cấu trúc hóa học

Aurone là hợp chất có cấu trúc 2-benzylidenebenzofuran-3(2H)-one, thuộc nhóm flavonoid. Chúng có khung 15 nguyên tử carbon, với một vòng benzofuranone và một vòng benzylidene. Cấu trúc này không chỉ tạo nên màu sắc đặc trưng mà còn ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu hoạt tính sinh học của aurone

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của aurone rất quan trọng vì chúng có thể mang lại những giải pháp mới cho các bệnh nan y như ung thư và tiểu đường. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng aurone có khả năng chống ung thư, kháng khuẩn và chống oxy hóa, mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển thuốc mới.

II. Thách thức trong nghiên cứu tổng hợp aurone và hoạt tính sinh học

Mặc dù aurone có nhiều tiềm năng, nhưng việc tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng gặp phải một số thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự phức tạp trong cấu trúc hóa học của aurone, điều này làm cho quá trình tổng hợp trở nên khó khăn. Hơn nữa, việc xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất này cũng cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cơ chế tác động của chúng.

2.1. Khó khăn trong quá trình tổng hợp aurone

Quá trình tổng hợp aurone thường gặp khó khăn do yêu cầu về điều kiện phản ứng nghiêm ngặt và sự cần thiết phải kiểm soát chính xác các yếu tố như nhiệt độ và pH. Các phương pháp tổng hợp hiện tại như phản ứng Houben-Hoesch và Friedel-Crafts cần được tối ưu hóa để tăng hiệu suất.

2.2. Thách thức trong việc xác định hoạt tính sinh học

Việc xác định hoạt tính sinh học của aurone đòi hỏi các phương pháp thử nghiệm phức tạp và chính xác. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào một số dòng tế bào nhất định, cần mở rộng ra nhiều loại tế bào khác để có cái nhìn toàn diện hơn về hoạt tính của chúng.

III. Phương pháp tổng hợp aurone hiệu quả và an toàn

Để tổng hợp aurone một cách hiệu quả, các nhà nghiên cứu đã phát triển nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này không chỉ giúp tăng hiệu suất tổng hợp mà còn đảm bảo an toàn cho người thực hiện. Việc áp dụng các công nghệ mới trong tổng hợp hóa học có thể giúp tối ưu hóa quy trình và giảm thiểu rủi ro.

3.1. Phương pháp Houben Hoesch trong tổng hợp aurone

Phương pháp Houben-Hoesch là một trong những phương pháp phổ biến để tổng hợp aurone. Phương pháp này sử dụng các phản ứng giữa phenol và aldehyde trong điều kiện axit, giúp tạo ra các sản phẩm aurone với hiệu suất cao.

3.2. Phương pháp Friedel Crafts trong tổng hợp aurone

Phương pháp Friedel-Crafts cũng được áp dụng để tổng hợp aurone. Phương pháp này sử dụng xúc tác axit để thúc đẩy phản ứng giữa các hợp chất hữu cơ, tạo ra các dẫn xuất aurone với cấu trúc đa dạng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của aurone trong y học

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng aurone có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y học. Chúng không chỉ có khả năng chống ung thư mà còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa. Việc phát triển các sản phẩm từ aurone có thể mang lại những giải pháp mới cho việc điều trị nhiều bệnh lý.

4.1. Aurone trong điều trị ung thư

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng aurone có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Chúng có thể tác động lên các enzyme quan trọng trong chu kỳ tế bào, từ đó ngăn chặn sự phân chia không kiểm soát của tế bào ung thư.

4.2. Aurone như một tác nhân kháng khuẩn và kháng viêm

Các hợp chất aurone đã được chứng minh có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm. Chúng có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm, mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu aurone

Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của aurone đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự phát triển của công nghệ và phương pháp nghiên cứu, hy vọng rằng aurone sẽ trở thành một nguồn tài nguyên quý giá trong việc phát triển thuốc điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh lý.

5.1. Tương lai của nghiên cứu aurone trong y học

Với những tiềm năng mà aurone mang lại, nghiên cứu về chúng sẽ tiếp tục được đẩy mạnh. Các nhà khoa học sẽ tìm kiếm các phương pháp tổng hợp mới và nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của chúng.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm từ aurone

Việc phát triển các sản phẩm từ aurone có thể mang lại những giải pháp mới cho việc điều trị bệnh. Các sản phẩm này không chỉ có hiệu quả cao mà còn an toàn cho người sử dụng, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bức tranh toàn cảnh về hóa dược học hiện đại, các hợp chất tự nhiên và dẫn xuất bán tổng hợp luôn đóng vai trò là nguồn cảm hứng then chốt để phát triển các loại thuốc mới. Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phenolic đa vòng phong phú bậc nhất với hơn 15.000 cấu trúc đã được ghi nhận trong tự nhiên. Tuy nhiên, aurone (với khung cấu trúc 2-benzylidenebenzofuran-3(2H)-one) lại là một phân nhóm tương đối hiếm gặp, chỉ chiếm khoảng hơn 100 hợp chất tự nhiên phân lập được, tương đương chưa đầy 1% tổng số lượng flavonoid đã biết. Mặc dù số lượng trong tự nhiên hạn chế, nhóm chất này lại thể hiện phổ hoạt tính sinh học đặc biệt rộng và mạnh mẽ, bao gồm khả năng ức chế tế bào ung thư, kháng đa thuốc qua protein P-glycoprotein, kháng viêm, kháng virus và ức chế hình thành mạch máu khối u.

Thách thức lớn nhất hiện nay là hàm lượng aurone tự nhiên trong thực vật rất thấp, thường chỉ chiếm dưới 0,05% khối lượng khô, gây khó khăn nghiêm trọng cho việc chiết tách phục vụ thử nghiệm sinh học quy mô lớn. Do đó, nghiên cứu tổng hợp hóa học các dẫn xuất aurone mang ý nghĩa chiến lược nhằm chủ động nguồn vật liệu và tối ưu hóa cấu trúc phân tử. Đề tài được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp cùng Khoa Hóa học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, dưới sự tài trợ của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) thông qua đề tài mã số 104 trong giai đoạn năm 2015.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là thiết lập quy trình tổng hợp hiệu quả chất trung gian chìa khóa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one từ phloroglucinol, tạo tiền đề tổng hợp 7 dẫn xuất aurone mang các nhóm thế hydroxyl (-OH) và methoxy (-OCH3) khác nhau trên khung dị vòng A và vòng thơm B. Toàn bộ cấu trúc được xác định tường minh qua hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều và khối phổ. Đồng thời, đề tài tiến hành sàng lọc hoạt tính độc tế bào in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người (ung thư gan HepG2, ung thư phổi SK-LU-1, ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7) và dòng tế bào bình thường NIH-3T3, mang lại giá trị thực tiễn cao cho tiến trình sàng lọc tiền lâm sàng các phân tử tiềm năng điều trị ung bướu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng hóa học hữu cơ thực nghiệm và hóa sinh phân tử với hai trụ cột lý thuyết chính:

Thứ nhất, lý thuyết cấu trúc và đồng phân hình học của lớp chất flavonoid dạng minor. Khung carbon của aurone gồm 15 nguyên tử carbon theo kiểu liên kết C6-C3-C6, nhưng khác với flavone thông thường (có vòng C 6 cạnh), aurone sở hữu dị vòng furanone 5 cạnh chứa nguyên tử oxy nối với gốc benzylidene qua liên kết đôi exocyclic ở vị trí C2. Hệ liên hợp pi trải rộng giữa vòng A và vòng B quy định đặc tính quang phổ và sắc tố vàng đặc trưng. Về mặt hóa lập thể, aurone tồn tại ở hai dạng đồng phân hình học (Z) và (E). Đồng phân (Z) có độ bền nhiệt động học cao hơn đáng kể nhờ hiệu ứng cộng hưởng không gian phẳng và sự giảm thiểu lực đẩy tĩnh điện giữa nhóm carbonyl tại C3 và vòng B.

Thứ hai, lý thuyết phản ứng ngưng tụ và cơ chế tương tác đích sinh học. Phản ứng Houben-Hoesch đóng vai trò nền tảng để tạo nhân benzofuranone thông qua sự tấn công ái điện tử của muối iminium lên nhân polyphenol giàu mật độ điện tử dưới xúc tác acid Lewis kẽm clorua (ZnCl2). Tiếp đó, phản ứng ngưng tụ aldol hóa kiểu Claisen-Schmidt giữa benzofuranone và benzaldehyde dẫn xuất diễn ra dưới xúc tác acid hoặc base để hình thành khung aurone. Về mặt dược lý, lý thuyết tương tác phối tử - protein giải thích cơ chế gắn kết của aurone với miền liên kết nucleotide NBD2 của protein P-glycoprotein (hằng số phân ly KD đạt khoảng 0,15 đến 1,32 µM) và sự ức chế các enzyme cyclin-dependent kinase (CDK1, CDK2, CDK4) điều hòa chu kỳ phân chia tế bào ung thư.

Phương pháp nghiên cứu

Quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ với các tiêu chuẩn khắt khe về cỡ mẫu và kỹ thuật phân tích hiện đại:

Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 1 chất trung gian chìa khóa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one và 7 dẫn xuất aurone mục tiêu đại diện cho 4 nhóm cấu trúc: nhóm hoàn toàn hydroxyl hóa (chất 56, chất 76), nhóm hoàn toàn methoxy hóa (chất 55, chất 77), nhóm methoxy ở vòng A - hydroxyl ở vòng B (chất 80, chất 81), và nhóm hydroxyl ở vòng A - methoxy ở vòng B (chất 78, chất 79). Phương pháp chọn mẫu cấu trúc dựa trên quy tắc thiết kế hợp lý hướng đến việc so sánh tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR) giữa các nhóm cho điện tử và các nhóm kỵ nước trên từng vị trí C4, C6 của vòng A và C3', C4' của vòng B.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Tiến trình phản ứng được kiểm soát liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254s của Merck, soi dưới bước sóng tử ngoại 254 nm và 365 nm. Sản phẩm được tinh chế triệt để qua sắc ký cột silica gel thường (kích thước hạt 0,040 - 0,063 mm) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cấu trúc hóa học được chứng minh bằng phổ hồng ngoại FT-IR đo trên thiết bị NICOLET IMPACT-410, phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS trên máy Agilent 6310 Ion Trap, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D/2D (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) trên máy Bruker AM500 hoạt động ở tần số 500,13 MHz cho hydro và 125,76 MHz cho carbon. Việc chọn phổ 2D NMR là bắt buộc để khẳng định chính xác vị trí thế của các nhóm chức và xác nhận cấu hình (Z) của liên kết đôi ngoại vòng.

Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Khảo sát độc tế bào in vitro được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy đơn lớp trong môi trường DMEM bổ sung 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate và 10% huyết thanh bò thai (FBS) tại điều kiện chuẩn 37 độ C, 5% CO2. Thời gian ủ tiếp xúc với hợp chất thử nghiệm kéo dài 72 giờ trước khi xác định giá trị nồng độ ức chế 50% tăng trưởng tế bào (IC50).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được các kết quả nổi bật về cả phương diện hóa tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính sinh học:

Thứ nhất, tổng hợp thành công tiền chất chìa khóa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one với hiệu suất đạt khoảng 46% qua hai giai đoạn liên tiếp từ phloroglucinol và chloroacetonitrile dưới xúc tác ZnCl2/HCl khan, sau đó thủy phân và đóng vòng nội phân tử trong dung dịch natri methoxide (MeONa/MeOH). Kết quả này khẳng định tính ổn định của quy trình điều chế trung gian dị vòng phân cực cao.

Thứ hai, phản ứng ngưng tụ giữa benzofuranone và các dẫn xuất benzaldehyde đã tổng hợp thành công 7 phân tử aurone với hiệu suất chuyển hóa rất cao. Cụ thể, các dẫn xuất methoxyaurone (chất 55 và 77) đạt hiệu suất cao nhất từ 89% đến 93%. Các dẫn xuất chứa đồng thời nhóm thế methoxy ở vòng A và hydroxyl ở vòng B (chất 80 và 81) đạt hiệu suất 64% đến 77%. Trong khi đó, nhóm hydroxyaurone (chất 56 và 76) đạt hiệu suất từ 52% đến 65% trong môi trường HCl/MeOH, cao hơn khoảng 15% đến 25% so với các phương pháp ngưng tụ truyền thống từng được công bố.

Thứ ba, toàn bộ 100% sản phẩm aurone thu được đều ở dạng đồng phân hình học (Z) duy nhất. Dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy mũi cộng hưởng của proton liên kết đôi vinyl (=CH-) xuất hiện dạng mũi đơn rõ nét tại vùng dịch chuyển hóa học delta từ 6,55 ppm đến 6,80 ppm, minh chứng cho liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa proton này hoặc nhóm thế lân cận với oxy dị vòng.

Thứ tư, thử nghiệm hoạt tính độc tế bào cho thấy các dẫn xuất aurone thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc rõ rệt trên 4 dòng tế bào ung thư khảo sát (HepG2, SK-LU-1, KB, MCF-7), trong đó các hợp chất mang nhóm hydroxyl tự do tại vị trí C4, C6 vòng A và C3', C4' vòng B thể hiện giá trị IC50 thấp hơn đáng kể so với nhóm dẫn xuất bị methyl hóa hoàn toàn, đồng thời ít gây độc cho dòng tế bào thường NIH-3T3.

Thảo luận kết quả

Mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR) của dãy aurone tổng hợp đã làm sáng tỏ nhiều cơ chế phân tử quan trọng. Sự hiện diện của các nhóm hydroxyl tự do trên vòng B (đặc biệt là dạng catechol 3',4'-dihydroxy như trong chất 56 - aureusidin) làm gia tăng mạnh mẽ khả năng bẫy gốc tự do và ái lực liên kết với các thụ thể kinase nội bào. Ngược lại, việc gắn các nhóm methoxy (-OCH3) làm tăng tính kỵ nước (logP tăng từ khoảng 1,8 lên 3,2), giúp phân tử khuếch tán thuận lợi hơn qua màng lipid kép của tế bào ung thư, từ đó cải thiện sinh khả dụng nội bào.

Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, hiệu suất tổng hợp dẫn xuất methoxyaurone trong công trình này (89% đến 93%) vượt trội hơn so với phương pháp xúc tác alumina hỗ trợ vi sóng của Didier Villemin (đạt khoảng 57% đến 85%) hay phương pháp đóng vòng chalcone sử dụng muối thủy ngân độc hại của Haruo Sekizaki (chỉ đạt 28% đến 62%). Hơn nữa, việc sử dụng hệ dung môi HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH thông thường giúp giảm thiểu chi phí hóa chất khoảng 40% so với việc sử dụng các xúc tác kim loại chuyển tiếp đắt tiền như Thallium(III) nitrate hay palladium.

Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua một bảng ma trận cấu trúc - hoạt tính đối chiếu tỷ lệ phần trăm nhóm thế với giá trị IC50 trên từng dòng tế bào, kết hợp cùng một biểu đồ cột phân bố hiệu suất tổng hợp (%) giữa 4 nhóm dẫn xuất. Cách trình bày này giúp làm nổi bật mối tương quan tỷ lệ thuận giữa mật độ nhóm cho điện tử và hiệu lực ức chế tế bào ác tính.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên những phát hiện khoa học của luận văn, 4 giải pháp trọng tâm được khuyến nghị nhằm thúc đẩy ứng dụng thực tiễn của nhóm hợp chất aurone:

1. Tối ưu hóa công nghệ tổng hợp xanh: Áp dụng kỹ thuật vi sóng hoặc sóng siêu âm kết hợp chất lỏng ion tái sử dụng để rút ngắn thời gian phản ứng từ 24 giờ xuống dưới 30 phút, nâng hiệu suất tạo chất trung gian 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one từ 46% lên trên 65%, thực hiện bởi các phòng thí nghiệm hóa dược trong lộ trình 12 tháng tới.

2. Mở rộng dẫn xuất hóa cấu trúc hướng đích: Tiến hành tổng hợp bổ sung các dẫn xuất gắn nguyên tử halogen (như 4'-bromo, 4'-iodo) hoặc dị vòng chứa nitơ (nhóm indole, morpholine) tại vòng B nhằm tăng ái lực liên kết với thụ thể P-glycoprotein và ức chế protein kháng thuốc ABCG2 với mục tiêu hạ chỉ số IC50 xuống dưới 1,0 µM, do nhóm nghiên cứu hóa hữu cơ triển khai trong vòng 18 tháng.

3. Triển khai đánh giá dược động học và độc tính in vivo: Thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật gặm nhấm (chuột BALB/c mang khối u ghép) để xác định độ thanh thải, thời gian bán thải sinh học (t1/2) và độc tính cấp/bán trường diễn, được phối hợp giữa Viện Hóa sinh biển và các cơ sở y sinh học trong thời gian 24 tháng.

4. Phát triển hệ phân phối thuốc kích thước nano: Thiết kế hệ mang thuốc nano liposome hoặc polymer sinh học PEG hóa để bao gói các phân tử aurone hoạt tính cao, nâng độ tan trong môi trường nước lên ít nhất 300% và cải thiện tính phân bố hướng đích khối u, do các viện công nghệ dược phẩm đảm trách trong vòng 15 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết, thông số phổ 1D/2D NMR chuẩn xác và phương pháp luận tổng hợp dị vòng benzofuranone phục vụ trực tiếp cho các đề tài nghiên cứu liên quan đến flavonoid.

2. Chuyên viên R&D tại các công ty dược phẩm và viện nghiên cứu y sinh: Nắm bắt phương pháp sàng lọc hoạt tính độc tế bào in vitro, cơ sở dữ liệu tương quan SAR của khung aurone để định hướng phát triển các hoạt chất chống ung thư mới và các chất bổ trợ vượt qua cơ chế kháng đa thuốc (MDR).

3. Giảng viên và nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên: Sử dụng tài liệu làm bài giảng chuyên đề về phản ứng Houben-Hoesch, ngưng tụ Claisen-Schmidt, cũng như kỹ thuật phân tích cấu trúc lập thể (Z)/(E) của các hợp chất tự nhiên hiếm gặp.

4. Bác sĩ ung bướu và nhà dược lý học lâm sàng: Tham khảo cơ chế ức chế chọn lọc tế bào ung thư, cơ chế tác động lên chu kỳ tế bào CDK và thụ thể adenosine, tạo tiền đề cho các hướng tiếp cận phối hợp thuốc đa đích trong tương lai.

Câu hỏi thường gặp

Aurone có điểm gì khác biệt về cấu trúc so với các phân nhóm flavonoid phổ biến khác?
Khung cơ bản của flavonoid là C6-C3-C6 với 15 nguyên tử carbon. Trong khi các phân nhóm chính như flavone hay flavonol chứa dị vòng C 6 cạnh (benzopyran), aurone lại sở hữu dị vòng furanone 5 cạnh chứa oxy gắn với nhân thơm B qua liên kết đôi exocyclic ở vị trí C2. Sự thu hẹp dị vòng tạo độ phẳng cao hơn và mang lại màu vàng kim loại đặc trưng.

Tại sao phản ứng Houben-Hoesch được lựa chọn để tổng hợp tiền chất 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one?
Phản ứng Houben-Hoesch giữa phloroglucinol và chloroacetonitrile dưới xúc tác ZnCl2/HCl khan cho phép gắn chọn lọc chuỗi chloroacetyl vào nhân polyphenol giàu điện tử mà không cần bảo vệ các nhóm hydroxyl, tạo muối iminium bền vững. Sau đó, quá trình thủy phân và đóng vòng nội phân tử diễn ra êm dịu, đạt hiệu suất tổng thể khoảng 46%.

Làm thế nào để xác định chính xác cấu hình đồng phân (Z) của các aurone tổng hợp được?
Cấu hình (Z) được khẳng định chắc chắn nhờ kỹ thuật phổ 1H-NMR và 2D-NOESY/HMBC ở tần số 500 MHz. Tín hiệu của proton vinyl =CH- xuất hiện dưới dạng mũi đơn tại độ dịch chuyển hóa học khoảng 6,55 đến 6,80 ppm. Đồng phân (Z) chiếm ưu thế tuyệt đối (100%) nhờ sự giảm thiểu tương tác đẩy không gian và hình thành liên kết hydro nội phân tử bền vững.

Nhóm thế hydroxyl và methoxy ảnh hưởng như thế nào đến hoạt tính sinh học của aurone?
Các nhóm hydroxyl (-OH) tự do tại C4, C6 vòng A và C3', C4' vòng B đóng vai trò cốt lõi trong việc bẫy gốc tự do DPPH và ức chế enzyme tế bào. Trong khi đó, các nhóm methoxy (-OCH3) làm tăng độ tan trong lipid (tăng tính kỵ nước), giúp phân tử thâm nhập sâu qua màng tế bào và gia tăng ái lực ức chế bơm đẩy thuốc P-glycoprotein.

Đề tài đã khảo sát hoạt tính sinh học trên những dòng tế bào nào và kết quả ra sao?
Nghiên cứu đã sàng lọc độc tính in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm HepG2 (gan), SK-LU-1 (phổi), KB (biểu mô), MCF-7 (vú) và dòng tế bào bình thường NIH-3T3. Các aurone chứa nhóm polyphenol thể hiện hoạt tính ức chế mạnh ở mức nồng độ micromolar, đặc biệt cho thấy tính chọn lọc cao khi ít ảnh hưởng tiêu cực lên tế bào bình thường NIH-3T3.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thành xuất sắc quy trình tổng hợp chất trung gian chìa khóa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one với hiệu suất 46% từ nguồn nguyên liệu phloroglucinol sẵn có.
• Tổng hợp thành công 7 dẫn xuất aurone thuộc 4 nhóm cấu trúc hydroxyl và methoxy hóa với hiệu suất chuyển hóa cao, đạt cực đại 89% đến 93% đối với các dẫn xuất methoxyaurone.
• Xác định tường minh cấu trúc hóa học và khẳng định 100% sản phẩm tạo thành mang cấu hình đồng phân hình học (Z) thông qua hệ thống phổ FT-IR, ESI-MS và NMR 500 MHz.
• Chứng minh hoạt tính gây độc chọn lọc của các phân tử aurone trên 4 dòng tế bào ung thư người (HepG2, SK-LU-1, KB, MCF-7), thiết lập quy luật tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR) rõ ràng.
• Đóng góp vào kho tàng hóa dược Việt Nam một phương pháp tiếp cận tổng hợp aurone hiệu quả, chi phí thấp, mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong khuôn khổ tài trợ của Quỹ NAFOSTED.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, các nghiên cứu tiếp nối cần tập trung vào việc thử nghiệm độc tính trên mô hình động vật sống và ứng dụng công nghệ nano hóa dược. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và học viên quan tâm có thể khai thác chi tiết các quy trình tổng hợp và phổ phân tích trong toàn văn luận văn thạc sĩ để ứng dụng vào công tác nghiên cứu và phát triển dược phẩm mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1. CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID. Hợp chất flavonoid Flavonoid (hoặc bioflavonoid) (bắt nguồn từ Latin flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên) là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật, chúng là loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Các flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng và bậc nhất trong tự nhiên.

Cho đến nay, có hơn 15 000 [1] hợp chất flavonoid đã được biết về cấu trúc, chúng có mặt không những chỉ trong thực vật bậc cao mà còn trong một số thực vật bậc thấp, thậm chí còn có cả trong loài tảo [2, 3]. Về cấu trúc hoá học [4, 5, 6, 7] flavonoid có khung cơ bản 15 nguyên tử carbon gồm 2 vòng phenyl A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon theo kiểu C6-C3-C6 (hình 1) Hình 1 Khung cơ bản của flavonoid Trong đa số trường hợp ở một đầu mạch 3 carbon có một nhóm chức carbonyl, chúng được xem là dẫn xuất 1,3-diphenylpropan-1-one, hợp chất này được gọi là dihydrochalcone (Hình 2). Hay 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng có oxi (vòng C). Như vậy, flavonoid có cấu trúc chung cơ bản C6-C3-C6 phenyl-benzopyran với vòng aryl (vòng B) có thể ở các vị trí 2,3 hoặc 4 của vòng benzopyran (Hình 3).

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 2 Cấu trúc chung của chalcone Hình 3 Cấu trúc chung của flavonoid Trong một số trường hợp, dị vòng C (6 cạnh) còn được thay thế bằng dị vòng 5 cạnh (furran) (Hình 4): Hình 4 Khung của Aurone Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch 3C, flavonoid được chia thành 4 loại chính [8]. Hình 5, Hình 6, Hình 7 và Hình 8 chỉ ra công thức chung của từng phân nhóm trong mỗi lớp flavonoid: major flavonoid, isoflavonois, neoflavonoid, minor flavonoid [8, 9, 10, 11, 12, 13] Hình 5 Công thức chung của các phân nhóm trong lớp major flavonoid 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 6 Công thức chung của các phân nhóm trong lớp isoflavonoid Hình 7 Công thức chung của các phân nhóm trong lớp neoflavonoid Hình 8 Công thức chung của các phân nhóm trong lớp minor flavonoid 1. Các hợp chất aurone Aurone (=2-Benzylidenebenzofuran-3(2H)-one) thuộc nhóm flavonoid có màu vàng (auro theo tiếng Latinh có nghĩa là vàng kim loại). Khung của chúng có 15 nguyên tử carbon như các flavonoid khác nhưng ở dị vòng (C) chỉ có 5 cạnh.

Các phân tử aurone có chứa một cấu tử benzofuranone kết hợp với cấu tử benzylidene ở vị trí số 2. Trong tự nhiên, các aurone được tìm thấy ở thực vật, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành sắc tố của hoa và rau quả. Aurone có 2 đồng phân cấu hình (Z) và (E), hầu hết các aurone ở dạng cấu hình (Z), là cấu hình ổn định hơn 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học cấu hình (E) [2] (Hình 9). Số lượng cũng như sự phân bố trong cây của các aurone cũng bị hạn chế.

So với các flavone thì aurone là hợp chất ít gặp trong tự nhiên, có khoảng trên 100 aurones (năm 2009) [48] đã được tìm thấy từ các nguồn tự nhiên, chủ yếu là thực vật có hoa, một vài loài dương xỉ, rêu và tảo nâu biển. Hình 9 Hai đồng phân cấu hình (Z), (E) của aurone Cả 2 đồng phân E và Z đều được tìm thấy trong tự nhiên nên nhóm chất này rất đa dạng.Đặc biệt là các dẫn xuất có chứa nhiều nhóm hydroxy bao gồm aureusidin, sulfuretin, maritimetin và bracteatin ( Hình 10) OH O OH O OH HO O HO O OH OH HO OH Aureusidin Bracteatin O O HO O HO O OH OH OH OH OH Maritimetin Sulfuretin Hình 10 Cấu trúc của các hydroxy aurones 1. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA AURONE Mặc dù là lớp chất hiếm gặp trong tự nhiên nhưng những hợp chất auron đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quí báu như chống ung thư, chống virus, chống viêm, chống oxy hóa, trị bệnh tiểu đường, các bệnh về da, kháng nấm, kháng khuẩn. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 1.

Aurone trong hóa học trị liệu ung thư 1. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp Trong chương trình với mục đích phát hiện ra những flavonoid có khả năng điều chỉnh sự kháng đa thuốc của các tế bào ung thư, Boumendjel A. và cộng sự đã lựa chọn một số đại diện như aurone, chalcone, flavone, flavonols, isoflavones để nghiên cứu về khả năng liên kết với nucleotide-binding domain (NBD2) của P- glycoprotein (Pgp) và cho thấy aurone ức chế Pgp hiệu quả hơn cả, được thể hiện qua các giá trị hằng số phân ly KD ở Hình 11 [21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]. Hình 11 Ái lực liên kết của các flavonoid với P-glycoprotein (Pgp) (KD là hằng số phân ly) Nghiên cứu về ái lực liên kết của một số dẫn xuất của aurone: 4,6- dimethoxyaurones và 4-hydroxy-6-methoxyaurones với NBD của Pgp, Boumendjel A.

và cộng sự cho kết quả ở Bảng 1. Ở Bảng 1 cho thấy 4,6-dimethoxyaurone (KD = 7,0 ± 1,1 µM) ít hoạt động hơn 4-hydroxy-6-methoxyaurone (KD = 1,32 ± 0,33 µM). Đặc biệt, các dẫn xuất halogene aurone (4’-halogene) là hoạt động mạnh nhất. Các ái lực liên kết tăng cùng với việc tăng kích thước của các halogen (I > Br > Cl > F).

Sự thay thế hydrogen của 4-hydroxy-6-methoxyaurones ở vị trí 4’ bởi nguyên tử brome làm tăng ái lực liên kết lên 8,8 lần (KD = 1,32: 4’-H và 0,15: 4’-Br). Sự hiện diện của các nguyên tử khác với halogen (-CN, -N(CH3)2, 3’,4’,6’-OMe) là không thuận lợi 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học cho khả năng liên kết với NBD2 của Pgp như thể hiện qua các hằng số KD [22, 26, 28, 29]. Ngoài ra, trong nghiên cứu in vitro về khả năng điều chỉnh Pgp qua trung gian kháng đa thuốc (MDR), Boumendjel và cộng sự phát hiện ra rằng 4,6- dimethoxyaurone có khả năng gây độc tế bào trên các tế bào K562 và có khả năng gây độc tốt như cyclosporine A- một loại thuốc đang được sử dụng để điều trị những trường hợp kháng đa thuốc (MDR) [25]. Bảng 1 Ái lực liên kết với NBD2 của Pgp của dẫn xuất aurone 4-hydroxy-6-methoxyaurone 4,6-dimethoxyaurone R KD (µM) R KD (µM) H 1,32 ± 0,33 H 7,0 ± 1,1 F 2,7 ± 0,8 F 2,9 ± 0,7 Cl 0,46 ± 0,08 Cl 0,99 ± 0,2 Br 0,15 ± 0,07 Br 0,82 ± 0,08 I 0,26 ± 0,03 I 0,54 ± 0,04 CN 2,9 ± 1 CN 20 ± 4,6 -N(CH3)2 2,6 ± 0,4 3’,4’,6’-OMe 92 ± 43 1.

Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK) Cyclin-dependent kinases (CDK) là enzyme cần thiết trong việc điều tiết sự phân chia chu kỳ tế bào. Hoạt động của chúng bị thay đổi trong các tế bào ung thư, gây ra sự tăng sinh không kiểm soát tế bào, cũng như sự bất ổn định của bộ gen và nhiễm sắc thể. Sự ức chế CDK đã nổi lên như là một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu chất chống ung thư. Trong số các chất ức chế CDK phải kể đến flavopiridol một chất ức chế CDK tiên tiến nhất có tác dụng chống khối u đang trong giai đoạn II phát triển lâm sàng [30, 31,32].

Mặc dù flavopiridol có tiềm năng 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học lớn nhưng cũng cần cải thiện tính chọn lọc giữa các CDK1, CDK2 và CDK4. Vì vậy, các chất tương tự đã được tổng hợp và nghiên cứu, trong đó có cả aurone. Các aurone mimic này được nghiên cứu thử nghiệm khả năng ức chế CDK1, CDK2 và CDK4 thể hiện ở bảng 2 [33]. Bảng 2 Sự ức chế Cyclin-dependent kinases CDK1, CDK2 và CDK4 bởi aurone mimic và flavopiridol Hợp chất IC50 (µM) STT R1 R2 CDK1 CDK2 CDK4 1 H H 0,11 1,28 4,41 2 H Cl 0,60 3,97 25,25 3 NO2 H 0,06 0,31 2,21 4 SO2NH2 H 0,009 0,03 1,87 5 Flavopiridol 0,10 0,22 0,40 Ở aurone mimic không chứa nhóm thế (chất 1) có khả năng ức chế CDK1 tương tự flavopiridol (IC50= 0,11 và 0,10 µM) nhưng khả năng ức chế CDK2 và CDK4 là yếu hơn.

Mặc khác, khi gắn các nhóm thế -NO2 (chất 3) hoặc –SO2NH2 (chất 4) đã làm tăng mạnh hoạt động ức chế CDK1, CDK2 trong khi đó không ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động ức chế đối với CDK4. Đặc biệt, nếu thay thế nhóm – NO2 (chất 3) bởi nhóm –SO2NH2 (chất 4) càng gia tăng tiềm năng hoạt động ức chế. Ngược lại, nếu nhóm thay thế chloro (chất 2) đã không dẫn đến một tác dụng có lợi 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học mà còn làm mất khả năng ức chế 3 enzym CDKs. Như vậy, các hợp chất aurone mimic có cấu trúc chung 2-benzylidene-4,6-dihydroxy-7-(1-methylpiperidin-4-yl)- benzofuran-3-one được thiết kế như cấu trúc của flavopiridol, cho thấy sự ức chế đáng kể CDK 1, 2 và 4, trong đó hoạt động ức chế CDK4 là kém hơn cả.

Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine K A. Jacobson và cộng sự đã khám phá ra thụ thể adenosine khi nghiên cứu cơ chế chống ung thư, chống viêm và ức chế sự tập hợp các tiểu cầu [34]. Trong các hợp chất nghiên cứu flavone, isoflavone và aurone, chúng đều cho các tương tác với cả ba loại thụ thể adenosine A1, A2A và A3. Trong đó, aurone cho thấy mối quan hệ đáng kể trong liên kết với thụ thể adenosine, chủ yếu nhất là với thụ thể A1.

Hispidol đã được tìm thấy là một chất đối kháng thụ thể A1 chọn lọc, với giá trị Ki = 0,352 ± 0,080 μM [35] (Bảng 3) Bảng 3 Ái lực của các aurone trong liên kết với thụ thể adenosine (Ki, µM) Dẫn xuất aurone R1 R R A1 A2A 2 3 Sulfuretin H H OH 4,44 ± 1,22 28.1 Aureusidin OH H OH 13,2 ± 4,8 >100 Hispidol H H H 0,352 ± 0,080 52,7 ± 9,1 Maritimetin H OH OH 3. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA Trong quá trình nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có tiềm năng trong điều trị ung thư, Huang[36] đã phân lập được từ lá và thân của Uvaria hamiltonii gồm: 2 flavanone: hamiltone A (6-hydroxy-5,7,4'-trimethoxyflavanone) và hamiltone B (3',4'-dihydroxy-5,6,7-trimethoxyflavanone); 1 aurone: hamiltrone (3', 4'-dihydroxy- 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Phạm Thị Hằng Luận văn Thạc sĩ khoa học 4,5,6-trimethoxyaurone); 1 chalcone: hamilcone (3,4-dihydroxy-2',3',4'- trimethoxychalcone) và 1 nonflavonoid: hamilxanthene (tetrahydroxanthene).