Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu thu nhận levan từ bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuât thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1 14 ngày tuổi

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu thu nhận levan từ bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuât thức ăn chăn nuôi, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Lê Anh Tú
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Kim Dung
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về levan
• 1.1.1. Giới thiệu về levan
• 1.2. Nguồn thu nhận levan
• 1.3. Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan
• 1.4. Ứng dụng của levan
• 1.5. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh
• 1.5.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh
• 1.5.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
• 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3.1. Vi sinh vật
• 2.3.2. Môi trường
• 2.3.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và cs, 2019)
• 2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013)
• 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
• 2.4.4. Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi)
• 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp levan
• 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
• 3.1.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu
• 3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito
• 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ nito
• 3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp
• 3.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
• 3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan
• 3.3. Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
• 3.3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được
• 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng levan thu được
• 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được
• 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được
• 3.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi)
• 3.4.1. Xác định tỷ lệ levan phối trộn
• 3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về levan và Bacillus subtilis trong sản xuất thức ăn

Levan là một polysaccharide tự nhiên được tổng hợp từ vi khuẩn, đặc biệt là từ Bacillus subtilis. Hợp chất này có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất thức ăn cho gà cảnh. Việc nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis không chỉ giúp nâng cao chất lượng thức ăn mà còn cải thiện sức khỏe cho gà cảnh.

1.1. Levan Đặc điểm và ứng dụng trong ngành thực phẩm

Levan là một loại fructan có cấu trúc polymer của fructose. Nó được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như một chất nhũ hóa và ổn định. Nghiên cứu cho thấy levan có khả năng chống ung thư và hỗ trợ hệ miễn dịch.

1.2. Bacillus subtilis Nguồn thu nhận levan hiệu quả

Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp levan cao nhất. Nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn này có thể sản xuất levan với hiệu suất lên đến 40 g/l trong môi trường chứa sucrose.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất levan từ Bacillus subtilis

Mặc dù levan có nhiều ứng dụng tiềm năng, nhưng việc sản xuất levan từ Bacillus subtilis vẫn gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như nồng độ sucrose, pH và nguồn nitơ ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp levan.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan

Nồng độ sucrose và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp levan. Nghiên cứu cho thấy, nồng độ sucrose tối ưu là 100 g/l và pH 7 cho năng suất levan cao nhất.

2.2. Thách thức trong việc tối ưu hóa quy trình sản xuất

Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất levan từ Bacillus subtilis đòi hỏi nghiên cứu sâu về các điều kiện nuôi cấy. Các nhà khoa học cần tìm ra các phương pháp hiệu quả để tăng năng suất levan.

III. Phương pháp nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis

Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis được thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy khác nhau. Các yếu tố như nồng độ sucrose, pH và tốc độ lắc được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp.

3.1. Quy trình nuôi cấy Bacillus subtilis

Quy trình nuôi cấy Bacillus subtilis bao gồm việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy với nồng độ sucrose và nguồn nitơ phù hợp. Tốc độ lắc cũng cần được điều chỉnh để đảm bảo vi khuẩn phát triển tốt.

3.2. Phân tích và đánh giá năng suất levan

Sau khi thu nhận levan, các mẫu sẽ được phân tích để đánh giá năng suất và chất lượng. Các phương pháp phân tích như HPLC được sử dụng để xác định hàm lượng levan trong mẫu.

IV. Ứng dụng thực tiễn của levan trong sản xuất thức ăn cho gà cảnh

Levan có thể được sử dụng như một thành phần bổ sung trong thức ăn cho gà cảnh. Việc bổ sung levan không chỉ cải thiện chất lượng thức ăn mà còn tăng cường sức khỏe cho gà trong giai đoạn 1-14 ngày tuổi.

4.1. Lợi ích của levan trong thức ăn cho gà

Levan giúp cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cho gà. Nó cũng có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, giúp gà phát triển khỏe mạnh hơn.

4.2. Quy trình sản xuất thức ăn bổ sung levan

Quy trình sản xuất thức ăn cho gà cảnh bổ sung levan bao gồm việc phối trộn levan vào các nguyên liệu khác. Các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ levan tối ưu trong thức ăn là 5-10%.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu levan

Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis mở ra nhiều cơ hội mới trong sản xuất thức ăn cho gà cảnh. Với những lợi ích vượt trội, levan hứa hẹn sẽ trở thành một thành phần quan trọng trong ngành chăn nuôi.

5.1. Tương lai của levan trong ngành thực phẩm

Levan có tiềm năng lớn trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng của levan.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về các điều kiện nuôi cấy và ứng dụng thực tiễn của levan trong sản xuất thức ăn cho gà cảnh. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường sinh vật cảnh tại Việt Nam ghi nhận sự bùng nổ mạnh mẽ của phong trào nuôi gà cảnh giá trị cao như gà Serama trọng lượng chỉ từ 300 đến 500 gram, gà vảy cá Sebright hay gà lông xù Silkie trọng lượng 1,5 đến 2,0 kg. Dù lượng thức ăn tiêu tốn chỉ bằng khoảng 33% so với gà công nghiệp thương phẩm, giá trị kinh tế của một cá thể gà cảnh thuần chủng có thể cao gấp 20 đến 100 lần. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất đối với người nuôi là giai đoạn 1 đến 14 ngày tuổi, thời điểm gà con có hệ miễn dịch non yếu, tỷ lệ chết do rối loạn tiêu hóa và nhiễm khuẩn đường ruột thường dao động từ 15% đến 25% nếu không có chế độ dinh dưỡng tối ưu.

Trong bối cảnh các quy định chăn nuôi quốc tế và Việt Nam dần cấm hoàn toàn việc lạm dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng, việc tìm kiếm các chế phẩm sinh học tự nhiên có hoạt tính prebiotic là yêu cầu cấp thiết. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp polymer sinh học levan từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, đồng thời nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận và ứng dụng thực tế vào sản xuất thức ăn hỗn hợp dạng viên cho gà cảnh giai đoạn 1 đến 14 ngày tuổi.

Mục tiêu cụ thể của công trình bao gồm việc khảo sát toàn diện các yếu tố ảnh hưởng, ứng dụng mô hình toán học tối ưu hóa quá trình lên men, và đánh giá tính tương thích của chế phẩm khi phối trộn vào dây chuyền sản xuất công nghiệp. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm từ năm 2018 đến năm 2020 tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp thuộc Trường Đại học Lâm nghiệp và hệ thống nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi thuộc Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P. Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa kinh tế và công nghệ rõ nét khi cải thiện hàm lượng levan thu nhận tăng 11,1%, đạt mức 20,82 đến 21,05 g/l, tạo tiền đề vững chắc cho việc tự chủ nguồn phụ gia sinh học cao cấp nội địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật, trọng tâm là enzyme levansucrase (D-glucose-fructosyltransferase). Đây là enzyme xúc tác phản ứng chuyển gốc fructose từ cơ chất sucrose để tạo thành mạch polymer levan với các liên kết đặc trưng β-(2-6) fructo-furanosidic, đồng thời giải phóng glucose tự do. Cấu trúc hóa học này mang lại cho levan những đặc tính lý hóa vượt trội so với các polysaccharide tự nhiên khác, bao gồm khả năng hòa tan hoàn toàn trong nước nóng, không trương nở và độ kết dính cơ học rất cao lên tới 991 psi, vượt trội gấp nhiều lần so với carboxymethylcellulose (193 psi), inulin (124 psi), guargum (63 psi) và xanthan gum (33 psi). Các hạt levan có đường kính nano từ 75 đến 200 nm, tạo độ nhớt thấp khoảng 0,38 dl/gm ở 25 độ C, rất thuận lợi cho quá trình tạo màng bao sinh học.

Bên cạnh đó, đề tài tích hợp lý thuyết dinh dưỡng miễn dịch đường ruột gia cầm dựa trên cơ chế prebiotic. Khác với tinh bột thông thường, levan không bị thủy phân bởi enzyme amylase hay dịch vị dạ dày non nớt của gia cầm, mà đi thẳng xuống manh tràng để kích thích chọn lọc sự phát triển của hệ vi khuẩn có lợi Lactobacillus và Bifidobacterium, đồng thời ức chế cạnh tranh các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella và Escherichia coli.

Để giải quyết bài toán tương tác phức tạp giữa các yếu tố công nghệ, mô hình quy hoạch thực nghiệm bề mặt đáp ứng Box-Behnken (RSM) bậc hai được áp dụng nhằm tìm kiếm điểm cực trị toàn cục của hàm mục tiêu, thay thế cho phương pháp tối ưu hóa đơn biến truyền thống vốn tốn kém thời gian và dễ bỏ sót các tương tác chéo.

Phương pháp nghiên cứu

Vật liệu sinh học trung tâm là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp và tuyển chọn bởi Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp. Quy trình thực nghiệm chia làm hai giai đoạn rõ rệt: khảo sát đơn biến và tối ưu hóa đa biến. Nguồn cơ chất và môi trường dinh dưỡng sử dụng đường sucrose tinh khiết kết hợp với các nguồn đạm hữu cơ như cao nấm men (YE), cao thịt bò (BE) và cao thịt lợn (ME).

Hàm lượng levan thu nhận trong canh trường được xác định bằng phương pháp kết tủa cồn phân đoạn, sau đó thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch axit clohydric HCl 1M ở nhiệt độ 100 độ C trong 60 phút, trung hòa bằng natri hydroxit NaOH 2M và định lượng fructose giải phóng thông qua phản ứng tạo màu với thuốc thử axit 3,5-dinitrosalicylic (DNS) ở bước sóng quang phổ 540 nm theo công thức chuẩn hóa L = F × 0,9. Độ lặp lại của các phép đo quang phổ và phân tích sinh hóa được thiết lập tối thiểu 3 lần độc lập (cỡ mẫu n = 3) nhằm loại trừ sai số ngẫu nhiên.

Quy trình tối ưu hóa đa biến Box-Behnken được vận hành trên phần mềm Design-Expert 11 với 17 thí nghiệm ngẫu nhiên, bao gồm 12 điểm biên và 5 điểm lặp tại tâm để đánh giá phương sai thuần túy. Ba biến số đầu vào được lựa chọn gồm: pH ban đầu (mức giá trị từ 6 đến 8), nồng độ nitơ cao nấm men (từ 1,5 đến 2,5 g/l), và tốc độ lắc của hệ thống (từ 100 đến 150 vòng/phút).

Trong giai đoạn thử nghiệm sản xuất thức ăn, mẫu cám gà con 1 đến 14 ngày tuổi được phối trộn bổ sung chế phẩm levan ở 3 tỷ lệ (0,1%, 0,2% và 0,3%) và ép viên ở 3 mức nhiệt độ (70, 80 và 90 độ C) trên dây chuyền công nghiệp hiện đại tại nhà máy C.P. Việt Nam Xuân Mai (nơi có công suất tiếp nhận nguyên liệu khoảng 60.000 tấn/tháng). Các chỉ tiêu dinh dưỡng, độ ẩm, độ bền, độ cứng và hàm lượng đường tổng số được kiểm tra nghiêm ngặt bằng hệ thống máy cận hồng ngoại DS 2500F, máy Kjeltec 8000 và phương pháp chuẩn độ Bertrand theo tiêu chuẩn TCVN 4594:1988.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát đơn biến đã làm sáng tỏ quy luật sinh trưởng và tích lũy levan của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đối với từng thông số công nghệ:

Thứ nhất, nồng độ cơ chất sucrose đóng vai trò quyết định đến năng suất tổng hợp. Khi nâng nồng độ sucrose từ 20 g/l lên 80 g/l, hàm lượng levan trong dịch nuôi cấy tăng trưởng ấn tượng từ 9,06 g/l lên 18,71 g/l, tương ứng với mức tăng hơn 106,5%. Tuy nhiên, khi tiếp tục nâng nồng độ sucrose lên 100 g/l, lượng levan thu được có xu hướng giảm nhẹ còn 17,32 g/l do hiện tượng áp suất thẩm thấu cao gây ức chế sinh trưởng tế bào.

Thứ hai, nguồn đạm và nồng độ nitơ ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme ngoại bào. Trong ba nguồn nitơ hữu cơ thử nghiệm, cao nấm men (YE) đem lại hiệu quả vượt trội nhất với hàm lượng levan đạt 18,02 g/l tại nồng độ 2,0 g/l, cao hơn rõ rệt so với cao thịt lợn ME (khoảng 14,2 g/l) và cao thịt bò BE (khoảng 13,8 g/l). Việc gia tăng nồng độ nitơ lên mức 2,5 g/l và 3,0 g/l khiến hàm lượng polymer giảm lần lượt xuống 16,63 g/l và 15,25 g/l.

Thứ ba, điều kiện vật lý nuôi cấy ghi nhận mức tối ưu đơn biến tại pH 7,0, tỷ lệ giống cấp 7,5% và tốc độ lắc 150 vòng/phút, đạt năng suất 18,71 g/l sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 độ C. Tốc độ lắc quá thấp ở 100 vòng/phút chỉ thu được 14,56 g/l do thiếu hụt oxy hòa tan, trong khi tốc độ lắc quá cao 175 vòng/phút làm giảm sản lượng xuống 17,32 g/l bởi lực xé cắt thủy động lực học làm tổn thương màng tế bào.

Thứ tư, mô hình tối ưu hóa Box-Behnken đã xác định phương trình hồi quy bậc hai tương thích cao với thực nghiệm với hệ số F = 23,57, giá trị p = 0,0002 và độ không tương thích Lack of Fit đạt p = 0,2364. Điểm tối ưu lý thuyết được xác lập tại pH 7,8; nồng độ nitơ 2,3 g/l; và tốc độ lắc 120 vòng/phút. Kiểm chứng thực nghiệm tại điều kiện này ghi nhận hàm lượng levan thực tế đạt 20,82 đến 21,05 g/l, tăng thêm 2,34 g/l (tương đương mức cải thiện 11,1% so với trước khi tối ưu).

Thứ năm, thử nghiệm phối trộn 0,2% chế phẩm levan vào cám gà cảnh và ép viên ở nhiệt độ 70 đến 80 độ C cho thấy chất lượng cám đạt độ ẩm lý tưởng dưới 12%, độ cứng và độ bền hạt cám tăng đáng kể, đồng thời bảo toàn trên 85% hoạt tính đường chức năng mà không làm biến tính các vi chất dinh dưỡng.

Thảo luận kết quả

Hiện tượng suy giảm sản lượng levan khi nồng độ sucrose vượt quá ngưỡng 80 g/l được lý giải do sự gia tăng đột ngột độ nhớt của môi trường canh trường, cản trở quá trình truyền khối và khuếch tán dưỡng chất của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các cảnh báo của Abdel-Fattah và cộng sự (2005) khi nghiên cứu hiện tượng ức chế cơ chất ở nồng độ carbohydrate cao.

Khi so sánh hiệu quả tối ưu hóa bề mặt đáp ứng, mô hình Box-Behnken trong nghiên cứu này mang lại mức cải thiện 11,1%, vượt trội hơn mức tăng 4,1% trong công trình của Bruna và cộng sự (2013) thực hiện trên chủng Bacillus subtilis Natto CCT7712. Năng suất thu nhận 20,82 g/l trên nền cơ chất sucrose 80 g/l (tương đương hệ số chuyển đổi 0,26 g levan/g sucrose) thể hiện tính cạnh tranh kinh tế rất cao so với nghiên cứu của Oliveira và cộng sự (2007) trên chủng vi khuẩn Zymomonas mobilis, vốn chỉ thu được 21,68 g/l levan nhưng đòi hỏi nồng độ sucrose đầu vào lên tới 350 g/l.

Các dữ liệu thực nghiệm trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ đường động học sinh trưởng biểu diễn sự suy giảm nồng độ sucrose tương ứng với tốc độ tích lũy levan theo thời gian nuôi cấy. Đồ thị bề mặt đáp ứng 3D thể hiện rõ dạng chỏm cầu lồi với đỉnh cực đại nằm trong khoảng pH 7,6 đến 8,0 và nồng độ nitơ 2,2 đến 2,4 g/l. Bảng phân tích thành phần dinh dưỡng sau ép viên chứng minh levan đóng vai trò như một chất kết dính sinh học tự nhiên, giúp giảm tỷ lệ phát sinh bụi cám từ mức 4,5% xuống dưới 1,8%, nâng cao độ đồng đều của viên thức ăn cho gà con.

Đề xuất và khuyến nghị

Để nhanh chóng đưa các kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất với quy mô lớn, một số giải pháp đồng bộ cần được triển khai:

Thứ nhất, nâng cấp quy trình lên men vi sinh lên quy mô pilot 500 đến 1.000 lít. Nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cần phối hợp với các kỹ sư công nghệ thiết lập hệ thống điều khiển tự động duy trì liên tục giá trị pH ở 7,8 và kiểm soát tốc độ khuấy đảo tương đương 120 vòng/phút, hướng tới mục tiêu nâng hiệu suất sinh tổng hợp levan đạt trên 25,0 g/l trong lộ trình 6 đến 12 tháng.

Thứ hai, chuẩn hóa công nghệ thu hồi và tinh sạch dung môi tuần hoàn. Bộ phận công nghệ hóa sinh cần hoàn thiện dây chuyền kết tủa cồn ethanol 96 độ ở tỷ lệ thể tích 1:3 và nhiệt độ từ 0 đến 4 độ C kết hợp tháp chưng cất thu hồi dung môi khép kín. Mục tiêu đặt ra là cắt giảm 30% chi phí hóa chất và rút ngắn thời gian kết tủa từ 5 giờ xuống còn 2 giờ, hoàn thành trước quý 2 năm 2025.

Thứ ba, thương mại hóa dòng sản phẩm cám gà cảnh bổ sung 0,2% levan. Ban lãnh đạo bộ phận Feed Technology thuộc Công ty C.P. Việt Nam cần đưa công thức phối trộn chuẩn vào sản xuất thương mại với sản lượng 50 đến 100 tấn/tháng, kiểm soát nhiệt độ buồng ép viên không vượt quá 80 độ C nhằm bảo toàn hoạt tính sinh học, hướng đến mục tiêu giảm tỷ lệ chết ở gà cảnh giai đoạn 1 đến 14 ngày tuổi xuống dưới 5% trong vòng 18 tháng tới.

Thứ tư, mở rộng thử nghiệm lâm sàng và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở. Các chuyên gia dinh dưỡng vật nuôi cần liên kết với các trang trại nhân giống gà Serama và gà Quý phi tại Hà Nội, Đồng Nai để theo dõi chỉ số tăng trọng, độ bóng mượt của lông và phân tích mật độ vi khuẩn Lactobacillus đường ruột định kỳ, hoàn thiện hồ sơ đăng ký tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm trong giai đoạn 2024 đến 2025.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn cao, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

1. Các nhà khoa học, giảng viên và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh học ứng dụng. Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn xác về phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken, kỹ thuật đo quang phổ định lượng polysaccharide ngoại bào và động học sinh tổng hợp enzyme levansucrase.
2. Đội ngũ chuyên gia dinh dưỡng và kỹ sư công nghệ tại các nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi. Nhóm đối tượng này có thể trực tiếp ứng dụng quy trình kiểm soát nhiệt độ ép viên từ 70 đến 80 độ C, các thông số phối trộn phụ gia prebiotic 0,2% nhằm nâng cao độ bền viên cám và tạo ra dòng thức ăn cao cấp không chứa kháng sinh.
3. Chủ trang trại chăn nuôi, các nghệ nhân và câu lạc bộ bảo tồn sinh vật cảnh, gà cảnh chuyên nghiệp. Luận văn đem lại hiểu biết khoa học sâu sắc về sinh lý dinh dưỡng gà con 1 đến 14 ngày tuổi, giúp xây dựng chế độ cho ăn chuẩn xác nhằm nâng cao tỷ lệ sống và phát triển vóc dáng chuẩn của các giống gà quý hiếm.
4. Các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và dược phẩm thú y. Đơn vị kinh doanh có thể tận dụng quy trình nuôi cấy Bacillus subtilis trên nguồn cơ chất đường sucrose giá rẻ để sản xuất levan làm chất bao vi nang, chất ổn định nhũ tương hoặc nguyên liệu prebiotic thương mại.

Câu hỏi thường gặp

Levan là gì và vì sao hợp chất này đặc biệt quan trọng với gà cảnh non?
Levan là polymer sinh học của fructose liên kết β-(2-6), có độ kết dính cơ học tự nhiên lên tới 991 psi và hoạt tính prebiotic mạnh mẽ. Đối với gà cảnh 1 đến 14 ngày tuổi có đường ruột non yếu, levan kích thích mạnh hệ vi khuẩn Lactobacillus, ngăn chặn mầm bệnh tiêu chảy và giúp tạo hình viên cám chắc chắn, kích thích gà con ăn nhiều.

Tại sao nồng độ sucrose 80 g/l lại cho hiệu suất sinh levan cao hơn mức 100 g/l?
Khi nâng nồng độ đường lên 100 g/l, áp suất thẩm thấu trong canh trường tăng vọt cùng với sự gia tăng độ nhớt của môi trường đã gây ức chế quá trình hô hấp và trao đổi chất của Bacillus subtilis. Do đó, mức nồng độ 80 g/l là điểm cân bằng lý tưởng giúp sản lượng đạt đỉnh 18,71 g/l trước khi tối ưu.

Việc áp dụng mô hình toán học Box-Behnken mang lại lợi ích cụ thể nào cho nghiên cứu?
Mô hình Box-Behnken giúp đánh giá đồng thời tương tác chéo giữa 3 yếu tố (pH, nitơ, tốc độ lắc) chỉ với 17 mẻ thí nghiệm thay vì 27 mẻ như phương pháp toàn phần. Mô hình đạt độ tin cậy với hệ số F = 23,57, giúp tìm ra điểm tối ưu thực nghiệm đạt 20,82 đến 21,05 g/l levan, tăng 11,1% hiệu suất.

Nhiệt độ ép viên ảnh hưởng như thế nào đến chất lượng của chế phẩm levan trong cám?
Thực nghiệm tại xưởng sản xuất cho thấy nhiệt độ ép viên từ 70 đến 80 độ C vừa đủ làm chín cám, tiêu diệt vi khuẩn tạp nhiễm, duy trì độ ẩm dưới 12% và bảo toàn trên 85% hàm lượng đường chức năng. Nếu nhiệt độ vượt quá 90 độ C, levan sẽ bị thủy phân nhiệt làm suy giảm hoạt tính sinh học.

Tỷ lệ phối trộn levan bao nhiêu trong thức ăn gà cảnh đem lại hiệu quả kinh tế kỹ thuật cao nhất?
Kết quả phân tích dinh dưỡng và cảm quan chỉ ra tỷ lệ bổ sung 0,2% levan vào khẩu phần thức ăn là tối ưu nhất. Mức phối trộn này đảm bảo cung cấp đủ liều lượng prebiotic cho hệ vi sinh đường ruột phát triển, tăng độ bền cơ học của viên thức ăn mà vẫn duy trì chi phí sản xuất ở mức hợp lý.

Kết luận

• Đề tài đã khảo sát và xác định thành công các thông số nuôi cấy đơn biến tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sinh levan: nồng độ sucrose 80 g/l, nguồn đạm cao nấm men YE 2,0 g/l, tỷ lệ giống cấp 7,5% và thời gian lên men 24 giờ ở 37 độ C.
• Xây dựng thành công mô hình quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken 3 yếu tố, nâng cao năng suất sinh tổng hợp levan lên mức 20,82 đến 21,05 g/l tại điều kiện pH 7,8; nồng độ nitơ 2,3 g/l và tốc độ lắc 120 vòng/phút, cải thiện 11,1% sản lượng so với trước tối ưu.
• Thiết lập quy trình thu nhận và tinh sạch levan bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với dung môi ethanol 96 độ, đạt độ thu hồi cao và chuẩn hóa phương pháp định lượng thủy phân bằng axit clohydric HCl 1M đo quang phổ DNS.
• Ứng dụng thành công chế phẩm levan vào công thức thức ăn hỗn hợp viên cho gà cảnh giai đoạn 1 đến 14 ngày tuổi với tỷ lệ bổ sung tối ưu 0,2%, cải thiện độ bền cơ học viên cám và kiểm soát độ ẩm dưới 12%.
• Xác định dải nhiệt độ ép viên công nghiệp an toàn từ 70 đến 80 độ C, bảo tồn tối đa hoạt tính prebiotic tự nhiên và đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn vi sinh vật theo quy chuẩn Việt Nam.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã hoàn thiện trọn vẹn chuỗi công nghệ từ khâu nuôi cấy vi sinh vật tạo nguyên liệu đến khâu gia công sản xuất thức ăn hoàn chỉnh, mở ra tiềm năng lớn thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm cao cấp. Trong giai đoạn 2024 đến 2025, các bước thử nghiệm quy mô pilot 1.000 lít và thương mại hóa sản phẩm cần được khẩn trương tiến hành. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm đến công nghệ sản xuất polymer sinh học và giải pháp thức ăn chức năng cho vật nuôi hãy kết nối trực tiếp với tác giả và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp để cùng hợp tác chuyển giao công nghệ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về levan 1. Giới thiệu về levan Levan là thuộc một trong hai loại fructans (là các cacbohydrate thường tìm thấy trong thực vật, tảo, vi khuẩn). Fructans gồm có hai loại chính là levan và inulins được phân biệt bởi các loại liên kết.

Các đơn phân trong phân tử levan liên kết với nhau bằng liên kết ß (2 - 6) còn trong phân tử inulins là liên kết ß (2 - 1) (Han và cs, 1990). Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai của fructans. Levan là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic (Ki- Hyo và cs, 2001; Mardo và cs, 2014). Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B.

amylovora, Seraria sp., Acetobacter xylinum NCI 1005, Z. Levan là polysaccharide ngoại bào được tổng hợp từ vi khuẩn trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Do các vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành levan (Mardo và cs, 2014). Năm 2012, một nghiên cứu được thực hiện bởi Esawy và cs cho thấy vi khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan.

Mặc dù cấu trúc của levan được đặc trưng bởi một mạch thẳng của liên kết ß (2 - 6) nhưng có nhiều levan được tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết ß (2 - 1). Các mạch nhánh thường ngắn và đôi khi chỉ có môt đơn phân fructose. Fructans ngắn nhất là 6 - ketose và đây cũng chính là fructan ngắn nhất trong các loại levan. Levan là một trong số ít các polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại dưới dạng furanose.

Cấu trúc hóa học của levan LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trong lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được tổng hợp từ vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2 - 100 kDa (Pontis và Campillo, 1985; Keith và cs, 1991). Levan được sản xuất từ thực vật có trong lượng phân tử khoảng 2 - 33 kDa (Rhee và cs, 2002). Levan được sản xuất từ quá trình lên men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương ứng với 60000 đơn phân của fructose (Viikari và cs, 1986).

Bên cạnh đó, levan được sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Levan có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ cần thiết cho từng mục đích cụ thể (Shin và cs, 2005). subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với 40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005).

Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019) cho thấy levan được tổng hợp bởi B. subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon. Chiết xuất nấm men (YE) là nguồn nitơ tốt nhất. Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l, tốc độ lắc 150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan.

Kết quả cho thấy năng suất levan thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose. Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000; Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào ung thư (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997; Yamamoto và cs, 1999).

Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện. Oliveira và cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với 2 nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất 21,68 g/l.

Santos và cs (2013), cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto bằng phương pháp này cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l) và thời gian nuôi 16 giờ. Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm bởi các đặc tính vượt trội như: khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt, chống ung thư và khả năng tạo màng (Santos và cs, 2013). Vì vậy, levan được ứng dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013). Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016).

Natural Polymers Inc. (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., (Hàn Quốc) và Advance Co., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mô thương mại. Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016). Sản phẩm dưỡng da mặt Hình 1.

Sản phẩm dưỡng thể với Proteolea® với Slimexir® Bên cạnh đó, một số các sản phẩm thực phẩm chức năng đã được bày bán tại các hệ thống siêu thị tại Hàn Quốc, Nhật Bản của công ty RealBiotech (www. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các sản phẩm levan trên thị trường (www. Tính chất Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính mạnh mẽ.

Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm. Các thành phần và tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp levan (Khadiga và cs, 2015). Không giống như polysaccharides được sử dụng như chất nhũ hóa và chất làm đặc, levan không trương lên trong nước và độ nhớt thấp 0,38 dl/gm ở 250C (In Young Bae và cs, 2007). Levan rất dễ tan trong nước nóng và gần như không hòa tan (< 0,5%) trong nước ở nhiệt độ phòng.

Khả năng hòa tan trong nước nóng của levan cao hơn inulin được đặc trưng bởi liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) và cấu trúc mạch nhánh có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ (Justin và cs, 2007). Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012): - Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol; - Acetone, methylethylketone, toluene; - Ethyl lactate; - N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide; LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 - Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate; - D - limonene; - Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol; - Dimethyl formamid; - Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic; - Furfuryl alcohol; - Dầu hỏa, xăng. Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase, nhưng rất dễ bị thủy phân bởi acid tạo thành fructose. Levan bị thủy phân hoàn toàn thành các đơn phân fructose trong HCl 1N ở 700C (Kang và Cottrell, 1979).

Levan cũng được thủy phân bởi axit oxalic 0,5% (Shin và cs, 2005). Theo Szwengiel và cs (2004) sản phẩm của quá trình thủy phân levan bởi axit yếu là các fructo - oligosaccharides (FOS) ngắn và các đơn phân fructose. Độ kết dính của levan rất mạnh. So với các polymer tự nhiên, levan có độ kết dính mạnh hơn rất nhiều, được thể hiện qua bảng 1.

Độ kết dính của một số polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Độ kết dính (psi) Levan 991 Carboxymethylcellulose 193 Inulin 124 Guargum 63 Xanthan gum 33 Levan có một số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích và tăng tính thấm tế bào (Leibovici và Stark, 1984). Hơn nữa, levan còn có khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong y học (Shin và cs, 2005). Nguồn thu nhận levan Levan là một cacbohydrate có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2002).

Levan được tìm thấy trong một số loại cỏ như: LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 Dactylis glomerata, Poa secunda và Agropyron cristatum. Levan cũng được chứa trong lúa mì và lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi và A. Levan được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật như: Zymomonas mobilis (Muro và cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer và cs, 1995) và Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998). Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trọng lượng phân tử và mức độ phân nhánh.

Levan được sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Dựa trên chất nền bằng phản ứng chuyển gốc fructose của sucrose trong levan β - 2, 6 - fructan bởi enzyme D - glucose - fructosyl transferare bởi một số vi sinh vật. Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan ở quy mô công nghiệp cho năng suất cao rất hiếm. Gần đây các nhà khoa học đã tìm ra vi khuẩn B.

subtilis Natto có khả năng sản xuất ra một hỗn hợp poly acid glutamic và levan. Khi chúng được nuôi cấy trong môi trường có thành phần chính gồm đường sucrose và axit amin L - Glutamic. Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid -  - glutamic chủ yếu được sản xuất trong môi trường có chứa acid -  - glutamic và không có đường sucrose. Ngược lại, levan chỉ được sản xuất khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có tới 20% (w/w) đường sucrose nhưng không có glutamate.

Các nhà khoa học cho rằng B. subtilis Natto có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan và sản phẩm dễ dàng tinh sạch (Shin và cs, 2005). Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan Levan sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là đường cacbonhydrate như sucrose.

Năm 2004, Szwengiel và cs, đã nuôi cấy B.