CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 1.1 Cây Than Kỳ 1.1 Nguồn gốc Năm 1725, Nhà thám hiểm người Pháp, Reynaud dés Marchais khi ghé lại một ngôi làng ở Ghana (Tây Phi) đã viết về tập tục ky lạ của tho dân vùng này. Theo quan sát của ông thì các thức ăn của họ đều rất chua và không hề có đường, nhưng sau khi nhai một loại quả cây màu đỏ thì các vị chua này đã trở thành ngọt và họ cũng sử dụng loại trái cây này để làm rượu palm chua trở nên ngọt hơn. Daniel đã nghiên cứu về đặc tính cây này và phát hiện ra rang thành phan chính của quả là miraculin, cây được định danh là Synsepalum dulcificum, ho hỗng xiém (Sapotaceae) và ông đặt tên là “miracle fruit” (cây kỳ diệu) [23].2 Phần loại khoa học - Guidi: Thực vật (Plantae) - Nganh: hột kin (Magnoliophyta) - Lép: Hai lá mam (Magnoliopsida) - Bo: Ericales - Ho: Hong xiém (Sapotaceae) - Chi: Sideroxylon - Danh pháp khoa hoc: Synsepalum dulcificum - _ Tên tiếng Việt: cây Thần Kỳ (Synsepalum dulcificum) [68] 1.3 Đặc điểm sinh học Cây Than Ky chịu được cường độ ánh sáng cao, không thích hop với điều kiện đất quá âm ướt, dat acid (pH 4,5-5,8) là thích hợp cho cây Than Ky [48].1 Rễ Ré Synsepalum dulcificum thuộc loại rễ ăn nông, có rễ cái, đại bộ phận rễ tập trung ở vùng 0 — 40 cm, độ vươn xa của rê khá rộng nêu trông ngoài tự nhiên, thường cách gốc khoảng từ 0 — 100 em, có nhiều rễ tơ. Sự phân bố của rễ còn phụ thuộc đất trồng [7] 1.2 Than Day la loai cay tiéu mộc nhỏ, phat triển rất chậm và có thé cao 1,2 -1,5m nếu trồng trong chậu, cao 3,0 — 4,5m nếu trồng ngoài tự nhiên.
Khoảng 10 năm cây mới có thé cao được 1,2 — 1,5 m. Tan cây tạo thành hình chóp. Có một thân chính, 4 — 5 nhánh phụ [7].3 Lá Lá nguyên, dày, dài, bóng, mọc so le hay tạo thành chùm ở đầu các ngọn nhánh phụ, lá non màu xanh nhạt và đậm dan khi già. Lá xanh hàng niên, quanh năm không rụng lá và chỉ thường lá già mới rụng [7| 1.4 Hoa Hoa Synsepalum dulcificum nhỏ có màu trang, mùi rất thơm, có lông tơ ở mặt ngoài, đường kính khi nở khoảng 0,3 — 0,5 mm.
Cuống nhỏ dài 0,2 — 0. Đầu tiên ở nách lá xuất hiện mầm hoa, dần dan lớn lên thành nụ, trên một cành thường có 15 — 20 nụ ở nách lá, sau này nở thành hoa. Hoa moc tập trung hay đơn độc từ nách lá ở gần ngọn nhánh. Hoa có cánh dính liên ở đáy.
Cánh hoa chia làm 5 thùy, dính nhau ở đáy tạo thành hình ống. Hoa có tiểu nhị thấp hơn nhiều với nướm nhụy cái, tiểu nhị dính chính diện với cánh hoa, bộ nhụy cái gồm bầu noãn, có một chỉ nhụy và một nướm moc dai ra khỏi bao hoa, sau khi thụ tinh chỉ nhụy không bị tiêu biên đi mà tôn tại song song với sự phát triên của quả [7]. Cây Thần Kỳ sinh trưởng rất chậm thời gian từ khi cây nảy mầm đến lúc ra hoa là 2-3 năm. Tuy nhiên, hoa có thể ra và cho quả quanh năm nên cho hiệu quả kinh tế cao.
Hoa và quả của cây Thần Kỳ 1.5 Quả Quả chín từ cây Thân Kỳ có màu đỏ tươi và chứa một hột. Chiều dài trung bình cua quả khoảng từ 2 — 3,5 cm. Đường kính quả khoảng từ | — 1,8 cm. Trọng lượng quả khoảng 1,5 — 3 g.
Vỏ qua mỏng, khi quả còn non có màu xanh dam nhưng khi chín quả có màu đỏ, mọng nước. Thịt quả khi chín có màu trăng, hơi nhớt, khi ăn lại có vị thanh chua nhẹ. Cây Thần Kỳ cho quả quanh năm và từ lúc ra hoa đến khi kết trái khoảng 30 đến 45 ngày [7].5 Hột Mỗi quả có một hột, hột có hình elip, kích thước từ 1,0 — 1,5 cm. Vỏ hột cứng và gôm có hai mặt, mặt trên trơn và mặt dưới nhám có đường kẻ sọc.
Bên trong vỏ, , hột gồm 2 tử diệp màu xanh áp sát, dính nhau ở cán phôi [7].2 Miraculin Miraculin được xem là chất làm nên tính năng “thần kỳ” của loại quả này. Khi ăn quả Thần Kỳ vào thì vi chua, cay, đăng của các loại quả, thức ăn, thức uống kế tiếp sẽ trở nên ngọt. Năm 1968, miraculin được ly trích đầu tiên bởi Giáo sư Kenzo Kurihara và Tiến si Lloyd Beidler, dai hoc Florida [40].1 Cau tao miraculin Miraculin là một loại glycoprotein, có trong lượng phân tử 24.600 dalton, được tạo thành bởi một chuỗi phân tử đường và một chuỗi protein gồm 191 amino acid [56]. Thành phan các loại đường trong miraculin: glucosamine (31%), mannose (30%), fucose (22%), xylose (10%) và galactose (7%) [56].
1-50 DSAPNPVLDI DGEKLRTGTN YYIVPVLRDH GGGLTVSATT PNGTFVCPPR 51-100 VVQTRKEVDH DRPLAFFPEN PKEDVVRVST DLNINFSAFM PNPGPETISS 101-150 WCRWTSSTVW RLDKYDESTG QYFVTIGGVK FKIEEFCGSG FYKLVFCPTV 151-191 CGSCKVKCGD VGIYIDQKGR GRRLALSDKP FAFEFNKTVY F Hình 1. Trình tự 191 amino acid cua phan tử miraculin [68] Bảng 1. Thành phần các amino acid của miraculin [56] STT | Amino acid Viết tat Số lượng/mol° | % mol" ] Aspatic acid (D/N) 21 11,0 2 Threonine (T) 14 73 3 Serine (5S) 12 6,3 4 Glutamic acid (E/Q) 12 6,5 5 Proline (P) 15 7,9 6 Glycine (G) 16 8,7 7 Alanine (A) 6 3,5 S Half —cysteine | (C) 7 2,6 9 Valine (V) 21 10,8 10 Methionine (M) l 0.5 I1 Isoleucine (I) 8 43 12 Leucine (L) 10 5,5 13 Tyrosine (Y) 7 3,7 14 Phenylalanine (F) 14 TA 15 Lysine (K) 12 6,5 16 Histidine (H) 2 1,0 17 Arginine (R) II 5,5 18 Tryptophan (W) 2 1,0 “Giá trị kết quả của lượng amino acid trên tổng giá trị 100. > Giá trị kết quả của lượng trên 21200 polypeptide 1.2 Trình tự cDNA mã hóa miraculin Năm 1995, Yutaka Masuda (Đại học Showa, Tokyo, Nhật Bản) cùng các cs đã sử dụng đoạn mỗi mã hóa (GIu”-Thrˆ' miraculin thiết lập trình tự cDNA ma hóa protein thay đổi vị giác — miraculin [43] Trình tự cDNA mã hóa miraculin gồm 220 amino acid, trong đó có chuỗi tín hiệu gồm 29 amino acid.
Phân tích Western blot chỉ ra răng mRNA mã hóa cho 10 miraculin được tìm thay trong quả Than Kỳ vào thời điểm 3 tuần sau khi thụ phan [43]. ACAACAATGAAGGAATTAACAATGCTCTCTCTCTCGTTCTTCTTCGTCTCTGGATTGTTG 60 M K E L T M L S Lb S F F F V S A L L 18 GCAGCAGCGGCCAACCCACGTCTTAGTGCAGCGGATTCGGCACCCAATCCGGTTCTTGAC 120 A A A A N P LL 5 A 5” SA P N P VL OD 38 ATAGACGGAGAGAAACTCCGGACGGGGACCAATTATTACATTGTGCCGGTGCTCCGCGAC 180 T D G E K L R F G T N ¥Y Y I V P V L R D 58 CATGGCGGCGGCCTTACAGTATCCGCCACCACCCCCAACGGCACCTTCGTTTGTCCACCC 240 H G G 6G L T V S A T T PN GC T7 F V C P P 78 AGAGTTGTCCAAACACGAAAGGAGGTCGACCACGATCGCCCCCTCGCTTTCTTTCCAGAG 300 R V V Q T R K E V D H D R P L A F F P E 98 AACCCAAAGGAAGACGTTGTTCGAGTCTCCACCGATCTCAACATCAATTTCTCGGCGTTC 360 WP AUWE DV. VRE V Š FD & NHN OF Š OA EÈ 118 ATGCCCTGTCGTTGGACCAGTTCCACCGTGTGGCGGCTCGACAAATACGATGAATCCACG 420 MP C R W T S S T V W R L D K Y D E § T 138 GGGCAGTACTTCGTGACCATCGGCGGTGTCAAAGGAAACCCAGGTCCCGAAACCATTAGT 480 GQ ¥ F V T I G 6G V K G N P G P E T TI S 158 AGCTGGTTTAAGATTGAGGAGTTTTGTGGTAGTGGTTTTTACAAGCTTGTTTTCTGTCCC 540 S W F K =f E E F € G 5S G F ¥ K L V F C P 178 ACCGTTTGTGGTTCCTGCAAAGTAAAATGCGGAGATGTGGGCATTTACATTGATCAGAAG 600 T V €C G 5 € K V K C GDVGdI Y iI DQ kK 198 GGAAGAAGGCGTTTGGCTCTCAGCGATAAACCATTCGCATTCGAGTTCAACAAAACCGTA 660 G R R R L AL S$ D K P F À EL: EF N K T V 218 TACTTCTAATTGGGTTTGGGGGTGGTTTTTCCAATCACATCTCATGTATGATCAGCTCCA 720 y¥ +s * 220 TTATCGATCTGCATAATTATAATTAATAAGGAAGCTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 780 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 801 Hình 1. Trinh tự mã hóa cDNA của miraculin [43] Các trình tự amino acid gach chán được su dụng cho việc thiết kế môi PCR.
Dấu mũi tên cho biết vị trí phân tách của quá trình dịch mã miraculin. Dấu (*) đánh dấu codon kết thúc.3 Mô hình không gian của miraculin Miraculin là một chuỗi protein liên kết với chuỗi đường có trọng lượng phân tử 24,6 kD. Miraculin thường ton tại ở dạng tetramer, là sự kết hợp của hai dimer gôm 4 monomer. Ca tetramer va dimer đêu có kha năng thay đôi vi giác từ chua II thành ngọt [14].
Trong mỗi chuỗi protein, các dimer miraculin liên kết với nhau bằng liên kết disulfide. Liên kết này có hoạt tính thay đổi vị giác ở pH acid (lớn nhất ở pH 3), không đổi ở pH trung tính và ở pH 6,5 thì hầu như bị mat hoạt tính [14, 17]. Các nghiên cứu Antonella Paladino và cs đã chỉ ra hai dư lượng His29 và His59 của phân tử miraculin là những nhân tố chính liên quan đến hoạt động thay đổi vị giác. Ở pH acid, độ chặt của phân tử miraculin giảm, khoảng cách giữa hai monomer của dimer tăng.
Ở pH trung tính, miraculin trở nên nhỏ gon hơn, hai tiểu đơn vị gan nhau hơn. Việc sắp xếp lại cau trúc của các tiểu đơn vị làm giảm khoảng cách giữa các dư lượng His29 ở pH acid, do đó bề mặt xung quanh của chúng trở nên gan nhau hơn và tạo thành vùng tương tác thiết yếu trên bé mặt dimer [14]. Mô hình dimer miraculin Dimer miraculin duoc thé hién trong hình 1. Các vùng bị tích điện xung quanh dư lượng His đã được phát hiện và phân tích.
Vùng này liên quan đến sự liên kết giữa các thụ cảm vị giác gây ra hoạt động làm thay đổi vị giác. Đặc biệt, có nhiều dư lượng tích điện xung quanh His29 (Arg27, Asp28, Arg54, Glu56, Asp166, Argl7I, Argl72, Asp177, Lys178, Lysl7§ và Glul83) và His59 (Arg54, Lys55, Glu56, Asp58, Asp60, Arg61, và Lys186). Điều này giúp giải thích cho việc xảy ra sự tương tác điện tích của các thụ thé T1R2-T1R3 (2 thụ thể nhận biết protein- GPCR) trên lưỡi và vùng tích điện xung quanh [14]. Mô hình tetramer miraculin Các tetramer miraculin được mô phỏng bang chương trình mô phỏng.
Hai định hướng khác nhau của các dimer được mô phỏng, cả hai đều tương thích với sự hiện diện của chuỗi đường. Sự kết hợp các dimer dẫn đến cấu trúc tetramer không gian với hình cau và thăng (hình 17C) và 1. Cả hai mô hình tetramer hình cầu và hình thăng có sự khác biệt với các tính năng của các dimer riêng rẽ về vị trí của histidine, các histidine này có khả năng tiếp xúc và và tích điện bề mặt. Trong mô hình hình cau, bốn liên kết hydro được hình thành giữa hai dimer và 46 dư lượng Asn cho mỗi tiểu đơn vị ở bề mặt, trong khi ở dạng thắng chỉ có một liên kết hydro giữa hai dimer và gan một nửa sô dư lượng Asn năm tại các bê mặt.
Các câu trúc 12 hình câu và thăng đại diện cho hình thức “đóng” và “mở” cua tetramer miraculin tương ứng [14]. Dư lượng Cys va His được nhận dang theo loại nguyên tu và màu xanh tương ứng. (A) Cấu trúc monomer: màu vàng biểu hiện cho sợi Ö.