Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm phục vụ y học. Nhiều hoạt chất chiết xuất từ thảo dược sở hữu cấu trúc hóa học phức tạp cùng các hoạt tính sinh học đa dạng như gây độc trên các dòng tế bào ung thư, kháng virus HIV, bảo vệ tế bào gan, chống viêm và chống oxy hóa. Việc nghiên cứu thành phần hóa học không chỉ cung cấp cơ sở dữ liệu về các hợp chất tự nhiên mà còn góp phần giải thích cơ chế tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc theo kinh nghiệm y học cổ truyền.

Họ Ngũ vị (Schisandraceae) gồm hai chi chính là Schisandra (Ngũ vị tử) và Kadsura (Na rừng) với khoảng 50 loài phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới Đông Á, Đông Nam Á. Trên thế giới, các loài thuộc họ Ngũ vị đã được chứng minh là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất lignan và triterpenoid có hoạt tính sinh học giá trị. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu hóa thực vật và đánh giá hoạt tính sinh học trên các loài thuộc chi Kadsura và Schisandra bản địa còn phân tán, nhiều loài chưa được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học cũng như độc tính tế bào in vitro. Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi Kadsura và Schisandra, họ Schisandraceae ở Việt Nam" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống này.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các bộ phận khác nhau của 5 loài thực vật thuộc họ Ngũ vị thu hái tại Việt Nam: Kadsura heteroclita, Kadsura induta, Kadsura coccinea, Schisandra perulata và Schisandra sphenanthera.
  2. Thăm dò hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên ba dòng tế bào ung thư người: ung thư buồng trứng (OVCAR), ung thư đại tràng (HT-29) và ung thư phổi (A-549) của các hợp chất sạch phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng thực vật: 5 loài thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae) được giám định tên khoa học bởi TS. Bùi Văn Thanh (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam):
    • Thân cành loài Na leo (Kadsura heteroclita (Roxb.) Craib), số tiêu bản KH1010.
    • Lá loài Ngũ vị nam (Kadsura induta A. C. Smith), số tiêu bản KI1207.
    • Thân cành loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Smith), số tiêu bản KC1013.
    • Thân loài Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata Gagnep.), số tiêu bản SP1203.
    • Thân cành loài Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera Rehd.), số tiêu bản SS1103.
  • Phạm vi không gian và thời gian thu mẫu:
    • K. heteroclita: Thu hái tại huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 10 năm 2010.
    • S. sphenanthera: Thu hái tại huyện Đăk Glei, tỉnh Kon Tum vào tháng 3 năm 2011.
    • S. perulata: Thu hái tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3 năm 2012.
    • K. induta: Thu hái tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 7 năm 2012.
    • K. coccinea: Thu hái tại huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 10 năm 2013.
  • Phạm vi thử nghiệm sinh học: Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên ba dòng tế bào ung thư người (OVCAR, HT-29, A-549) bằng phương pháp so màu MTT tại Đại học Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới về họ Schisandraceae

Tổng quan tài liệu chỉ ra rằng hơn 25 loài thuộc họ Schisandraceae trên thế giới đã được khảo sát hóa thực vật, tập trung vào hai nhóm hợp chất chính:

  1. Nhóm hợp chất Lignan: Đã có hơn 285 hợp chất lignan được phân lập và xác định cấu trúc từ họ Ngũ vị, chia thành 5 nhóm khung chính:

    • Dibenzocyclooctadien lignan (hơn 48 hợp chất tiêu biểu như schisandrin C, gomisin N, gomisin J, kadsurin, heteroclitin A-C, schizanrin A-E, schisandrin A, angeloylgomisin P,...): Khung cơ bản diphenyl cyclooctadien, có các nhóm thế chứa oxy như methoxy, methylenedioxy, hydroxyl hoặc carboxyl tại các vị trí C-1~3 và C-12~14.
    • Spirobenzofuranoit dibenzocyclooctadien lignan (khoảng 75 hợp chất như heteroclitin D-F, kadsulignan B-O, interiorin, taiwankadsurin A-D,...): Cấu trúc có C-16 là tâm spiro gắn vòng furan và vòng thơm chứa nhóm ketone (dienone).
    • 4-Aryltetralin lignan (19 hợp chất như schisandron, wulignan A1-A2, epienshicin, schizandrizit,...).
    • 2,3-Dimetyl-1,4-diarylbutan lignan (32 hợp chất như pregomisin, preschisanthrin, (+)-anwulignan, isoanwulignan, lignandiol,...), đóng vai trò là tiền chất sinh tổng hợp.
    • 2,5-Diaryl tetrahydrofuran lignan (6 hợp chất như chicanin, d-epigalbacin, ganschisandrin, veraguensin, henricin, enshizhisu).

  2. Nhóm hợp chất Triterpenoid: Khoảng 373 hợp chất triterpenoid đã được phân lập với các biến thể khung cấu trúc phức tạp:

    • Lanostan và các dẫn xuất: Gồm lanostan chuẩn, 3,4-secolanostan (33 chất), 14(13→12)-abeolanostan, 18(13→12)-abeolanostan, 14(13→12):16(17→13)-diabeolanostan, schiglautan, 21,24-cyclolanostan, norlanostan (như coccinon A-B, axit secococcinic A-H, kadnanolacton E,...).
    • Cycloartan và các dẫn xuất: Gồm 3,4-secocycloartan, norcycloartan, 3,4:9,10-disecocycloartan, 1,30-cyclo-3,4:9,10-disecocycloartan, 21,24-cyclo-3,4-secocycloartan, 21,24-cyclo-3,4:9,10-disecocycloartan, 14(13→12)-abeo-18,23-cyclo-3,4:9,10-disecocycloartan (như schiglausin K-N, sphenasin A, schinalacton A-B, henrischinin A-C, schinchinenin B-H, kadcoccilacton K-P,...).
    • Schinortriterpenoid (Schisandra nortriterpenoid): Hơn 200 hợp chất nortriterpenoid C-26 đến C-29 đặc hữu của họ Ngũ vị, chia thành 16 nhóm khung: Schiartan, 18(13→14)-abeoschiartan, 18-norschiartan, 14(13→12):16(17→13)-diabeoschiartan, Wuweiziartan, 1,2,3-norwuweiziartan, Lancischiartan, 2,3-dinorlancischiartan, 1,2,3-trinorlancischiartan, Preschisanartan, 16,17-secopreschisanartan, Lancifoartan, 12,22-cyclopreschisanartan, 14-nor-16,17-secopreschisanartan, Schisanartan và 13,16-secopreschisanartan.

  3. Các nhóm chất khác: Flavonoid (kaempferol, quercetin và các dẫn xuất glycoside từ K. oblongifolia), sesquiterpenoid dạng guaianolide từ K. interior, và các hợp chất tinh dầu (chứa 4-terpineol, caryophyllene, muurolol, cadinol, santalene, zingiberene,...).

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Văn bản điểm lại các nghiên cứu đã công bố trong nước:

  • Năm 2009, Ninh Khắc Bản và cộng sự phân lập từ rễ loài Kadsura coccinea 4 hợp chất dibenzocyclooctadien lignan (axetylepigomisin R, isovaleroylbinankadsurin A, kadsuralignan J, binankadsurin A) và 1 triterpenoid (axit secococcinic F).
  • Năm 2010, Trần Văn Sung và cộng sự phân lập từ quả loài Schisandra sphenanthera 2 lignan (schizandrin, angeloylgomisin P) và 1 nortriterpenoid (henridilacton A), thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào KB, Hep-G2, Lu và MCF-7 với IC50 từ 18,6 đến 66,8 µg/mL.
  • Năm 2011, Phạm Thị Hồng Minh và cộng sự phân lập từ thân cây K. heteroclita 3 hợp chất lignan (heteroclitalignan D, axit dihydroguaiaretic, kadsuralignan B) và từ thân cây K. coccinea 3 triterpenoid (axit mangiferonic, axit nigranoic, axit lancifoic A).
  • Năm 2012, Bùi Văn Thanh và cộng sự bổ sung loài Kadsura induta A. C. Smith vào hệ thực vật Việt Nam.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có một số công bố bước đầu, nhiều bộ phận của các loài Kadsura và Schisandra ở Việt Nam (đặc biệt là thân cành và lá của K. heteroclita, K. induta, K. coccinea, S. perulata, S. sphenanthera) chưa được phân lập cặn chiết có hệ thống để tìm kiếm các hợp chất mới và đánh giá sàng lọc độc tính tế bào trên các dòng ung thư người OVCAR, HT-29 và A-549.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và con đường sinh tổng hợp

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh tổng hợp các hợp chất tự nhiên trong họ Ngũ vị:

  • Sinh tổng hợp Lignan: Các hợp chất lignan được sinh tổng hợp từ các dẫn xuất của axit cinnamic thông qua việc ghép hai đơn vị phenylpropanoid. Khung 2,3-dimethyl-1,4-diarylbutan lignan (IV) được hình thành đầu tiên, sau đó tiếp tục chuyển hóa đóng vòng tạo thành các khung dibenzocyclooctadien lignan (I), spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadien lignan (II), aryltetralin lignan (III) và tetrahydrofuran lignan (V).
  • Sinh tổng hợp Triterpenoid: Khung lanostan-triterpenoid được xem là tiền chất trung gian ban đầu để sinh tổng hợp nên các cycloartan-triterpenoid và các biến thể phân cắt mạch/chuyển vị phức tạp trong nhóm schinortriterpenoid.
Con đường sinh tổng hợp Lignan:
Dẫn xuất Axit Cinnamic (Phenylpropanoid)

Con đường sinh tổng hợp Triterpenoid:
Lanostan Triterpenoid

Quy trình thực nghiệm xử lý mẫu và phân lập

  • Xử lý mẫu thực vật: Mẫu thực vật thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 60 °C đến khối lượng không đổi và nghiền nhỏ.
  • Chiết xuất: Ngâm chiết 3 lần với methanol (hoặc ethanol) có hỗ trợ của thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết gộp lại được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50 °C để thu cặn tổng. Cặn tổng được phân tán vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, thu được các phần cặn tương ứng.
  • Kỹ thuật phân tách sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC) trên bản tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254S (Merck, độ dày 0,25 mm), phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun dung dịch vanilin - H2SO4 5% trong methanol gia nhiệt.
    • Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (0,25 mm; Merck).
    • Sắc ký cột pha thuận (CC) sử dụng silica gel 60 (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, 230 - 400 mesh, Merck).
    • Sắc ký cột pha đảo sử dụng YMC RP-18 (cỡ hạt 30 - 50 µm).
    • Sắc ký rây phân tử sử dụng Sephadex LH-20 (Merck).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Điểm nóng chảy: Đo trên máy Kofler micro-hotstage (Viện Hóa học, VAST).
  • Độ quay cực ([α]D): Đo trên máy phân cực kế JASCO DIP-370 (Đại học Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc).
  • Sắc ký khí (GC): Thực hiện trên máy Shimadzu GC-14B (Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, VAST).
  • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo dạng viên nén KBr trên máy FTIR-Impact-410 (Viện Hóa học, VAST).
  • Phổ khối lượng: ESI-MS đo trên hệ thống Agilent 1200 TRAP; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass Spectrophotometer (Viện Hóa học, VAST) và máy AGILENT 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS (Đại học Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz với chất chuẩn nội TMS (Viện Hóa học, VAST). Thực hiện các kỹ thuật 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) trong các dung môi CDCl3, CD3OD hoặc DMSO-d6.
  • Phương pháp phổ lưỡng sắc tròn điện tử (ECD) và nhiễu xạ tia X (X-ray) được áp dụng xác định cấu hình tuyệt đối.

Phương pháp thử hoạt tính sinh học

  • Dòng tế bào ung thư: Tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR), ung thư đại tràng (HT-29), ung thư phổi (A-549) do Ngân hàng tế bào Hàn Quốc (Korea Cell Line Bank, Seoul) cung cấp.
  • Điều kiện nuôi cấy: Môi trường RPMI-1640 bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và kháng sinh penicillin/streptomycin (100 U/mL và 100 µg/mL) ở 37 °C, 5% CO2.
  • Quy trình thử nghiệm MTT:
    • Tế bào nuôi cấy trên đĩa 96 giếng (mật độ 1,5 - 2,5 × 10^5 tế bào/mL) ủ qua đêm.
    • Ủ với mẫu thử ở các nồng độ 1; 10; 50; 100 µM trong 72 giờ. Chất đối chứng dương: Mitoxantrone.
    • Bổ sung thuốc thử MTT, ủ 4 giờ ở 37 °C; ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, hòa tan tinh thể formazan bằng 150 µL DMSO.
    • Đo độ hấp thụ quang học trên máy đọc ELISA ở bước sóng 540 nm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập.
    • Tính toán phần trăm ức chế và xác định giá trị IC50. Tiêu chuẩn đánh giá: Hợp chất có IC50 < 20 µM được xem là có hoạt tính gây độc tế bào.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu và Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về phân loại thực vật họ Schisandraceae, đặc điểm thực vật học của hai chi Kadsura và Schisandra, phân loại các khung cấu trúc hóa học của lignan, triterpenoid và các hợp chất khác, cùng con đường sinh tổng hợp và tác dụng dược lý theo y học cổ truyền và y học hiện đại.

Bảng tổng hợp đặc điểm các loài nghiên cứu trong hệ thực vật Việt Nam:

Tên khoa học Tên tiếng Việt Bộ phận nghiên cứu Địa điểm thu mẫu Thời gian thu
Kadsura heteroclita Na leo Thân cành Tam Đảo, Vĩnh Phúc 10/2010
Kadsura induta Ngũ vị nam Lá Sa Pa, Lào Cai 07/2012
Kadsura coccinea Na rừng Thân cành Tam Đảo, Vĩnh Phúc 10/2013
Schisandra perulata Ngũ vị vảy chồi Thân Sa Pa, Lào Cai 03/2012
Schisandra sphenanthera Ngũ vị tử nam Thân cành Đăk Glei, Kon Tum 03/2011

Bảng phân bố các nhóm khung lignan trong một số loài họ Schisandraceae (theo tổng quan):

Loài Dibenzocyclooctadien (I) Spirobenzofuranoid (II) Aryltetralin (III) Diarylbutan (IV) Tetrahydrofuran (V)
Schisandra chinensis 42 - - 3 -
Schisandra micrantha 3 - - - -
Kadsura coccinea 36 7 2 3 -
Kadsura oblongifolia 17 7 - - -

Chương 2: Phương pháp và thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết sơ đồ chiết tách và quy trình phân lập các hợp chất từ từng loài thực vật.

Quy trình phân lập từ thân cành cây Na leo (Kadsura heteroclita) làm đại diện:

  • Mẫu khô thân cành (3,5 kg) được chiết siêu âm với methanol/ethanol, thu hồi dung môi được cặn tổng. Chiết phân đoạn thu được cặn n-hexane (50,0 g) và cặn ethyl acetate (39,0 g).
  • Phân lập cặn n-hexane (50,0 g): Sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (tỷ lệ từ 40:1 đến 1:1) thu được 5 phân đoạn chính (H-H1 đến H-H5):
    • Phân đoạn H-H1 (10,1 g) qua cột silica gel (n-hexane/acetone 30:1), kết tinh trong n-hexane thu được β-sitosterol (KHH1; 1,5 g; điểm chảy 138-140 °C; EI-MS: [M]+ m/z 414).
    • Phân đoạn H-H2 (13,5 g) qua cột silica gel (n-hexane/EtOAc 15:1) thu 4 phân đoạn phụ H-H2A đến H-H2D; kết tinh lại H-H2C trong n-hexane/EtOAc (5:1) thu được axit secococcinic F (KHH2; 0,82 g; điểm chảy 177-178 °C).
    • Phân đoạn H-H5 (4,0 g) kết tinh trong acetone thu được axit kadsuric (KHH3; 0,7 g; điểm chảy 156-158 °C; LC-ESI/MS: [M+H]+ m/z 471,0; C30H46O4).
  • Phân lập cặn ethyl acetate (39,0 g): Sắc ký cột silica gel với hệ CHCl3/MeOH (100:1 đến 5:1) thu được 5 phân đoạn (H-E1 đến H-E5):
    • Phân đoạn H-E1 (9,2 g) kết tinh lại trong MeOH thu được β-sitosteryl 3-O-β-D-glucopyranoside (KHE5; 15,0 mg; điểm chảy 269-270 °C; EI-MS: [M-C6H12O6]+ m/z 396).
    • Phân đoạn H-E2 qua cột silica gel (CHCl3/acetone 3:1) và kết tinh lại H-E2B trong acetone thu được kadsuralignan B (KHE4; 8,8 mg; điểm chảy 140-142 °C; LC-ESI-MS: [M-CH3COOH]+ m/z 472, C27H32O11).
    • Phân đoạn H-E3 qua cột RP-18 (MeOH/H2O 4:1) thu được axit dihydroguaiaretic (KHE2; 8,0 mg; điểm chảy 87-89 °C; LC-ESI/MS: [M-H]- m/z 329, C20H26O4) và schizanrin F (KHE3; 6,0 mg).
    • Phân đoạn H-E5 qua cột Sephadex LH-20 và cột silica gel (CHCl3/MeOH 5:1) thu được hợp chất mới heteroclitalacton N (KHE1; 8,2 mg).

Quy trình chiết tách tương tự được thực hiện trên lá K. induta, thân cành K. coccinea, thân S. perulata và thân cành S. sphenanthera.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày việc xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập dựa trên phân tích phổ 1D/2D-NMR, MS, HR-ESI-MS, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY và đánh giá hoạt tính sinh học.

Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ 5 loài nghiên cứu:

Ký hiệu chất Tên hợp chất Loại khung cấu trúc Nguồn loài thực vật
KHE1 Heteroclitalacton N (hợp chất mới) Triterpenoid lactone Kadsura heteroclita (thân cành)
KHH2 Axit secococcinic F 3,4-Secolanostan triterpenoid Kadsura heteroclita (thân cành)
KHH3 Axit kadsuric Lanostan triterpenoid Kadsura heteroclita (thân cành)
KHE2 Axit dihydroguaiaretic Diarylbutan lignan Kadsura heteroclita (thân cành)
KHE3 Schizanrin F Dibenzocyclooctadien lignan Kadsura heteroclita (thân cành)
KHE4 Kadsuralignan B Spirobenzofuranoid lignan Kadsura heteroclita (thân cành)
KHH1 β-sitosterol Sterol Kadsura heteroclita (thân cành)
KHE5 β-sitosteryl 3-O-β-D-glucopyranoside Sterol glycoside Kadsura heteroclita (thân cành)
KIE1 Schizanrin O (hợp chất mới) Dibenzocyclooctadien lignan Kadsura induta (lá)
KIE2 rel-(8R,8'R)-dimetyl-(7S,7'R)-bis(3,4-metylendioxyphenyl) tetrahydrofuran Tetrahydrofuran lignan Kadsura induta (lá)
KIE4 Axit schizandronic Cycloartan triterpenoid Kadsura induta (lá)
KIE5 Axit lancifoic A Lanostan triterpenoid Kadsura induta (lá)
KIE6 Luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside Flavonoid glycoside Kadsura induta (lá)
KcE1 Axit secococcinic G 3,4-Secolanostan triterpenoid Kadsura coccinea (thân cành)
KcE3 Axit mangiferonic Cycloartan triterpenoid Kadsura coccinea (thân cành)
KcE4 Axit nigranoic 3,4-Secocycloartan triterpenoid Kadsura coccinea (thân cành)
KcE5 Axit 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-trien-3,26-dioic 3,4-Secolanostan triterpenoid Kadsura coccinea (thân cành)
KcE6 2,3-dihydroxypropyl 28-hydroxyoctacosanoate Dẫn xuất glycerol este Kadsura coccinea (thân cành)
SpE5 Axit meso-dihydroguaiaretic Diarylbutan lignan Schisandra perulata (thân)
SpE8 3,5,7,3’,4’-pentahydroxy-flavan Flavan Schisandra perulata (thân)
SpH3 2,3-dihydroxypropyl hexacosanoate Glycerol este Schisandra perulata (thân)
SsH5 Gomisin N Dibenzocyclooctadien lignan Schisandra sphenanthera (thân cành)
SsH1 1-Linoleoylglycerol Monoglyceride Schisandra sphenanthera (thân cành)

Xác định cấu trúc các chất mới:

  • Heteroclitalacton N (KHE1): Phân lập từ cặn ethyl acetate của thân cành K. heteroclita. Cấu trúc được làm sáng tỏ bằng tổ hợp phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY.
  • Schizanrin O (KIE1): Phân lập từ cặn ethyl acetate của lá K. induta. Cấu trúc khung dibenzocyclooctadien lignan cùng vị trí các nhóm thế được xác định qua phân tích chi tiết dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều và phổ khối phân giải cao.

Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro: Các hợp chất tinh khiết được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người OVCAR (buồng trứng), HT-29 (đại tràng) và A-549 (phổi) sử dụng chất đối chứng dương Mitoxantrone. Kết quả được tổng hợp chi tiết tại trang 116 của luận án, sàng lọc các hợp chất có giá trị IC50 < 20 µM đạt ngưỡng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Phân lập và xác định hai hợp chất mới: Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của 02 hợp chất mới từ nguồn thực vật Việt Nam:
    • Heteroclitalacton N (KHE1) từ thân cành loài Na leo (Kadsura heteroclita).
    • Schizanrin O (KIE1) từ lá loài Ngũ vị nam (Kadsura induta).
  2. Bổ sung dữ liệu hóa thực vật cho các loài chi Kadsura và Schisandra:
    • Phân lập và nhận dạng hàng loạt hợp chất thuộc các nhóm lignan (dibenzocyclooctadien, spirobenzofuranoid, diarylbutan, tetrahydrofuran), triterpenoid (lanostan, 3,4-secolanostan, cycloartan, 3,4-secocycloartan), flavonoid và các dẫn xuất este béo từ 5 loài thực vật thu hái tại các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam (Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Sa Pa - Lào Cai, Đăk Glei - Kon Tum).
    • Cung cấp đầy đủ hệ thống dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR (DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY), HR-ESI-MS và tính chất vật lý của các hợp chất phân lập.
  3. Đóng góp dữ liệu hoạt tính sinh học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm in vitro về hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất sạch trên ba dòng tế bào ung thư người (OVCAR, HT-29 và A-549).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu tập trung vào 5 loài thực vật thuộc hai chi Kadsura và Schisandra với các bộ phận thu hái cụ thể (thân cành hoặc lá) tại một số thời điểm và địa điểm nhất định; chưa khảo sát toàn bộ các bộ phận khác (như rễ, quả, vỏ thân) trong các mùa vụ khác nhau.
    • Hoạt tính sinh học dừng lại ở mức độ sàng lọc gây độc tế bào in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư người (OVCAR, HT-29, A-549) bằng phương pháp MTT, chưa đi sâu vào cơ chế phân tử hoặc thử nghiệm in vivo.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng khảo sát thành phần hóa học trên các bộ phận khác (rễ, quả) của các loài thuộc họ Ngũ vị tại Việt Nam.
    • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động gây độc tế bào ở mức độ phân tử đối với các hợp chất có hoạt tính tốt (IC50 < 20 µM).
    • Khảo sát thêm các hoạt tính sinh học tiềm năng khác đã được ghi nhận trong tổng quan tài liệu của họ này như hoạt tính kháng virus (HIV, HBV), bảo vệ gan, chống oxy hóa và kháng PAF.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược, Dược học và Thực vật học: Cung cấp phương pháp chiết tách phân đoạn, quy trình sắc ký cột (silica gel, RP-18, Sephadex LH-20) và phương pháp giải phổ NMR/MS xác định cấu trúc lignan và triterpenoid.
  • Các nhà nghiên cứu Dược liệu và Hóa thực vật: Tham khảo dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) của các hợp chất lignan, triterpenoid khung lanostan, cycloartan và các hợp chất mới Heteroclitalacton N, Schizanrin O.
  • Các đơn vị nghiên cứu và phát triển sản phẩm y dược: Cung cấp cơ sở khoa học về thành phần hóa học và dữ liệu hoạt tính sinh học phục vụ định hướng khai thác nguồn tài nguyên thực vật họ Ngũ vị tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu trên những đối tượng thực vật cụ thể nào và thu hái ở đâu?

Luận án nghiên cứu trên 5 loài thực vật thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae):

  • Thân cành loài Na leo (Kadsura heteroclita (Roxb.) Craib) thu tại huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc (10/2010).
  • Lá loài Ngũ vị nam (Kadsura induta A. C. Smith) thu tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai (07/2012).
  • Thân cành loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Smith) thu tại huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc (10/2013).
  • Thân loài Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata Gagnep.) thu tại huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai (03/2012).
  • Thân cành loài Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera Rehd.) thu tại huyện Đăk Glei, tỉnh Kon Tum (03/2011).

2. Hai hợp chất mới được phân lập và xác định cấu trúc trong luận án là gì?

Hai hợp chất mới bao gồm:

  1. Heteroclitalacton N (KHE1): Phân lập từ thân cành cây Na leo (Kadsura heteroclita).
  2. Schizanrin O (KIE1): Phân lập từ lá cây Ngũ vị nam (Kadsura induta).

3. Những kỹ thuật phân tích nào đã được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất?

Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng:

  • Đo điểm nóng chảy (Kofler micro-hotstage) và độ quay cực ([α]D trên JASCO DIP-370).
  • Phổ hồng ngoại (FTIR-Impact-410 dạng viên nén KBr).
  • Phổ khối lượng ESI-MS (Agilent 1200 TRAP) và phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS (FT-ICR-Mass Spectrophotometer và Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance 500 MHz) gồm 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY).
  • Phương pháp phổ lưỡng sắc tròn điện tử (ECD) và nhiễu xạ tia X (X-ray) để hỗ trợ xác định cấu hình lập thể.

4. Hoạt tính sinh học của các chất phân lập được đánh giá trên những dòng tế bào ung thư nào và bằng phương pháp gì?

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư người:

  • Dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR).
  • Dòng tế bào ung thư đại tràng (HT-29).
  • Dòng tế bào ung thư phổi (A-549). Thử nghiệm sử dụng phương pháp so màu MTT, ủ mẫu thử ở các nồng độ 1; 10; 50; 100 µM trong 72 giờ, chất đối chứng dương là Mitoxantrone, đo độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm để xác định giá trị IC50 (hợp chất có IC50 < 20 µM được xem là có hoạt tính).

Kết luận

Luận án đã thực hiện nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên 5 loài thực vật thuộc hai chi Kadsura và Schisandra thuộc họ Ngũ vị (Schisandraceae) thu hái tại Việt Nam. Bằng các phương pháp sắc ký hiện đại kết hợp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng phân giải cao, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất thuộc các nhóm lignan, triterpenoid, flavonoid và dẫn xuất lipid, trong đó có 02 hợp chất mới là Heteroclitalacton N và Schizanrin O. Kết quả thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư người OVCAR, HT-29 và A-549 đã cung cấp các dữ liệu hoạt tính sinh học quan trọng, góp phần làm sáng tỏ giá trị dược liệu và tiềm năng ứng dụng y dược học của các loài thực vật họ Ngũ vị tại Việt Nam.